Name: 植入异丙酮醇微型泵，以诱导小鼠心力衰竭 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 8 s
Description: 了解通过渗透泵慢性输注异丙肾上腺素建立小鼠晚期心力衰竭模型的方法。该技术操作简便，无需复杂外科经验，适用于心血管研究中的疾病机制探索与药物筛选。

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作者感谢 NIH K08 HL133491 提供的资金支持。

本方案遵循加州大学洛杉矶分校动物护理指南（ARC方案编号 #2010-075）。建议读者遵循各自机构经IACUC批准的方案，因为围手术期小鼠护理和镇痛管理可能因机构而异。
1. 异丙肾上腺素渗透泵的制备
注意：该操作已在100多个近交系小鼠中成功应用，适用于9周龄以上、体重18克以上的雌性小鼠，部分品系的雄性小鼠亦适用。本操作对小鼠体重无上限要求。请始终设置年龄匹配的对照组，因为目前尚不清楚处理年龄是否会影响异丙肾上腺素诱导的心力衰竭易感性。
<ol>
	<li>称重并记录每只小鼠的体重。</li>
	<li>根据每只小鼠的体重计算异丙肾上腺素的合适剂量和浓度（见表1；补充文件）。 
	注意：本实验所用的渗透泵（材料表）储液腔体积为100 µL，设计用于持续输注药物，最长可达28天。每只泵额外准备20 µL异丙肾上腺素溶液，以补偿灌注过程中填充管内的液体损耗。</li>
	<li>使用分析天平称取适量异丙肾上腺素（表1），溶于120 µL无菌0.9% NaCl溶液中。剧烈吹打或涡旋振荡1分钟，确保异丙肾上腺素完全溶解。 
	注意：渗透泵的制备应在生物安全柜中进行。操作时应佩戴外科手套。建议在整个渗透泵制备及手术植入过程中均采用无菌操作技术。</li>
	<li>称量并记录空渗透泵及其流量调节器的总重量，随后取下流量调节器。</li>
	<li>用1.0 mL注射器吸取120 µL异丙肾上腺素溶液，并连接渗透泵配套的27号钝头填充管。 
	注意：确保注射器和填充管内无气泡。</li>
	<li>将渗透泵保持直立状态，将填充管从泵顶部开口插入，直至管尖接近泵储液腔底部。</li>
	<li>缓慢推动注射器活塞，将异丙肾上腺素溶液注入泵内，直至液面升至泵开口处。</li>
	<li>小心拔出填充管，并擦去多余液体。</li>
	<li>重新插入流量调节器以封闭泵体，并擦去任何残留液体。</li>
	<li>通过重新称量渗透泵确认储液腔填充量是否超过90%。 
	注意：对照组泵的制备方法相同，仅以无菌0.9% NaCl溶液填充储液腔。</li>
</ol>
2. 手术器械的准备
<ol>
	<li>清洁所有手术器械，包括光纤O形圈照明显微镜光源、2把镊子、持针器、热珠灭菌器、玻璃珠和剪刀（材料表）。</li>
	<li>将手术器械在121°C下高压灭菌30分钟，以在手术前对器械进行灭菌。</li>
</ol>
3. 异丙肾上腺素渗透泵手术植入
<ol>
	<li>将小鼠置于诱导室中，使用含3%异氟烷、95% O₂和5% CO₂的混合气体进行麻醉诱导，随后通过鼻罩以2%异氟烷维持麻醉状态。</li>
