Name: 用于研究拉帕霉素/mTOR相互作用的半定量药物亲和反应目标稳定性 （DARTS） 测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: 学习使用DARTS方法监测蛋白质稳定性变化并估算蛋白质-配体相互作用亲和力，以mTOR-雷帕霉素相互作用为案例。该技术有助于验证已知小分子蛋白质相互作用并发现天然产物的潜在蛋白质靶点。

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本工作部分由美国国立卫生研究院研究基金 R01NS103931、R01AR062207、R01AR061484 以及美国国防部研究基金 W81XWH-16-1-0482 资助。

1. 收集并裂解细胞
<ol>
	<li>使用含10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养293T细胞。在37 °C、5% CO2条件下孵育培养物。 
	注意：细胞的生长状态可能影响后续实验的稳定性。</li>
	<li>将细胞扩增至培养皿中细胞融合度达到80‒90%。</li>
	<li>将345 μL细胞裂解试剂（参见材料表）与25 μL 20x蛋白酶抑制剂混合液、25 μL 1 M氟化钠、50 μL 100 mM β-甘油磷酸钠、50 μL 50 mM焦磷酸钠以及5 μL 200 mM原钒酸钠混合。将裂解缓冲液置于冰上保持低温。 
	注意：只要不引起蛋白变性，DARTS实验中可使用含不同去垢剂（如Triton X-100或NP-40）的其他裂解缓冲液。通过向细胞裂解物中添加0.4% Triton X-100或0.4% NP-40，可提取膜蛋白或核蛋白。</li>
	<li>用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。</li>
	<li>使用细胞刮刀将细胞收集至适量的细胞裂解缓冲液中，并将正在裂解的细胞转移至1.5 mL离心管中。 
	注意：每个DARTS实验所需的细胞数量取决于不同细胞系中可提取的蛋白量。通常，裂解物中使用的蛋白浓度范围为4‒6 μg/μL。一个直径10 cm、融合度为85‒90%的293T细胞培养皿，用300 μL裂解缓冲液裂解后，通常可获得蛋白浓度约为5 μg/μL的裂解物。</li>
	<li>充分混匀裂解缓冲液与裂解中的细胞，将离心管置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以18,000 × g离心10分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并保持冰上低温。</li>
	<li>进行BCA法测定，以估算裂解物的蛋白浓度。</li>
</ol>
2. 用小分子孵育蛋白质裂解液
<ol>
	<li>将99 μL裂解液分装至两个1.5 mL离心管中。</li>
	<li>配制10 mM的小分子起始储备液浓度。进行DARTS实验时，可从小分子较高浓度开始（5‒10倍EC50值），以确保最佳结合效果。
	<ol>
		<li>向每份裂解液中加入1 μL小分子可溶的溶剂或1 µL小分子储备液。室温下轻轻振荡孵育细胞裂解液与溶液30‒60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上，用1x TNC缓冲液对新解冻的蛋白酶K溶液进行系列稀释（1:200、1:400、1:800和1:1600）（配制1 mL 10x TNC缓冲液：将300 μL超纯水与100 μL 5 M氯化钠、100 μL 1 M氯化钙及500 μL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）混合）。</li>
	<li>考察较宽范围的蛋白酶K:蛋白比例（例如，从1:100至1:2000），以确保能够观察到蛋白酶K对靶蛋白的逐步作用效果。 
	注：蛋白酶K浓度计算方法（示例）：蛋白浓度为5 μg/μL × 20 μL样品 = 100 μg蛋白。当蛋白酶K:蛋白比例为1:100时，需加入0.5 μg/μL（100 μg ÷ 100 ÷ 2 μL）的蛋白酶K溶液。本实验可能需要重复多次，以获得合适的蛋白酶K:蛋白比例范围。</li>
</ol>
3. 进行蛋白酶解
注意：蛋白质水解步骤在室温下进行，除非另有说明
<ol>
	<li>加入小分子孵育后，将每份等分试样分成20 μL的样品。</li>
	<li>在特定时间间隔（每30秒）向每个样品中加入2 μL不同浓度的蛋白酶K溶液。使用等体积的1x TNC缓冲液建立未消化的对照样品。</li>
	<li>5‒20分钟后，每隔30秒加入2 μL冷的20x蛋白酶抑制剂混合液以终止消化反应。充分混匀后，将样品置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>用适当体积的5x SDS-PAGE上样缓冲液稀释样品，并在95 °C下煮沸5分钟。</li>
