利用原子力显微镜测量植物细胞和植物组织的机械特性及膨压

在试图理解发育过程中潜在机制时，植物细胞的力学特性至关重要。原子力显微镜可用于测量这些特性，并追踪其在不同器官、组织以及各个发育阶段中的变化。该技术的主要优势在于其非侵入性、相对快速，且无需对样品进行处理，因此可直接应用于活体样品。

对于初次接触该操作的研究人员而言，样品的顺式（cis）部分极为关键，因此务必确保样品得到适当的机械固定。对该操作步骤进行直观演示，对于深入理解样品固定的复杂性、支架的质量控制以及测量装置的设置至关重要。本次操作演示将由我实验室的工程师 Simone Bovio 和博士后研究员 Yuchen Long 进行。

首先，将一条双面胶带贴在直径为5厘米的培养皿中央。将从花蕾中分离出的基因样本置于胶带上。迅速向培养皿中加入水，直至完全浸没样本，以避免脱水。

接下来，将样品放置到原子力显微镜（AFM）载物台上，并移动探头使其位于样品上方。在软件中完成悬臂梁校准后，确保系统处于QI模式，并以15纳牛的设定力接近样品。然后，设置Z轴范围为4微米，扫描区域设为80微米×80微米，像素数设为40×40。

然后进入高级成像设置面板，将模式设为恒定速度。此外，将进入轨迹速度设为每秒200微米，采样率设为25千赫兹。参数设置完成后，将探针移至样品上的目标区域。

确认待扫描区域无杂物，找到尽可能平坦的区域并进行定位，启动后开始扫描，并使用快速低力扫描模式检查样品是否发生移动。找到目标区域后，选择一个面积为40×40至60×60平方微米的区域，并将像素密度提高至每微米2像素。随后，将设定力增加至500纳牛，以获得100至200纳米的压痕深度。

将Z轴长度减小至两微米，并将进入轨迹速度延长至每秒一百微米，然后将采样率提高至五十千赫兹，开始扫描样品。完成后，将输出结果同时保存为图像和数据文件。打开数据处理软件并加载该数据文件。

单击“使用此地图进行批量处理”按钮，以将相同的参数应用于地图中的所有曲线，然后转到“加载预定义流程”并选择赫兹拟合（hertz fit）。接下来，进入可切换基线操作，将减去方式设置为“偏移加倾斜”（offset plus tilt），X 最小值设置在 40% 至 60% 之间。在垂直针尖位置选项卡中，如果希望对原始数据进行处理，请选择“平滑紧密”（smooth tight）。

为选择合适的拟合模型，请转到弹性拟合选项卡，根据预期的黏附强度选择其中一个选项。若无黏附或黏附较弱，则使用逼近曲线，并优先选用赫兹-纳米压痕（Hertz-Sneddon）模型。若存在较强黏附，则使用德根-米利亚-多尔托普罗夫（Dergen Milia Dortoprov，DMD）模型，并基于回退曲线进行分析。

现在根据名义针尖形状设置针尖的几何参数。本实验中使用的针尖为球形针尖，半径为400纳米。接下来，将泊松比设为0.5，并选择偏移曲线。

通过单击主窗口旁的图标，添加第二个弹性拟合程序，并重复相同的参数设置。最后，在 X 分钟内指定所需的压痕参数，然后点击“保留并应用于全部”，以对力图中所有曲线迭代执行前述步骤。保存结果，以生成点阵 tsv 文件格式的图像。

为了进行快速溶液更换的测量，将样品固定在培养皿中，并使用一小块粘合性腻子进行固定。迅速用生物相容性胶水密封腻子与样品基底之间的缝隙。待胶水完全固化后，将样品浸入含有0.1%植物保存混合物的液体顶端培养基中。