	<li>皮下注射5 mg/kg卡洛芬至颈背部肩胛间区域，以提供镇痛作用。</li>
	<li>在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜脱水。</li>
	<li>通过监测呼吸频率、脚趾夹捏反射以及黏膜颜色来评估麻醉深度。</li>
	<li>将小鼠仰卧位放置于加热垫上，去除下腹部毛发，并使用聚维酮碘或氯己定对皮肤进行消毒。 
	注意：为最大限度降低术后感染风险，应确保手术区域无毛发残留。</li>
	<li>使用手术剪在腹中线处剪开长约1 cm的皮肤切口，再用钝头剪小心分离皮肤与下方腹膜壁。 
	注意：优先选择腹腔内给药方式，以便容纳泵体尺寸。</li>
	<li>用镊子将腹膜壁与下方肠道分离，使用精细手术剪在腹膜壁上剪出一个约0.8 cm的开口。</li>
	<li>将渗透压泵以流量调节端先行的方式插入腹膜腔内。</li>
	<li>使用5.0可吸收缝线间断缝合腹膜壁上的切口，再用6.0不可吸收缝线间断缝合皮肤切口。</li>
	<li>将小鼠置于专用孵育箱中，保持其温暖干燥以促进恢复。在恢复初期每30分钟监测一次小鼠状态，持续两小时，观察其是否恢复正常的呼吸和活动能力。</li>
	<li>待小鼠完全从麻醉中恢复后，将其返回常规饲养环境。术后每日观察动物是否出现并发症，持续3天，之后每2至3天观察一次，直至实验结束。 
	注意：应持续监测动物是否存在术后疼痛或感染迹象、体重下降、活动减少、异常姿势、缺乏理毛行为，以及对切口区域过度舔舐或啃咬等情况。</li>
	<li>皮下注射5 mg/kg卡洛芬，每24小时一次，持续最多48小时，之后根据需要给予。</li>
	<li>在饮水中添加0.25 mg/mL阿莫西林，连续使用5天，以预防手术部位感染。</li>
	<li>在术后7至10天拆除不可吸收缝线。</li>
</ol>
4. 麻醉状态下的超声心动图评估
注意：可重复进行超声心动图评估，以监测数周内心脏的连续性重构变化。我们在3周内每周进行一次超声心动图测量。
<ol>
	<li>在诱导室中使用1.25%至1.5%的异氟烷诱导麻醉。待小鼠适当镇静后，用胶带将其固定在超声心动图平台上，并通过鼻罩持续给予麻醉气体。</li>
	<li>将异氟烷浓度降低至1%的维持剂量，以尽量减少过度镇静带来的负性变时和变力效应。在整个实验过程中注意监测呼吸频率和心率，并根据需要调整异氟烷剂量。</li>
	<li>使用脱毛膏去除胸部毛发，并擦拭清除残留毛发。</li>
	<li>在胸部涂抹超声耦合剂，并放置超声探头以获取心脏图像。</li>
	<li>在B模式下，采用胸骨旁长轴切面成像左心室（LV）。调整超声心动图平台，使主动脉瓣与左心室心尖位于超声束的成像平面内。</li>
	<li>倾斜超声心动图平台，使左心室长轴与超声束垂直，并将左心室最大直径置于图像中心。</li>
	<li>将超声探头旋转90度，获取左心室短轴切面图像。</li>
	<li>在M模式下测量左心室壁厚度和内部径线。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，监测其自主呼吸恢复及自发身体活动情况。</li>
</ol>

