Name: 增强交联免疫沉淀 (eCLIP) 方法, 有效鉴定小鼠睾丸蛋白质结合 rna (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 了解增强交联免疫沉淀（eCLIP）方法在小鼠睾丸中鉴定RNA结合蛋白靶标的应用。该技术无放射性、省时高效，为研究生殖过程中的转录后调控机制提供了可靠工具。

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我们感谢 Eric L Van Nostrand 和 Gene W Yeo 在原始实验方案中提供的有益指导。K.Z. 受到国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2016YFA0500902，2018YFC1003500），国家自然科学基金（31771653）。L.Y. 获国家自然科学基金（81471502，31871503）和江苏省创新创业计划资助。

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<li>Sievers, C., Schlumpf, T., Sawarkar, R., Comoglio, F., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+models+and+wavelet+transforms+reveal+high+confidence+RNA-protein+interaction+sites+in+MOV10+PAR-CLIP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mixture models and wavelet transforms reveal high confidence RNA-protein interaction sites in MOV10 PAR-CLIP data.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), e160(2012).</li>
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<li>Maticzka, D., Ilik, I. A., Aktas, T., Backofen, R., Akhtar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((uvCLAP+is+a+fast+and+non-radioactive+method+to+identify+in+vivo+targets+of+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">uvCLAP is a fast and non-radioactive method to identify in vivo targets of RNA-binding proteins.</a> Nature Communications. 9 (1), 1142(2018).</li>
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<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnology. 11, 24(2011).</li>
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<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+is+an+RNA-binding+protein%2C+and+its+interactome+provides+a+link+to+neural+development+and+microtubule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC is an RNA-binding protein, and its interactome provides a link to neural development and microtubule assembly.</a> Cell. 158 (2), 368-382 (2014).</li>
<li>Meyer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TIA1+RNA-Binding+Protein+Family+Regulates+EIF2AK2-Mediated+Stress+Response+and+Cell+Cycle+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The TIA1 RNA-Binding Protein Family Regulates EIF2AK2-Mediated Stress Response and Cell Cycle Progression.</a> Molecular Cell. 69 (4), 622-635 (2018).</li>
<li>Gerstberger, S., Hafner, M., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human RNA-binding proteins.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (12), 829-845 (2014).</li>
<li>Vourekas, A., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+%28CLIP-Seq%29+for+mouse+Piwi+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP (CLIP-Seq) for mouse Piwi proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1093, 73-95 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

随着对RNA结合蛋白（RBPs）在生物学和病理学背景下普遍作用的深入理解，CLIP技术已被广泛用于揭示RBPs的分子功能20,32,33,34,35。本文所述方案代表了eCLIP方法在小鼠睾丸组织中的一种改进应用。
在睾丸组织中进行eCLIP实验的一个挑战是维持新鲜睾丸细胞的活性和完整性，这对于有效的交联同样至关重要。使用松散研杵施加温和的机械力研磨睾丸组织，可防止细胞裂解32,36。RNA的充分消化对于成功完成eCLIP检测也极为关键。RNA消化后的片段应具有更高的集中性，但长度小于20 bp的片段可通过文库测序读段的预处理步骤予以去除。为了...

