Name: 利用原子力显微镜测量植物细胞和植物组织的机械特性和Turgor压力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 学习使用原子力显微镜测量植物细胞和组织机械特性及膨压的非侵入性方法。该技术可追踪不同发育阶段和器官间的力学变化，为研究植物发育机制提供重要数据。

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我们感谢PLATIM团队提供的技术支持，同时也感谢RDP实验室生物物理团队的Arezki Boudaoud及其成员给予的有益讨论。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

植物形态的形成主要由生长在时间和空间上的协调速率和方向决定。植物细胞被包裹在由多糖基质构成的刚性细胞壁中，该基质将细胞粘合在一起。因此，细胞扩张受到膨压对细胞壁的拉力与细胞壁抵抗该压力的刚度之间平衡的控制。为了理解发育背后的机制，有必要能够测量特定器官的不同组织或细胞中的细胞壁力学特性以及膨压。正如本文所展示的，原子力显微镜（AFM）是此情境下的首选方法。
该实验方案中有若干关键步骤。第一步是组织准备，此步骤应迅速完成以避免组织脱水。如果需要测量膨压，则这一点尤为关键。另一个非常重要的环节是将样品正确固定于基底上：样品不稳定可能导致明显的效应，例如肉眼容易观察到的宏观移动，或力-压痕曲线出现严重变形。此外，样品的振动或弯曲可能较难察觉，但会引入实验 artifacts。最后，另一个关键步骤涉及压痕参数的选择，这对实验结果的质量具有决定性作用。
在测量大范围区域（扫描尺寸超过 40–50 µm）的机械性能时，高度差异可能较大，导致难以准确追踪表面形貌，并在不接近 Z 压电驱动器量程极限的情况下完成力曲线采集。为克服这一问题，已使...

原子力显微镜（AFM）属于扫描探针显微镜（SPM）家族，其探针尖端半径通常仅为几个纳米，用于扫描样品表面。该技术并非通过光学或电子方法来探测表面，而是通过探针与样品表面之间的相互作用力实现检测。因此，该技术不仅可用于样品表面的形貌表征（三维分辨率可达几个纳米），还可用于测量各种类型的相互作用力，如静电作用力、范德华力或接触力。此外，探针还可用于在生物样品表面施加作用力，并测量由此产生的形变——即所谓的&#34;压痕&#34;，以确定其力学性质（例如杨氏模量、黏弹性特性）。
在研究发育过程机制时，必须考虑植物细胞壁的力学特性1,2,3。事实上，在发育过程中，这些特性受到严格调控，特别是细胞壁软化是细胞生长所必需的。原子力显微镜（AFM）可用于测量这些特性，并研究其在不同器官、组织或发育阶段之间的变化方式。
本文中，我们描述了如何利用原子力显微镜（AFM）测量细胞壁的力学性质和膨压。这两种应用分别在两台不同的原子力显微镜上进行，并在下文中详细介绍。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000倍维甲素储备液</td><td></td><td></td><td>用于制备ACM，具体成分见Stanislas等，2017。在高压灭菌后、倒平板前加入ACM中。</td></tr><tr><td>1-N-萘基邻苯二甲酸（NPA）</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>132-66-1</td><td>加入拟南芥培养基中，终浓度为10 &amp;mu;M。在高压灭菌后、倒平板前加入。</td></tr><tr><td>琼脂粉（Agar-agar）</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>9002-18-0</td><td>加入拟南芥培养基中，终浓度为1% w/v。</td></tr><tr><td>琼脂糖（Agarose）</td><td>Merck Millipore</td><td>9012-36-6</td><td>用于制备固体ACM，终浓度为0.8% w/v。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Arabidopsis&lt;/em&gt; 培养基</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>DU0742.0025</td><td>用于拟南芥体外培养，11.82 g/L。</td></tr><tr><td>四水合硝酸钙</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>13477-34-4</td><td>加入拟南芥培养基中，终浓度为2 mM。</td></tr><tr><td>MURASHIGE &amp; SKOOG 培养基</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>M0221.0025</td><td>基础盐混合物，用于制备ACM，2.2 g/L。</td></tr><tr><td>N6-苄基腺嘌呤（BAP）</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>1214-39-7</td><td>用于制备ACM，终浓度为555 nM。在高压灭菌后、倒平板前加入ACM中。</td></tr><tr><td>寡霉素（Oryzalin）</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>19044-88-3</td><td>用于寡霉素处理，终浓度为10 &amp;mu;g/mL。</td></tr><tr><td>植物保存混合液（PPM）</td><td>Plant Cell Technology</td><td></td><td>用于制备ACM，终浓度为0.1% v/v。在高压灭菌后、倒平板前加入ACM中。</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>1310-58-3</td><td>用于制备拟南芥培养基和ACM，调节pH至5.8。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Duchefa Biochimie</td><td>57-50-1</td><td>用于制备ACM，终浓度为1% w/v。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;原子力显微镜（AFM）工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioScope Catalyst BioAFM</td><td>Bruker</td><td></td><td>本实验方案中用于测定膨压的原子力显微镜。</td></tr><tr><td>Nanowizard III + CellHesion</td><td>JPK (Bruker)</td><td></td><td>用于测定机械性能的原子力显微镜。</td></tr><tr><td>Patafix</td><td>UHU</td><td>D1620</td><td></td></tr><tr><td>参考弹性结构</td><td>NanoIdea</td><td>2Z00026</td><td></td></tr><tr><td>Reprorubber-Thin Pour</td><td>Flexbar</td><td>16135</td><td>生物相容性胶水。</td></tr><tr><td>球形AFM探针</td><td>Nanoandmore</td><td>SD-SPHERE-NCH-S-10</td><td>用于测定机械性能的探针。</td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜测量植物细胞和植物组织的机械特性及膨压