	<li>继续进行实验的下一步，或将蛋白质样品储存于−80 °C。</li>
</ol>
4. 定量与分析
<ol>
	<li>DARTS 实验完成后，按照先前发表的方案进行考马斯亮蓝染色22。</li>
	<li>脱色后，染色的蛋白质条带应非常清晰。倒掉使用的脱色液，加入新鲜的1%乙酸溶液覆盖凝胶。将凝胶置于光下观察小分子存在组（样品组）与不存在组（对照组）之间有显著差异的条带。</li>
	<li>使用无菌工具从凝胶中切下两个对应的条带，并立即进行 LC-MS/MS 分析。 
	注意：LC-MS/MS 应尽快完成，因为凝胶中的蛋白质会持续降解。</li>
	<li>对条带进行消化，提取肽段并进行 LC-MS/MS 分析23。
	<ol>
		<li>分析 LC-MS/MS 数据时，首先鉴定单个条带中的所有蛋白质；其次，使用肽谱匹配数（PSM）来表示每种蛋白质的丰度。 
		注意：PSM 提供了该蛋白质被鉴定出的肽段序列总数，包括重复鉴定的序列。通常，某条肽段被鉴定/测序的频率可粗略估计其在样品中对应蛋白质的丰度。在样品组中相对于对照组富集的蛋白质即为感兴趣的靶蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取所选蛋白质的一抗，通过 Western blot 验证小分子是否可直接结合潜在的靶蛋白24。
	<ol>
		<li>将等量的蛋白质样品与合适的分子量标记物一起加入8% SDS-PAGE 凝胶的加样孔中。先以80 V电压电泳30分钟，然后将电压调至120 V，继续运行1‒2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用图像处理与分析软件（参见材料表）对不同靶蛋白条带进行定量。</li>
	<li>分析数据并绘制曲线。
	<ol>
		<li>靶蛋白蛋白水解曲线的确定
		<ol>
			<li>进行蛋白水解时，改变嗜热菌蛋白酶（pronase）与蛋白质的比例。通过将未消化条带对应的条带强度值归一化为100%，对图像分析所得数据进行归一化处理。</li>
			<li>使用统计分析与绘图软件对归一化后的相对条带强度和 pronase:protein 比例数据进行非线性回归分析并绘制曲线。</li>
			<li>首先打开软件，选择表格和图形类型为 XY，并允许在并列的子列中输入3个重复值。然后在 x 和 y 下方的区域输入相应数据。在 x 下输入数字 0、1、2、3、4、5（作为对应 pronase:protein 比例的占位符）。</li>
			<li>在 y 列中输入相对条带强度的归一化数据。执行“非线性回归”分析，采用“Log (激动剂) 与反应—可变斜率（四参数）”方程，实施“剂量-反应-刺激”模型。</li>
			<li>将曲线中 X 轴的标注转换为对应的 pronase:protein 比例。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>靶蛋白剂量依赖性曲线的确定 
		注意：在进行剂量依赖性分析时，各样品中小分子的摩尔浓度不同。稳定的 pronase:protein 比例应根据蛋白水解数据分析结果确定。在蛋白水解曲线中显示出靶蛋白条带强度最大差异的 pronase:protein 比例，应作为剂量依赖性实验所用的比例。
		<ol>
			<li>使用图像分析软件对不同靶蛋白条带进行定量。在生成剂量依赖性曲线时，将图像分析数据中对应于消化程度最低条带的强度值归一化为100%。</li>
			<li>对归一化后的数据使用统计分析与绘图软件进行非线性回归分析。首先打开软件，选择表格和图形类型为 XY，并在并列的子列中输入3个重复值。</li>
			<li>然后在 x 和 y 下方的区域输入相应数据。‘x’变量输入小分子的不同浓度；‘y’变量输入对应的相对条带强度归一化数据。</li>
			<li>将 x 值转换为 X = Log(X)。最后，进行非线性回归分析，采用“Log (激动剂) 与反应—可变斜率（四参数）”方程，实施剂量-反应刺激模型。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Van Duyne, G. D., Standaert, R. F., Karplus, P. A., Schreiber, S. L., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structures+of+the+human+immunophilin+FKBP-12+complexes+with+FK506+and+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (1), 105-124 (1993).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