校准系统后，打开采集软件，首先进入检查参数窗口。在该窗口中，将弹簧常数设置为悬臂的标称弹簧常数或已测定的弹簧常数。接着，将针尖半径设为400纳米，样品泊松比设为0.5，采样线数设为128以确保快速采集，扫描速率设为0.2赫兹，扫描尺寸设为1微米。

然后进入斜坡窗口，将斜坡大小设置为五微米，触发电平设为最大值，采样点数设为四千六百零八。所有参数设置完毕后，手动小心接近样品。当探针接近样品表面时，点击“接近”按钮。

接触后，逐渐增大扫描范围并调整扫描速率，直至在不损坏样品或探针的前提下达到理想的平衡状态。如果测量区域不符合预期，可重新定位扫描位置。当条件满足时，单击按钮，进入“定点采集”模式，启动定点采集窗口。

指定保存目录和文件名，然后点击“下次扫描时启动斜坡”以开始记录。扫描完成后，软件界面将跳转至斜坡窗口。

单击扫描图像以指定压痕位置。每个细胞靠近其浆果中心的位置至少选择三个压痕点，设置每侧重复压痕三次，然后单击斜坡（ramp）并捕获。在分析软件中，打开 dot MCA 文件，该文件显示了每条力曲线在扫描图像上的位置。

然后打开一个待分析的力曲线。点击基线校正按钮，拖动力曲线上的蓝色虚线，分别将“基线起点”和“基线终点”调整至0%和80%处。然后点击执行。

接下来，单击盒式移动平均滤波器按钮，然后单击执行以平滑力曲线。接着单击压痕按钮。在输入窗口中，将活动曲线设置为延伸，将第五种方法设置为线性化模型，将最大力拟合边界设置为99%，将最小力拟合边界设置为75%，并将拟合模型设置为刚度。

批量分析力曲线。为此，请点击运行历史记录按钮，指定报告目录，并添加需要相同处理的其他力曲线。完成后，点击运行。

当 K 值进行批次拟合时，单击历史记录并返回至第五次压痕，以回到压痕窗口。随后，将最大力拟合边界更改为百分之十，最小力拟合边界更改为百分之一。然后将拟合模型设置为赫兹模型。

接下来，打开相应的文件以显示不同的扫描通道。在高通道窗口中，点击截面按钮。这将允许测量样品表面曲率，该曲率是推导膨压所必需的。

然后沿一个细胞长轴方向画一条线，将虚线边界移动至细胞边缘，并记录半径值。最后按照文本方案中的步骤，计算每个细胞的平均杨氏模量、弹簧常数 E、K 以及膨压。左侧图像为杨氏模量分布图，通过分析整个压痕过程直至用户设定的力阈值获得；右侧图像则显示了前一百纳米压痕深度分析的结果。

此处，这两幅图看起来非常相似，但在某些情况下，压痕深度的变化能够更清晰地突出样品的异质性，这有助于确定位置或提供有关内部结构行为的信息。对于这些图上的每个点，都存在一条相应的力曲线。此处显示的曲线具有两个值得注意的效应。

首先，如果力曲线的接近段在五百纳牛时结束，探针的向下移动仍会继续，这意味着探针施加的最终作用力高于预期。

需要注意的第二个现象是椭圆所标示的回缩曲线上出现的波动。这种波动可能是样品在探针作用下发生移动或振动的迹象，可能需要更换不同的固定方法。通过本文所记录的步骤，除细胞壁厚度外，所有用于推导膨压的关键参数均可从原子力显微镜（AFM）扫描和压痕实验中获得。

在红十字位置进行深部压痕的力曲线描述了细胞壁的杨氏模量以及样品在曲线不同阶段的表观刚度。样品固定至关重要。在测量过程中，需注意观察样品不稳定性的迹象。

仔细选择表面平坦的区域，以确保垂直压痕。通过此方法，可监测不同时间点和条件下的力学性能。此外，还可将力学测量结果与共聚焦图像叠加，用于相关性研究。

该技术为将生物力学与生理发育及其他生物过程联系起来奠定了基础。