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<li>Klingman, G. I., McKay, G., Ward, A., Morse, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+isoproterenol+treatment+of+mice%3A+effects+on+catecholamines+and+rectal+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Chronic isoproterenol treatment of mice: effects on catecholamines and rectal temperature.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 62 (5), 798-801 (1973).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们已将该方法应用于100多个近交系小鼠品系，以评估慢性β-肾上腺素能刺激所致的心脏表型2,13。已知不同小鼠品系对异丙肾上腺素的易感性存在显著差异，可根据需要针对特定品系进行优化16。这种差异可能源于小鼠品系间β-肾上腺素能受体功能的不同17、自主神经系统活性的品系依赖性差异16、β-肾上腺素能受体（beta-AR）密度和/或偶联效率的差异17，以及其他遗传差异。根据体内连续超声心动图检测，以及有无ISO处理下的离体心脏组织病理学和基因表达分析，慢性异丙肾上腺素处理诱导了从细胞过程、细胞外基质到炎症反应等多个层面的显著变化2,13。以下因素可能与该心力衰竭模型的应用相关。
<p class="jove_co...

射血分数降低的心力衰竭（HFrEF）常伴随交感神经系统为维持心血管稳态而产生的明确可识别的代偿性反应1。长期激活可导致血流动力学应激以及对心脏和循环系统的有害影响。这些机制已成为现代心力衰竭药物治疗的基石，并在心力衰竭进展及神经激素系统治疗性拮抗中发挥重要作用1。
目前有多种小鼠模型可用于心力衰竭的基础研究。基因模型在探索分子治疗策略和研究信号通路方面具有优势。然而，这些模型可能与常见类型的心力衰竭并不相关。其他常用模型包括左前降支（LAD）冠状动脉结扎、经主动脉缩窄（TAC）和异丙肾上腺素（ISO）诱导模型，每种模型分别模拟不同的病理病因2,3,4,5,6。LAD冠状动脉结扎可诱导前壁心肌梗死，从而建立特异性的缺血性心肌病模型。TAC通过诱发急性压力超负荷，建立高血压性心力衰竭模型。尽管可通过测量压力梯度对心肌肥厚程度进行分层，但其高血压的急性发作缺乏直接的临床相关性4。LAD和TAC模型均需要较高的外科手术操作技术。急性ISO心力衰竭模型可模拟应激性心肌病（又称Takotsubo综合征），其特征为儿茶酚胺水平显著升高，并出现类似急性心肌梗死的左心室功能异常7,8。相比之下，慢性ISO心力衰竭模型则表现出晚期心力衰竭的典型症状，并伴有持续升高的儿茶酚胺水平1。慢性ISO模型的优点在于，它能够提供持续的肾上腺素能刺激，模拟晚期心力衰竭状态，且建模相对简便。研究者应根据所关注的特定病理过程，选择最合适的动物模型。
该方法的总体目标是通过植入微型泵持续释放异丙肾上腺素（ISO），在小鼠中诱导心力衰竭，以模拟心力衰竭患者体内存在的慢性交感神经激活状态1。该方法操作简便且可重复。尽管不同小鼠品系之间存在明显差异，但在3至4周内以30 mg/kg/天的剂量给予ISO，足以在大多数小鼠中诱导心脏重构。具体而言，ISO在第1周引起促心肌肥厚的代偿性阶段，随后在第2周和第3周出现心壁变薄、心室扩张以及收缩功能下降2。ISO模型构建是否成功可通过体内连续超声心动图评估，观察是否存在心肌肥厚、心室扩张及心室功能障碍；也可通过体外对收获的心脏组织进行组织学和分子学分析，检测心肌内脂质积聚、纤维化、内质网应激、细胞凋亡以及基因表达变化来评估9,10,11,12。

<table><tbody><tr><td>带流量调节器的微型渗透泵系统</td><td>Alzet</td><td>Model 1004</td><td>包含填充管、流量调节器和泵体</td></tr><tr><td>(-)-异丙肾上腺素盐酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16504-1G</td><td>(-)-异丙肾上腺素盐酸盐为粉末状，需在 -20&amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>1 ml 无菌注射器</td><td>VWR</td><td>BD309602</td><td></td></tr><tr><td>30 W LED 光纤O形圈显微镜照明器</td><td>AmScope</td><td>SKU: LED-30WR</td><td></td></tr><tr><td>5-0 涂层VICRYL（聚乳酸-乙醇酸共聚物910）缝线</td><td>Ethicon</td><td>J303H</td><td>5-0，可吸收</td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锐利型</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠</td><td>FST</td><td>18000-46</td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>FST</td><td>18000-50</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊</td><td>WPI</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>Look Sharpoint 6-0，18&quot; 黑色尼龙单丝缝线</td><td>LOOK</td><td>AA-2176</td><td>6-0，不可吸收</td></tr><tr><td>持针器</td><td>WPI</td><td>15926</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水，0.9% NaCl</td><td>Fisher</td><td>89167-772</td><td></td></tr></tbody></table>

植入异丙肾上腺素微型泵以诱导小鼠心力衰竭

Implantation of an Isoproterenol Mini-Pump to Induce Heart Failure in Mice

异丙肾上腺素（ISO）是一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂，广泛用于在小鼠中诱导心脏损伤。急性模型可模拟应激性心肌病，而通过渗透泵给药的慢性模型则可模拟人类的晚期心力衰竭。本方案旨在通过植入式微型泵建立小鼠慢性ISO诱导的心力衰竭模型。该方法已成功应用于100多个近交系小鼠品系。文中详细描述了微型泵植入手术技术，适用于所有希望建立小鼠心力衰竭模型的研究人员。此外，还提供了各品系小鼠基于超声心动图参数的每周心脏重构变化以及预期的模型建立时间。总之，该方法简单且可重复。通过植入式微型泵持续给予ISO 3至4周，足以诱导心脏重构。最后，可通过连续超声心动图检测心肌肥厚、心室扩张和功能障碍，从而在活体动物中评估ISO模型建立的成功与否。