DARTS 通过利用蛋白质结合对降解的保护作用来鉴定小分子靶标。DARTS 无需对小分子进行任何化学修饰或固定化26，从而可直接使用小分子确定其结合的靶蛋白。经典 DARTS 方法的标准评估手段包括凝胶染色、质谱分析和蛋白质印迹12,13。传统方法虽提及这些数据可进行定量分析，但并未提供具体实例。本文中，我们采用细胞热迁移分析（CETSA）的原理对数据进行半定量分析，获得类似于 CESTA 提供的参数（Tm 和 EC50），从而提升 DARTS 分析的应用价值8。配体-靶标相互作用可依据蛋白酶:蛋白比例作图，以显示蛋白水解曲线的明显偏移。通过使用不同的蛋白酶:蛋白比例进行蛋白水解，有助于确定下游实验应采用的蛋白酶浓度。进一步地，在优化的蛋白酶浓度下，于不同浓度的小分子存在条件下进行蛋白水解，可间接反映小分子与其靶蛋白之间的亲和力。此外，构建剂量依赖性曲线可估算配体浓度依赖性地对靶蛋白产生的效应。将剂量依赖性分析能力纳入 DAR...

鉴定小分子靶标蛋白对于理解其作用机制及开发潜在治疗药物至关重要1,2,3。亲和层析作为鉴定小分子靶标蛋白的经典方法，已取得良好效果4,5。然而，该方法存在局限性，因为对小分子进行化学修饰常导致其结合特异性或亲和力降低或改变。为克服这些局限，近年来已发展并应用了多种新策略，可在不修饰小分子的前提下鉴定其靶标蛋白。这些针对无标记小分子的直接靶标鉴定方法包括药物亲和反应靶标稳定性分析（DARTS）6、基于氧化速率的蛋白质稳定性分析（SPROX）7、细胞热迁移分析（CETSA）8,9以及热蛋白质组分析（TPP）10。这些方法具有显著优势，因其使用天然、未修饰的小分子，并仅依赖于直接结合相互作用来发现靶标蛋白11。
在这些新方法中，DARTS 是一种相对简单的方法，大多数实验室均可轻松采用12,13。DARTS 基于以下原理：与未结合配体的蛋白质相比，配体结合态的蛋白质对酶降解的敏感性会发生改变。通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）分析 SDS-PAGE 凝胶中条带的变化，即可鉴定新的靶标蛋白。该方法已成功用于鉴定天然产物和药物此前未知的作用靶点14,15,16,17,18,19。此外，该方法也可有效用于筛选或验证化合物与特定蛋白质的结合20,21。在本研究中，我们对该实验进行了改进，通过监测小分子存在下蛋白质稳定性的变化，进而鉴定蛋白质-配体结合亲和力。我们以 mTOR 与雷帕霉素的相互作用为例，展示本方法的应用。

<table><tbody><tr><td>100X 蛋白酶抑制剂混合液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>用超纯水稀释至 20X</td></tr><tr><td>293T 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BCA 蛋白定量检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Thermo Fisher</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250 染色液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software</td><td>Version 6.0</td><td>统计分析与绘图软件</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td>Version 1.52</td><td>图像处理与分析软件</td></tr><tr><td>M-PER 细胞裂解试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Corning</td><td>R21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶（Pronase）</td><td>Roche</td><td>PRON-RO</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>调节至 pH 8.0</td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究雷帕霉素/mtor 相互作用的半定量药物亲和反应靶标稳定性（darts）实验

A Semi-Quantitative Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) assay for studying Rapamycin/mTOR interaction

药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）是一种用于检测新型小分子蛋白靶标的稳健方法。该方法可用于验证已知的小分子-蛋白相互作用，并发现天然产物的潜在蛋白靶标。与其他方法相比，DARTS采用天然、未修饰的小分子，操作简单便捷。在本研究中，我们通过监测蛋白稳定性变化并估算蛋白-配体相互作用的亲和力，进一步增强了DARTS实验的数据分析能力。蛋白-配体相互作用可绘制成两条曲线：蛋白水解曲线和剂量依赖性曲线。我们以mTOR与雷帕霉素的相互作用为例，建立了本实验方案。从蛋白水解曲线可见，雷帕霉素的存在抑制了嗜热菌蛋白酶（pronase）对mTOR的水解作用。通过剂量依赖性曲线，我们能够估算雷帕霉素与mTOR之间的结合亲和力。该方法有望成为一种强大且简便的工具，用于准确鉴定新型靶标蛋白以及优化药物与靶标的结合效果。

实验流程图如图1所示。考马斯亮蓝染色结果见图2。与小分子孵育可提供对蛋白酶解的保护作用。发现三个在雷帕霉素处理组中相较于溶剂对照组显示出保护效应的条带。蛋白酶解曲线实验的预期结果如图3所示。作为原理验证，我们研究了已被广泛表征的蛋白mTOR，它是药物雷帕霉素的作用靶点25。Western blot结果显示，在低浓度pronase与蛋白比例下可检测到mTOR蛋白的存在，随着比例增加，mTOR蛋白逐渐减少并消失（图3A）。pronase对mTOR的蛋白酶解明显受到雷帕霉素存在的抑制，加入雷帕霉素后蛋白酶解曲线出现显著偏移（图3B）。为研究药物浓度的影响，我们在保持pronase与蛋白比例恒定的条件下，改变雷帕霉素的浓度。当配体浓度接...