哺乳动物睾丸是一个理想的发育模型，其中复杂的细胞分化程序呈周期性进行，以产生大量精子。该模型的独特价值在于，在精子发生过程中的某些阶段会出现转录失活现象，典型情况包括减数分裂性染色体失活（MSCI）的发生1,2，以及在精子形成过程中，圆形精子细胞经历剧烈的核压缩3。这些非连续性的转录事件需要转录后基因调控，而RNA结合蛋白（RBPs）在其中发挥关键作用，调控转录组并维持雄性生育力。
为了在体内鉴定单个RNA结合蛋白（RBP）的真实RNA靶标，研究人员开发了交联免疫沉淀（CLIP）方法4,5，该方法在常规RNA免疫沉淀（RIP）6,7的基础上进一步优化，引入了若干关键步骤，包括紫外（UV）交联、严格洗涤以及凝胶转膜，以提高信号特异性。CLIP技术与高通量测序相结合的进阶应用，已引起广泛关注，可用于在全基因组水平上分析蛋白-RNA相互作用8。除了遗传学研究外，这类能够鉴定内源性蛋白与RNA直接相互作用的生物化学方法，对于准确阐明RBP在RNA调控中的功能至关重要。例如，MOV10L1是一种睾丸特异表达的RNA解旋酶，对雄性生育力和Piwi相互作用RNA（piRNA）的生成至关重要9。其旁系同源蛋白MOV10则是一种广泛表达且具有多种功能的RNA解旋酶，在RNA生物学的多个方面发挥重要作用10,11,12,13,14,15,16,17,18。通过应用传统的CLIP-seq技术，我们发现MOV10L1可结合并调控初级piRNA前体，从而启动早期piRNA加工过程19,20，而MOV10则可在睾丸生殖细胞中结合mRNA的3'非翻译区（UTR）以及多种非编码RNA（数据未显示）。
然而，CLIP 最初是一种费力且依赖放射性的实验流程，随后进行测序文库构建时会导致大量的 CLIP 标签丢失。在传统的 CLIP 方法中，通过在 RNA 两端连接接头来构建 cDNA 文库。在蛋白质消化后，交联的短肽仍附着在 RNA 片段上。这种交联位点在 cDNA 合成过程中部分阻碍逆转录酶（RTase）的延伸，导致产生截短的 cDNA，这类产物约占 cDNA 文库总量的 80%21,22。因此，只有逆转录酶成功越过交联位点（通读）而生成的 cDNA 片段才能被测序。近年来，已发展出多种 CLIP 技术，如 PAR-CLIP、iCLIP、eCLIP 和 uvCLAP，用于鉴定活细胞中 RNA 结合蛋白（RBP）的交联位点。PAR-CLIP 采用 365 nm 紫外光照射并结合光活化核苷酸类似物，因此仅适用于培养中的活细胞；此外，核苷酸类似物掺入新合成的转录本中可能导致在 RNA 与蛋白质发生物理相互作用的区域产生偏倚23,24。在 iCLIP 中，仅在交联 RNA 片段的 3' 末端连接一个单一接头。逆转录（RT）后，通过分子内环化及重新线性化，再经聚合酶链式反应（PCR）扩增，可同时获得截短型和通读型的 cDNA25,26。然而，分子内环化的效率相对较低。尽管早期的 CLIP 方案需要使用放射性同位素标记交联 RNA，但紫外交联与亲和纯化技术（uvCLAP）通过严格的串联亲和纯化流程，无需依赖放射性标记27。然而，uvCLAP 仅限于可转染携带 3x FLAG-HBH 标签表达载体以进行串联亲和纯化的培养细胞。
在eCLIP中，首先在RNA的3'末端连接接头，随后进行逆转录（RT），接着以分子间模式在cDNA的3'末端连接接头。因此，eCLIP能够捕获所有截短和通读的cDNA28。此外，该方法在原理上既不受限于放射性标记，也不局限于使用细胞系，同时仍保持单核苷酸分辨率。
本文提供了一种适用于小鼠睾丸组织的eCLIP实验方案的逐步说明。简言之，该eCLIP流程起始于睾丸曲细精管的紫外交联，随后进行部分RNase消化，并利用特异性识别目标蛋白的抗体开展免疫沉淀。接着，对蛋白结合的RNA进行去磷酸化处理，并在其3'端连接接头序列。&#160;经过蛋白质凝胶电泳及转膜后，通过切割预期大小范围的膜区域来分离RNA。逆转录（RT）完成后，在cDNA的3'端连接DNA接头，随后进行PCR扩增。在高通量测序前对亚克隆进行筛选，作为文库质量控制步骤。该方案能够高效鉴定RNA结合蛋白（RBP）所结合的主要RNA种类，以两种在睾丸中表达的RNA解旋酶MOV10L1和MOV10为例证。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 MOV10&amp;nbsp; 抗体</td><td>Proteintech, 中国</td><td>10370-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 MOV10L1 抗体</td><td>Zheng et al.2010&lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;</td><td>多克隆抗血清 UP2175</td><td>由宾夕法尼亚大学 P. Jeremy Wang 实验室提供</td></tr><tr><td>HRP标记的山羊抗兔IgG&amp;nbsp;</td><td>ABclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>兔IgG</td><td>Beyotime，中国</td><td>A7016</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td>5242R</td><td></td></tr><tr><td>数字超声波破碎仪</td><td>BRANSON，美国</td><td>BBV12081048A</td><td>450 瓦特；50/60 赫兹</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Invitrogen，美国</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>迷你转印模块</td><td>Invitrogen，美国</td><td>B1000</td><td></td></tr><tr><td>小型凝胶电泳槽</td><td>Invitrogen，美国</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Eppendorf，德国汉堡</td><td>Thermomixer comfort&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨器，Dounce</td><td>PYREX，美国</td><td>1234F35</td><td>仅&amp;nbsp; 的 &quot;松散&quot; 本方案中使用研杵</td></tr><tr><td>专业标准 96 梯度</td><td>德国 Biometra</td><td>序列号：2604323</td><td></td></tr><tr><td>Tube Revolver&amp;nbsp;</td><td>美国</td><td>序列号：3406051</td><td></td></tr><tr><td>紫外光交联仪</td><td>UVP，美国</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC处理的培养皿</td><td>康宁，美国</td><td>430167</td><td>100 mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>管子</td><td>康宁，美国</td><td>430791</td><td>15 mL</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>AXYGEN，美国</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸性苯酚/氯仿/异戊醇&amp;nbsp;</td><td>Solarbio，中国</td><td>P1011</td><td>25:24:01</td></tr><tr><td>AffinityScript 酶</td><td>Agilent，美国</td><td>600107</td><td></td></tr><tr><td>抗氧化剂</td><td>Invitrogen，美国</td><td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>DH5&amp;alpha; 感受态细菌</td><td>美国赛默飞世尔科技公司</td><td>18265017</td><td>这些经济型细胞产生 &gt;1 × 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 转化子/&amp;micro;每50微克对照DNA &amp;micro;L反应。