用于评估口腔中性粒细胞的稳定的小鼠牙周炎结扎诱导模型

本文所述方案为研究者提供了一种在结扎诱导的牙周病动物模型中以类似于人体研究的方式研究口腔中性粒细胞的方法。该技术的主要优势在于可获得更大量的炎症牙龈组织用于后续分析，从而减少实验动物的使用数量。我们能够从牙齿周围回收带有生物膜的结扎线，从而模拟局部牙周病的有效治疗过程。

由于该模型可增加牙龈组织的炎症面积，因此可用于研究牙周炎在动物模型中的全身性影响。在接触活体动物实验对象之前，强烈建议熟悉显微外科器械和解剖显微镜的使用，以及掌握外科打结技术。对该技术进行可视化演示，对于缩短掌握熟练结扎技术所需的学习周期至关重要。

本实验操作将由我实验室的研究生 Jeff Chadwig 演示。首先将小鼠置于加热的手术平台上。在确认小鼠已充分麻醉后，使用弹性绷带将上颌和下颌固定于张开位置。

用棉卷垫高颈部，使上颌保持水平位置，并覆盖身体和尾部以减少热量散失。将手术显微镜调整至所需的放大倍数和照明条件，对准口腔区域。使用镊子将无菌的50号或更细的编织丝线穿过上颌第一和第二磨牙的牙龈沟，进行缝合。

将缝线的远端置于牙列的腭侧，近端穿过 M2 与 M3 之间的邻接点。然后，将缝线绕过 M2 的颊面，并插入 M1 与 M2 之间的邻接点。确保拉紧缝线两端，使其完全进入龈沟内。将缝线的近端段绕过 M1 的外形高点下方，并插入 M1 与 M2 之间的邻接点。拉紧缝线的近端尾部，以消除所有松动。用外科结打结，并尽可能剪短线尾。

将结扎线的结置于上颌牙齿腭侧M1与M2之间的牙龈 embrasure（龈楔状隙）中。用于固定结扎线的结必须牢固，并准确放置在不会刺激动物或干扰咀嚼的位置。结扎线安装完成后，将小鼠从手术装置中取出，放入干净的笼子中，并置于加热灯下，确保密切监测直至其完全恢复。

每次处理完一只动物后，将手术器械在热玻璃珠灭菌器中进行灭菌。将每只小鼠单独饲养，提供适当的环境丰富化材料，并在温度和湿度可控的环境中自由摄取过滤水和磨碎的标准饲料，持续七至十一天。准备采集样本时，使用移液器以100微升无钙镁的4摄氏度灭菌PBS冲洗口腔10秒钟。

重复冲洗两次，将每次的冲洗液均放入同一支15毫升锥形无菌试管中，每只动物对应一支试管。将每支15毫升试管中的内容物通过40微米尼龙滤网过滤至50毫升锥形管中，并将滤液转移至新的15毫升试管中。加入33.3微升16%多聚甲醛以促进样品固定。

立即涡旋混匀样品，并在冰上孵育15分钟。多聚甲醛是本方案中最具危害性的试剂，应按照制造商推荐的个人防护装备进行操作。孵育结束后，用PBS将试管补至15毫升，然后在4°C条件下以1000×g离心5分钟。

吸去上清液，将沉淀物在4°C下用1毫升FACS缓冲液重悬，并在血细胞计数板或自动细胞计数仪上计数细胞。重复离心并吸去上清液。然后，将细胞沉淀用适量FACS缓冲液重悬，使最终浓度为每50微升FACS缓冲液中含有500,000至100万个细胞，并将细胞转移至FACS管中。

向50微升样品中加入1微升大鼠血清和2微升抗小鼠IgG抗体。立即涡旋混匀样品，并在冰上封闭20分钟。然后，向每个样品中加入相应的抗体。

涡旋混匀，在冰上避光孵育30分钟。孵育结束后，用1毫升FACS缓冲液洗涤样品，短暂涡旋，然后在1000×g、4°C条件下离心5分钟。弃去上清液，轻轻堵住FACS管的管口。

重复洗涤两次，然后将样品重悬于 250 µL FACS 缓冲液中以进行保存。用石蜡膜覆盖管子，再用铝箔包裹，并在 4°C 下保存直至准备分析。采用流式细胞术分析从未经处理的小鼠口腔冲洗液中回收的中性粒细胞，以及从结扎诱导牙周炎小鼠的口腔冲洗液和回收的结扎线中获得的中性粒细胞。

为评估牙槽骨吸收，测量了健康小鼠和结扎小鼠从牙槽骨嵴顶至釉牙骨质界的牙槽骨水平，并计算其测量值的差异。尽管本文未予详述，但可根据具体研究问题，对牙周组织及牙槽骨进行组织病理学、免疫组织化学以及形态计量学分析。

目前，我的实验室正在利用该模型研究口腔先天免疫系统对全身健康和疾病的影响。