在本研究中，我们通过监测蛋白质稳定性的变化并估算蛋白质-配体相互作用的亲和力，增强了DARTS实验的数据分析能力。这些相互作用可绘制成两条曲线：一条为蛋白水解曲线，另一条为剂量依赖曲线。我们以mTOR与雷帕霉素的相互作用作为示例案例。

一种用于研究雷帕霉素/mTOR 相互作用的半定量药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）实验

药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）是一种用于检测新型小分子蛋白质靶标的可靠方法。该方法可用于验证已知的……

药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）是一种用于检测新型小分子蛋白靶点的可靠方法。该方法可用于验证已知的小分子-蛋白相互作用，并发现天然产物的潜在蛋白靶点。在本研究中，我们通过监测蛋白稳定性变化并估算蛋白-配体相互作用的亲和力，进一步增强了DARTS实验的数据分析能力。蛋白质-配体相互作用可绘制为两条曲线：蛋白水解曲线和剂量依赖性曲线。我们以mTOR与雷帕霉素的相互作用为例，建立本实验方案。使用含10%胎牛血清、2毫摩尔谷氨酰胺和1%抗生素的DMEM培养293T细胞。将培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。当细胞培养达到80%至90%融合度时，用预冷的PBS洗涤细胞两次。使用细胞刮刀将细胞收集到适量的预冷细胞裂解缓冲液中，并将正在裂解的细胞转移至1.5毫升离心管中。颠倒混匀裂解缓冲液与裂解的细胞，置于冰上孵育10分钟。在4°C条件下，以18,000 ×g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并保持在冰上冷却。采用BCA法测定裂解液的蛋白浓度，并根据蛋白浓度计算蛋白酶的稀释比例。首先，将裂解液分别转移至两支1.5毫升离心管中，每管99微升。向每份裂解液中加入1微升小分子储备溶液，随后将两支离心管在室温下振荡孵育30至60分钟。在冰上，用1x TNC对新鲜解冻的蛋白酶溶液进行系列稀释。小分子孵育后，将每份等分试样分装到五个管中，每管20微升。为确保消化时间一致，每隔30秒按特定时间间隔向各样品中分别加入2微升配制好的蛋白酶溶液。对于一个对照组，加入 2 µL 的 TNC 缓冲液。在 5 到 20 分钟后，以 30 秒为间隔，向六个试管中分别加入 2 µL 冷的 20× 蛋白酶抑制剂混合液以终止消化反应。充分混匀后，冰上孵育 10 分钟。将每个样品与六微升5x SDS-PAGE上样缓冲液混合并稀释，然后在70摄氏度水浴中煮沸10分钟。接下来进行Western blot实验：将等量的蛋白质样品与合适的分子量标记物一起加入8% SDS-PAGE凝胶的加样孔中。以80伏电压电泳30分钟，随后将电压调至120伏，继续电泳一至两小时。验证小分子能否直接结合潜在靶标蛋白。在本方案中，通过与小分子孵育确认了对蛋白酶解的保护作用。与对照溶剂相比，雷帕霉素孵育后发现三条条带受到保护。Western blot 结果显示，在低木瓜蛋白酶与蛋白比例下可检测到 mTOR 蛋白的存在，随着比例的增加，mTOR 蛋白逐渐减少并最终消失。mTOR 蛋白被木瓜蛋白酶降解的过程明显受到雷帕霉素存在的抑制，加入雷帕霉素后，蛋白水解曲线出现显著偏移。雷帕霉素以剂量依赖方式提高了 mTOR 蛋白水平，提示雷帕霉素处理增强了 mTOR 蛋白的稳定性。对目标蛋白条带强度的定量分析表明，mTOR 是雷帕霉素的作用靶蛋白。为了获得最佳的逐步效应，本实验可能需要重复多次，以得到合适的蛋白酶与蛋白比例范围。

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