</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>Invitrogen，美国</td><td>10416014</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>DNTP100-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，美国</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>ECL 试剂</td><td>Vazyme，中国</td><td>E411-04</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen，美国</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Roche，美国</td><td>04693132001</td><td>加入新鲜的</td></tr><tr><td>Exo-SAP-IT</td><td>Affymetrix，美国</td><td>78201</td><td>PCR产物纯化试剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FastAP 酶</td><td>美国赛默飞世尔科技公司</td><td>EF0652</td><td></td></tr><tr><td>LDS 样品缓冲液</td><td>美国赛默飞世尔科技公司</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MetaPhor 琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>lonza，瑞士</td><td>50180</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen，美国</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>MiniElute 凝胶回收</td><td>QIAGEN，德国</td><td>28604</td><td>4 ℃下柱储存；缓冲液QG = 胶溶解缓冲液；缓冲液PE = 洗涤缓冲液（步骤14）</td></tr><tr><td>MyONE 硅烷化磁珠</td><td>Thermo Scientific，美国</td><td>37002D</td><td>核酸提取磁珠</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Invitrogen，美国</td><td>AM9759&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco，美国</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 蛋白凝胶</td><td>Invitrogen，美国</td><td>NP0336BOX</td><td>4%&amp;ndash;12%，1.5 mm，15孔</td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 缓冲液试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，美国</td><td>NP0050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco，美国</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>相锁定凝胶（PLG）重管&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>TIANGEN，中国</td><td>WM5-2302831</td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems，美国</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>NEB，新英格兰&amp;nbsp;</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 PCR预混液&amp;nbsp;</td><td>NEB，新英格兰&amp;nbsp;</td><td>M0492L</td><td></td></tr><tr><td>RLT缓冲液</td><td>德国 QIAGEN</td><td>79216</td><td>RNA纯化裂解缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RNA 纯化 &amp;amp; 浓缩仪-5 柱&amp;nbsp;</td><td>ZYMO RESEARCH，美国</td><td>R1016</td><td>RNA纯化与浓缩柱</td></tr><tr><td>RNase I&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen，美国</td><td>AM2295</td><td></td></tr><tr><td>RNase抑制剂</td><td>Promega，美国</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 DNase</td><td>Promega，美国</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>样品还原剂</td><td>Invitrogen，美国</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>SDS 溶液</td><td>Invitrogen，美国</td><td>15553027</td><td>10%</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>30970</td><td>避光</td></tr><tr><td>T4 PNK酶</td><td>NEB，新英格兰&amp;nbsp;</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA连接酶1高浓度</td><td>NEB，新英格兰&amp;nbsp;</td><td>M0437M</td><td></td></tr><tr><td>TA/Blunt-Zero 连接克隆混合液</td><td>Vazyme，中国</td><td>C601-01</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td>Invitrogen，美国</td><td>AM9863</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl缓冲液</td><td>Invitrogen，美国</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon Biotech，中国</td><td>A600198&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sangon Biotech，中国</td><td>A600560</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich，美国</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>X射线胶片</td><td>Caresteam，加拿大</td><td>6535876</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合rna的增强型交联免疫沉淀（eclip）方法

Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis

精子发生定义了哺乳动物雄性生殖细胞分化的一个高度有序的过程。在睾丸中，转录与翻译过程是分离的，这凸显了由RNA结合蛋白（RBPs）协调的基因表达转录后调控的重要性。为了阐明RNA结合蛋白的作用机制，可采用交联免疫沉淀（CLIP）技术来捕获其内源性的直接RNA靶标，并确定实际的相互作用位点。增强型CLIP（eCLIP）是一种新开发的方法，相较于传统的CLIP技术具有多项优势。然而，迄今为止eCLIP的应用仅限于细胞系，亟需拓展其应用范围。在此，我们采用eCLIP技术研究了小鼠睾丸中的两种已知RNA结合解旋酶MOV10和MOV10L1。结果表明，MOV10主要结合于mRNA的3'非翻译区（UTRs），而MOV10L1则选择性地结合Piwi相互作用RNA（piRNA）前体转录本。我们的eCLIP方法可通过亚克隆的小规模测序快速确定不同RNA结合蛋白所结合的主要RNA种类，从而评估文库质量是否合格，以决定是否进行深度测序。本研究为eCLIP技术在哺乳动物睾丸组织中的应用奠定了可行的基础。

eCLIP 实验流程及结果如图所示 图1, 图2, 图3, 图4小鼠通过二氧化碳安乐死，随后使用手术剪在下腹部做一小切口。图2A,B）。小鼠睾丸被取出后去白膜，研磨后再进行紫外交联（图 2C-I）。在睾丸组织中使用两种已知的RNA结合解旋酶的代表性eCLIP结果如图所示 图3 和 <stron...