Use of Atomic Force Microscopy to Measure Mechanical Properties and Turgor Pressure of Plant Cells and Plant Tissues

本文介绍了利用原子力显微镜对植物组织进行压痕实验，以获取其力学特性的方法。通过使用两种不同的显微镜在压痕模式下操作，我们展示了如何测量弹性模量，并利用该参数评估细胞壁的力学性质。此外，我们还解释了如何评估膨压。原子力显微镜的主要优势在于其具有非侵入性、相对快速（5~20 分钟），并且几乎任何表面较为平整的活体植物组织均可在无需预处理的情况下进行分析。其分辨率可以非常高，具体取决于探针尺寸以及单位面积内的测量次数。该方法的一个局限性在于，仅能直接获取表层细胞的信息。

图1A 和 图1B 展示了实验方案中步骤1.3.4至1.3.6的结果截图，用于确定获取QI图谱的目标区域。值得注意的是，目标区域的选择应避免位于倾斜表面（即尽可能平坦）。实际上，正如Routier等5所指出的，如果压痕轴线不垂直于表面，则测得的杨氏模量可能被低估。这种效应在图1的C或D图右上角区域可见，其中细胞边界的某部分看起来比细胞其余部分更柔软。在分生组织中，这种效应引起的伪影会更加显著，因为在50 × 50 µm2的扫描区域内，局部倾斜角度很容易超过40°。在我们实验室中，目前正在开发一种基于Routier等5所述方法的算法，以校正此类伪影（论文在准备中）。图1C 和 图1...