在我们先前发表的研究中，通过渗透泵在21天内向105个杂交小鼠多样性面板（HMDP）品系施用了30 mg/kg/d的异丙肾上腺素（ISO）剂量2,13。我们通过超声心动图评估了结果，分别在ISO处理前（基线）、第1周、第2周和第3周进行检测（图1）。与之前一项研究异丙肾上腺素在23个小鼠品系中影响的研究类似14，我们观察到不同品系间超声心动图参数存在显著差异。基于超声心动图参数的每周变化总结以及预期建模时间如（图2 和 图3）所示2,15。尽管在不同小鼠品系之间存在变异，但总体而言，舒张末期室间隔厚度（IVSd）和缩短分数（FS）在第一周增加，但在后续时间点下降；左心室舒张末期内径...

通过植入渗透泵长期给予异丙肾上腺素已被广泛用于模拟小鼠的晚期心力衰竭。本文中，我们详细描述了微型泵植入手术的方法，以实现连续3周的异丙肾上腺素给药，以及通过超声心动图评估模型成功建立的方法。

异丙肾上腺素（ISO）是一种非选择性β-肾上腺素能受体激动剂，广泛用于诱导小鼠心脏损伤。急性模型可模拟……

通过渗透泵长期给予异丙肾上腺素已被广泛用于在小鼠中模拟晚期心力衰竭的病理变化。该方法操作简便，且对手术技术的要求低于其他模型（如左前降支结扎术和主动脉缩窄术）。本实验操作将由王一斌实验室的研究科学家Vincent Ren博士进行演示。在称量并记录每只小鼠的体重后，计算每只动物所需的异丙肾上腺素剂量和浓度，将异丙肾上腺素溶解于120 µL无菌0.9%氯化钠溶液中。充分混匀1分钟，确保异丙肾上腺素完全溶解，并分别称量并记录每只小鼠对应的空渗透泵（包括带和不带流量调节器）的重量。连接渗透泵配套的27号钝头填充管，为每只小鼠准备一支1 mL注射器，吸取120 µL异丙肾上腺素溶液。将泵体保持直立，将填充管从顶部的泵开口插入，直至填充管尖端接近泵储液腔底部，缓慢推动注射器活塞，使异丙肾上腺素溶液填充至泵开口处。泵体加载完成后，小心取出填充管，并擦去多余的溶液。重新插入流量调节器以封闭泵体，并擦去任何残留的多余溶液。然后重新称量泵体，确认储液库容积的90%以上已被填充。将小鼠仰卧位放置于加热垫上，并排出下腹部的空气。进行外科手术植入渗透压泵时，需确认麻醉小鼠对脚趾夹捏无反应，并在动物眼睛上涂抹眼膏。用适当的消毒剂清洁暴露的皮肤，并做一条一厘米长的正中皮肤切口。使用一对钝头剪刀小心地将皮肤与下方的腹膜壁分离，再用镊子将腹膜壁从下方的肠管上拉开。用精细剪刀在腹膜壁上剪一个0.8厘米的孔，将渗透泵的流速调节端先插入腹膜腔内。将泵放置到位后，使用5-0可吸收缝线以间断缝合方式关闭腹膜壁上的切口，并使用6-0不可吸收缝线缝合皮肤。随后将小鼠置于专用孵育箱中进行监测，直至其完全恢复卧姿后，再将其放回原有饲养笼中。此处展示了基于所选超声心动图参数的每周变化摘要以及模型建立的预期时间。尽管不同小鼠品系之间存在差异，但总体而言，舒张末期室间隔壁厚度和缩短分数在第一周内增加，随后时间点则下降。左心室舒张末期内径和左心室质量在三周内持续增加。此外，在异丙肾上腺素处理下，小鼠心脏表现出明显增大的左心室腔室尺寸，以及相较于生理盐水处理对照组更显著的纤维化程度。在存活手术过程中，维持无菌的手术环境至关重要，以尽量减少术后感染和并发症。可通过连续进行体内超声心动图检查评估心肌肥厚、扩张及功能障碍，以及通过体外对获取的心脏组织进行组织学和分子学评估，来判断模型构建是否成功。我们已将该方法应用于100多个近交系小鼠品系，以评估慢性β-肾上腺素能刺激引起的心脏重构特征。结果已发表且易于获取。

