用于转化性肿瘤免疫学（I-O）研究的人源外周血单个核细胞（PBMC）移植人源化异种移植模型

本方案可作为建立人源PBMC与肿瘤重建小鼠模型的通用指南，用于肿瘤免疫学研究。这些操作步骤通过皮下接种并将人源PBMC与肿瘤异种移植物混合，为在荷瘤小鼠体内部分重建人类免疫系统提供了一种经济高效且高度可重复的方法。与我一同演示实验操作的是来自药理学系的Xinxin Cui、Yanjuan Zhang、Huichen Bai和Xiaolong Yang。

对于髓系细胞耗竭，通过腹腔注射给予6至8周龄的NOD/SCID雌性小鼠环磷酰胺100 mg/kg，同时口服给予双硫仑125 mg/kg，每天一次，连续两天。第二次给予环磷酰胺和双硫仑后24小时，将新分离的人外周血单个核细胞（PBMC）的5×10⁶个细胞、人肿瘤细胞系细胞的2.5×10⁶个细胞与200 µL PBS加50%明胶混合，每只动物注射一次，全部体积皮下注射至每只实验动物的右侧 flank 区域。每周测量并记录原位肿瘤体积两次，持续四到六周。

当肿瘤体积达到平均 200 至 500 立方毫米时，使用眼科剪从每只动物体内完整取出肿瘤组织。应选择那些来源于外周血单个核细胞（PBMC）供体的肿瘤细胞系或患者来源的异种移植瘤（PDX），且具有中等程度肿瘤生长以及相对较高 PD-1、PD-L1 和 CD8 表达的模型用于后续分析。对于收获的肿瘤组织进行免疫组织化学分析时，需将样本在福尔马林中固定 24 至 72 小时，然后进行脱水处理，并将组织包埋于石蜡中。

取嵌入组织的三个切片（厚度为微米级），置于多聚赖氨酸包被的载玻片上，用二甲苯浸泡三次，每次七分钟，进行脱蜡处理。第三次处理后，用梯度酒精浸泡三次，每次三分钟，对切片进行水化。然后用去离子水冲洗载玻片三次，并将载玻片上多余的液体去除。

为进行抗原修复，将切片放入容器中，并用10毫摩尔的柠檬酸钠缓冲液覆盖切片。将装有切片的容器在微波炉中加热3分钟，随后将切片转移至95摄氏度的水浴中孵育30分钟。待冷却至室温后，用去离子水冲洗切片3次，并吸去切片上多余的液体。

用0.3%过氧化氢孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性，随后用3% BSA和PBS在室温下封闭1小时。过氧化氢孵育结束后，将切片在4°C条件下与相应的一抗孵育过夜。次日早晨，室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗处理切片1小时，然后将底物逐滴加至切片上，直至在光学显微镜下观察到适当的棕褐色染色信号为止。

接下来，用苏木精对样本进行染色。一分钟后，用蒸馏水终止反应，随后将样本浸入0.5%盐酸酒精中5秒，再浸入0.5%氨水中5秒。然后依次通过三次每次三分钟的梯度乙醇脱水，再经三次每次五分钟的二甲苯浸润。

为了评估目标候选药物的抗肿瘤活性，应根据预定的实验方案，在细胞接种当天开始给药，并在接下来的四到六周内每周两次监测原位肿瘤体积。对于PharmaCODE动态分析肿瘤浸润免疫细胞，将肿瘤组织剪碎成小块，加入胶原酶I型、DNase I及含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37摄氏度条件下消化30分钟。消化结束后，将消化后的组织通过40微米细胞筛过滤，以获得单细胞悬液，并通过离心收集细胞。

将沉淀重悬于冰冻FACS缓冲液中，细胞浓度为每毫升1×10⁷个细胞，然后将等量细胞转移至96孔圆底板中的相应孔中。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于20 µg/mL人IgG中，4℃孵育30分钟以阻断非特异性结合。随后在4℃下用相应的初级抗体孵育细胞30分钟，之后根据标准操作流程进行流式细胞术分析。

如所示，每千克体重给予100毫克环磷酰胺和每千克体重给予125毫克双硫仑进行骨髓清除后，治疗四天后中性粒细胞和单核细胞数量显著减少。在移植人外周血单个核细胞（PBMC）和肿瘤后，可通过免疫组织化学方法验证肿瘤微环境中是否存在人源免疫细胞浸润。可通过体内筛选一组PBMC供体，以确认在可接受的肿瘤生长速率下，肿瘤微环境中存在相对较高的免疫细胞浸润。

不同癌症类型的患者来源异种移植模型中的人癌细胞系也可用于评估肿瘤生长速度和免疫细胞浸润情况。在此代表性实验中，使用人源化抗PD1抗体处理PBMC及移植人源化小鼠，可产生显著的抗肿瘤活性。双硫仑可降低环磷酰胺的泌尿系统毒性，该联合用药可能在小鼠中引起更持久的中性粒细胞减少效应。

环磷酰胺和双硫仑的确切给药方案可能需要预先确定。目前已有更新的、免疫缺陷程度更高的小鼠品系，可更易于实现人类免疫系统的重建，并减少异源性移植物抗宿主病（GvHD）效应，这些品系尚待结合我们已记录的实验方案进行进一步研究。我们的模型适用于评估T细胞参与的癌症免疫疗法，尤其适用于时间紧迫的研究，或在转向更复杂的多谱系免疫模型之前进行候选药物筛选。