本文介绍了原子力显微镜（AFM）作为细胞和组织的纳米及微米级压痕工具的应用。该仪器可同时获取样品的三维表面形貌及其力学特性，包括细胞壁的杨氏模量以及膨压。

本文介绍了利用原子力显微镜对植物组织进行压痕实验以获取其力学特性的方法。通过使用两台不同的显微镜在……

在试图理解发育过程中潜在机制时，植物细胞的力学特性至关重要。原子力显微镜可用于测量这些特性，并追踪其在不同器官、组织以及各个发育阶段中的变化。该技术的主要优势在于其非侵入性、相对快速，且无需对样品进行处理，因此可直接应用于活体样品。对于初次接触该操作的研究人员而言，样品的顺式（cis）部分极为关键，因此务必确保样品得到适当的机械固定。对该操作步骤进行直观演示，对于深入理解样品固定的复杂性、支架的质量控制以及测量装置的设置至关重要。本次操作演示将由我实验室的工程师 Simone Bovio 和博士后研究员 Yuchen Long 进行。首先，将一条双面胶带贴在直径为5厘米的培养皿中央。将从花蕾中分离出的基因样本置于胶带上。迅速向培养皿中加入水，直至完全浸没样本，以避免脱水。接下来，将样品放置到原子力显微镜（AFM）载物台上，并移动探头使其位于样品上方。在软件中完成悬臂梁校准后，确保系统处于QI模式，并以15纳牛的设定力接近样品。然后，设置Z轴范围为4微米，扫描区域设为80微米×80微米，像素数设为40×40。然后进入高级成像设置面板，将模式设为恒定速度。此外，将进入轨迹速度设为每秒200微米，采样率设为25千赫兹。参数设置完成后，将探针移至样品上的目标区域。确认待扫描区域无杂物，找到尽可能平坦的区域并进行定位，启动后开始扫描，并使用快速低力扫描模式检查样品是否发生移动。找到目标区域后，选择一个面积为40×40至60×60平方微米的区域，并将像素密度提高至每微米2像素。随后，将设定力增加至500纳牛，以获得100至200纳米的压痕深度。将Z轴长度减小至两微米，并将进入轨迹速度延长至每秒一百微米，然后将采样率提高至五十千赫兹，开始扫描样品。完成后，将输出结果同时保存为图像和数据文件。打开数据处理软件并加载该数据文件。单击“使用此地图进行批量处理”按钮，以将相同的参数应用于地图中的所有曲线，然后转到“加载预定义流程”并选择赫兹拟合（hertz fit）。接下来，进入可切换基线操作，将减去方式设置为“偏移加倾斜”（offset plus tilt），X 最小值设置在 40% 至 60% 之间。在垂直针尖位置选项卡中，如果希望对原始数据进行处理，请选择“平滑紧密”（smooth tight）。为选择合适的拟合模型，请转到弹性拟合选项卡，根据预期的黏附强度选择其中一个选项。若无黏附或黏附较弱，则使用逼近曲线，并优先选用赫兹-纳米压痕（Hertz-Sneddon）模型。若存在较强黏附，则使用德根-米利亚-多尔托普罗夫（Dergen Milia Dortoprov，DMD）模型，并基于回退曲线进行分析。现在根据名义针尖形状设置针尖的几何参数。本实验中使用的针尖为球形针尖，半径为400纳米。接下来，将泊松比设为0.5，并选择偏移曲线。通过单击主窗口旁的图标，添加第二个弹性拟合程序，并重复相同的参数设置。最后，在 X 分钟内指定所需的压痕参数，然后点击“保留并应用于全部”，以对力图中所有曲线迭代执行前述步骤。保存结果，以生成点阵 tsv 文件格式的图像。为了进行快速溶液更换的测量，将样品固定在培养皿中，并使用一小块粘合性腻子进行固定。迅速用生物相容性胶水密封腻子与样品基底之间的缝隙。待胶水完全固化后，将样品浸入含有0.1%植物保存混合物的液体顶端培养基中。校准系统后，打开采集软件，首先进入检查参数窗口。在该窗口中，将弹簧常数设置为悬臂的标称弹簧常数或已测定的弹簧常数。接着，将针尖半径设为400纳米，样品泊松比设为0.5，采样线数设为128以确保快速采集，扫描速率设为0.2赫兹，扫描尺寸设为1微米。然后进入斜坡窗口，将斜坡大小设置为五微米，触发电平设为最大值，采样点数设为四千六百零八。所有参数设置完毕后，手动小心接近样品。当探针接近样品表面时，点击“接近”按钮。接触后，逐渐增大扫描范围并调整扫描速率，直至在不损坏样品或探针的前提下达到理想的平衡状态。如果测量区域不符合预期，可重新定位扫描位置。当条件满足时，单击按钮，进入“定点采集”模式，启动定点采集窗口。指定保存目录和文件名，然后点击“下次扫描时启动斜坡”以开始记录。扫描完成后，软件界面将跳转至斜坡窗口。单击扫描图像以指定压痕位置。每个细胞靠近其浆果中心的位置至少选择三个压痕点，设置每侧重复压痕三次，然后单击斜坡（ramp）并捕获。在分析软件中，打开 dot MCA 文件，该文件显示了每条力曲线在扫描图像上的位置。然后打开一个待分析的力曲线。点击基线校正按钮，拖动力曲线上的蓝色虚线，分别将“基线起点”和“基线终点”调整至0%和80%处。然后点击执行。接下来，单击盒式移动平均滤波器按钮，然后单击执行以平滑力曲线。接着单击压痕按钮。在输入窗口中，将活动曲线设置为延伸，将第五种方法设置为线性化模型，将最大力拟合边界设置为99%，将最小力拟合边界设置为75%，并将拟合模型设置为刚度。批量分析力曲线。为此，请点击运行历史记录按钮，指定报告目录，并添加需要相同处理的其他力曲线。完成后，点击运行。当 K 值进行批次拟合时，单击历史记录并返回至第五次压痕，以回到压痕窗口。随后，将最大力拟合边界更改为百分之十，最小力拟合边界更改为百分之一。然后将拟合模型设置为赫兹模型。接下来，打开相应的文件以显示不同的扫描通道。在高通道窗口中，点击截面按钮。这将允许测量样品表面曲率，该曲率是推导膨压所必需的。然后沿一个细胞长轴方向画一条线，将虚线边界移动至细胞边缘，并记录半径值。最后按照文本方案中的步骤，计算每个细胞的平均杨氏模量、弹簧常数 E、K 以及膨压。左侧图像为杨氏模量分布图，通过分析整个压痕过程直至用户设定的力阈值获得；右侧图像则显示了前一百纳米压痕深度分析的结果。此处，这两幅图看起来非常相似，但在某些情况下，压痕深度的变化能够更清晰地突出样品的异质性，这有助于确定位置或提供有关内部结构行为的信息。对于这些图上的每个点，都存在一条相应的力曲线。此处显示的曲线具有两个值得注意的效应。首先，如果力曲线的接近段在五百纳牛时结束，探针的向下移动仍会继续，这意味着探针施加的最终作用力高于预期。需要注意的第二个现象是椭圆所标示的回缩曲线上出现的波动。这种波动可能是样品在探针作用下发生移动或振动的迹象，可能需要更换不同的固定方法。通过本文所记录的步骤，除细胞壁厚度外，所有用于推导膨压的关键参数均可从原子力显微镜（AFM）扫描和压痕实验中获得。在红十字位置进行深部压痕的力曲线描述了细胞壁的杨氏模量以及样品在曲线不同阶段的表观刚度。样品固定至关重要。在测量过程中，需注意观察样品不稳定性的迹象。仔细选择表面平坦的区域，以确保垂直压痕。通过此方法，可监测不同时间点和条件下的力学性能。此外，还可将力学测量结果与共聚焦图像叠加，用于相关性研究。该技术为将生物力学与生理发育及其他生物过程联系起来奠定了基础。