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植入异丙酮醇微型泵，以诱导小鼠心力衰竭

本实验方案的目的是逐步描述小鼠微创横主动脉缩窄（TAC）技术。通过省去常规标准手术中必需的插管和通气步骤，微创TAC简化了手术操作，并减轻了对动物造成的应激负担。...

小鼠经皮微创主动脉横缩术诱导左心室肥厚的技术

本文提供了一种研究右心室衰竭机制的有效方法。通过使用自制的手术器械，建立了一种更为简便且高效的肺动脉缩窄方法。此外，还提供了利用超声心动图和导管插入术评估该方法质量的技术。...

通过肺动脉缩窄诱导小鼠右心室衰竭及右心室功能评估

本方案旨在将三维生物打印贴片移植到模拟心力衰竭的小鼠梗死心外膜上。内容包括麻醉、开胸手术、左前降支冠状动脉永久性结扎以及将生物打印贴片应用于心脏梗死区域的详细操作步骤。...

在小鼠心肌梗死模型中移植三维生物打印补片

已开发并应用于成年小鼠心脏的一种优化的组织透明化方法。该方法旨在清除致密且具有自发荧光的心肌组织，同时保留由遗传报告基因策略标记的成纤维细胞的荧光信号。...

基于CLARITY优化的组织透明化技术用于小鼠健康与损伤心脏中三维成纤维细胞结构的研究

本方案详细描述了通过降主动脉缩窄建立射血分数保留型心力衰竭小型猪模型的逐步操作流程。同时介绍了该疾病模型的心脏形态学、组织学及心功能评估方法。...

一种西藏小型猪射血分数保留型心力衰竭的手术模型

在小鼠心肌梗死部位周围进行超声引导下的细胞递送是一种安全、有效且便捷的细胞移植方法。...

超声引导下诱导多能干细胞来源的心肌细胞在心肌梗死小鼠中的移植

本方案描述了在超声心动图引导下，通过直接心肌内注射病毒在大鼠和小鼠心脏中实现外源基因表达的方法。同时，本文还介绍了通过程序性电刺激离体、Langendorff灌注心脏来评估心脏对心室心律失常易感性的方法。...

啮齿类动物心脏中的病毒转基因表达及心脏心律失常风险评估

本方案描述了在猪模型中给予心脏活性治疗药物的三种方法。雌性长白猪通过以下任一途径接受治疗：（1）开胸经心外膜注射，（2）导管介导的经心内膜注射，或（3）静脉输注 通过...

在猪心肌梗死模型中递送心脏活性治疗药物

本方案描述了一种经过改良和简化的微创横主动脉缩窄（TAC）技术，该技术使用自制的牵开器。该手术无需呼吸机或显微镜即可完成，可诱导压力超负荷，最终导致心肌肥厚或心力衰竭。...

小鼠横位主动脉缩窄术的一种改良技术

本方案描述了通过经食管起搏获取压力-容积关系的方法，该方法在评估心力衰竭小鼠模型舒张功能方面具有重要价值 。...

一种用于评估小鼠心力衰竭模型中心率依赖性舒张功能的起搏控制方法

本方案介绍了一种复制由高脂血症诱导的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）小鼠模型的详细方法。该设计结合使用腺相关病毒9-心肌肌钙蛋白T-低密度脂蛋白受体（AAV9-cTnT-LDLR）和泊洛沙姆-407（P-407）。...

一种由高脂血症诱导的射血分数保留型心力衰竭的小鼠模型

了解通过渗透泵慢性输注异丙肾上腺素建立小鼠晚期心力衰竭模型的方法。该技术操作简便，无需复杂外科经验，适用于心血管研究中的疾病机制探索与药物筛选。

植入异丙肾上腺素微型泵以诱导小鼠心力衰竭

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