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Research

科研

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Developmental Biology

发育生物学

利用原子力显微镜测量植物细胞和植物组织的机械特性和Turgor压力

本文旨在指导读者使用集成的原子力-光学成像显微镜对培养中的活细胞进行机械刺激操作。文中提供了一步一步的操作方案，并展示了一组典型的实验数据，用以显示活细胞对机械刺激的响应。...

活细胞对机械刺激响应的集成光学与原子力显微镜研究

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

我们描述了一种利用原子力显微镜（AFM）绘制植物组织机械特性的方法。重点介绍如何在宽场介观尺度上记录植物发育过程中细胞壁发生的机械性变化，从而将这些变化与生长及形态发生过程相关联。...

基于原子力显微镜的细胞壁弹性特性图谱：组织、细胞及亚细胞分辨率

本文介绍了一种对茎尖分生组织中皮层微管细胞骨架进行活细胞成像并监测其对物理力变化响应的实验方案。...

活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控 拟南芥 茎尖分生组织

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

原子力显微镜压痕实验方案能够解析在正常或受限生长条件下（例如，在水分亏缺情况下），组织或器官中特定细胞的细胞壁物理特性所起的作用。...

利用原子力显微镜研究活体表皮细胞的物理特性 拟南芥 根

细胞壁生物力学的研究对于理解植物生长和形态发生至关重要。本方案旨在利用原子力显微镜研究幼嫩植物器官内部组织中的薄初生细胞壁。...

利用原子力显微镜表征活体植物器官初生细胞壁的力学特性

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地磁场（Gmf）与植物进化：研究地磁场反转对Arabidopsis thaliana发育和基因表达的影响

基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。...

胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控

本文介绍了一种简单的方法，利用高数值孔径物镜和全氟十氢化萘作为浸没介质，对根和下胚轴发育进行长达3天的高分辨率共聚焦延时成像。...

一种用于根和下胚轴发育长期共聚焦成像的简易培养室

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