本文介绍了一种eCLIP实验方案，用于鉴定睾丸中RNA结合蛋白候选分子的主要RNA靶标。

小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法

精子发生定义了哺乳动物雄性生殖细胞分化的一个高度有序的过程。在睾丸中，转录与翻译是分离的，……

RNA结合蛋白对细胞生理功能至关重要。尤为重要的是，RNA结合蛋白在精子发生过程中高度表达，并已被充分证实为在生殖细胞各个阶段发挥关键作用的转录后调控因子。鉴定其结合靶标对于阐明RNA结合蛋白的作用机制具有重要意义。本方案代表了eCLIP方法的一种改进应用，用于捕获内源性直接RNA靶标，并为在哺乳动物睾丸中开展eCLIP实验建立了可行的基础。该方法的主要优势在于无需使用放射性标记、耗时较短，并且由于使用大小匹配的输入样本作为背景对照，可获得更高的信噪比。最后，我们认为在深度测序之前进行小规模的亚克隆测序是有益的。演示该实验步骤的是我的同事Xu Qiushi。开始实验时，为每项免疫沉淀实验采集适量年龄小鼠的睾丸组织约100毫克。将组织置于预冷的PBS中。使用一对尖头镊子，轻轻去除白膜。向组织研磨器中加入三毫升冰浴 PBS，用松散的玻璃研杵通过温和的机械力将组织反复吹打。接着，将组织悬液转移至细胞培养皿中，并加入冰浴 PBS 至六毫升。快速振荡培养板，使液体均匀覆盖皿底。在冰上用254纳米波长、400毫焦/平方厘米的剂量对悬液进行三次交联。每次照射之间务必混匀悬液。然后，将悬液收集到15毫升的锥形管中，在4°C、1,200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于1毫升PBS中。随后，将悬液转移至1.5毫升离心管中。在 1,000 × g、4 °C 条件下离心两分钟，弃去上清液。首先，向一个洁净的离心管中每份样品加入 125 µL 蛋白 A 磁珠。将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。10 秒后，去除上清液，并用 1 毫升冰预冷的裂解缓冲液将磁珠洗涤两次。将磁珠重悬于含有 10 微克 eCLIP 抗体的 100 微升冷裂解缓冲液中。室温下旋转孵育管子 45 分钟。然后，用一毫升预冷的裂解缓冲液将磁珠洗涤两次。首先，将组织沉淀重悬于一毫升含有22微升50倍浓度无EDTA蛋白酶抑制剂混合物和11微升RNase抑制剂的预冷裂解缓冲液中。将样品置于冰上继续裂解15分钟。按照文本方案中所述，对每个样品进行超声处理。随后，向每根试管中加入4 µL DNase，并充分混匀。在37 °C条件下孵育10分钟，同时以1,200 rpm振荡。此后，加入10 µL稀释的RNase并充分混匀。在37 °C下以1,200 rpm振荡孵育5分钟。然后，在4 °C下以15,000 ×g离心20分钟，以澄清裂解液。小心收集上清液，并为RWB和RRI样品保留输入样品。首先，将一毫升裂解液加入已准备好的磁珠中，在4°C下旋转孵育两小时或过夜。随后，将样品置于磁力架上收集磁珠，并弃去上清液。用900微升高盐缓冲液将珠子洗涤两次，然后用900微升洗涤缓冲液再洗涤两次。接着，用500微升1×去磷酸化缓冲液洗涤珠子一次。首先弃去上清液，并使用细尖移液吸头去除任何残留液体。向每个样品中加入25 µL三端连接主混合液，用移液器轻轻吹打混匀。向每个样品中加入2.5 µL RNA接头X1A和2.5 µL RNA接头X1B。通过移液或轻弹管壁充分混匀。在25摄氏度下孵育75分钟，每隔10分钟轻轻振荡管子以混匀。用500 µL冷洗涤缓冲液洗涤磁珠一次。接着，用500 µL冷高盐缓冲液洗涤磁珠一次，然后再用500 µL冷洗涤缓冲液洗涤一次。将上述两次洗涤步骤各重复一次。使用磁力架分离磁珠，并用细尖移液枪头吸除残留液体。将磁珠重悬于100 µL预冷的洗涤缓冲液中，取20 µL转移至新的离心管中作为RWB样品。向剩余样品中加入 7.5 微升 4x LDS 上样缓冲液和 3 微升 10x 样品还原剂。在 70 摄氏度下孵育 10 分钟，同时以 1,200 转/分钟振荡。孵育结束后，将样品置于冰上冷却 1 分钟，然后在 4 摄氏度下以 1,000 × g 离心 1 分钟。对于RWB凝胶，将试管置于磁力架上，使蛋白洗脱液与磁珠分离。每个加样孔中加入15微升样品。接着，将500微升抗氧化剂加入500毫升1x SDS电泳缓冲液中。以200伏电压在1×SDS电泳缓冲液中电泳50分钟，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。在含有10%甲醇的1×转膜缓冲液中，以10伏电压将凝胶中的蛋白质-RNA复合物转移至硝酸纤维素膜上，转膜时间为70分钟。用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭RWB膜1小时。用 TBST 洗涤膜，然后在 TBST 中加入一抗，4 摄氏度孵育过夜。之后用 TBST 洗涤两次，每次洗涤持续 5 分钟。再在 TBST 中加入二抗，室温孵育 1 小时。然后，用 TBST 将膜洗涤三次。接着，将等体积的 ECL 缓冲液 A 与缓冲液 B 混合。将此混合液加入膜上，孵育一分钟。用塑料膜覆盖膜，并在室温下曝光于 X 射线胶片 2 至 3 分钟，随后显影胶片。本研究中，对成年野生型小鼠睾丸进行 MOV10 eCLIP 实验，使用 RNase I 处理交联裂解液，成功富集了分子量约为 114 千道尔顿的目标蛋白。对不同样本的 cDNA 进行 1:10 稀释后的 qPCR 结果显示，未交联样本的 RNA 回收率降低。观察发现，未交联组的 Ct 值通常比紫外交联组高出约五倍。此处展示了通过琼脂糖凝胶电泳进行 PCR 扩增和大小筛选的代表性结果。引物二聚体产物出现在约 140 个碱基对处。两个代表性亚克隆序列的 UCSC 基因组浏览器视图显示，与 MOV10 结合的 eCLIP 标签位于 Fto 基因的三端非翻译区（3′ UTR）内。3'非翻译区靶标的近似比例占75%，这与在HEK293细胞和睾丸中大多数MOV10靶标的研究结果一致。相比之下，MOV10L1结合的eCLIP标签被发现定位于piRNA簇内，表明MOV10L1靶向piRNA前体。piRNA前体靶标的近似比例占42%，这一结果反映了既往研究中观察到的趋势。使用40单位/毫升RNase I消化进行MOV10L1 eCLIP，可获得相对较多多于20个碱基对的序列。本文所述方案代表了eCLIP方法在生殖领域中的应用，该领域中关于RNA-蛋白质相互作用的知识仍较为匮乏。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

增强交联免疫沉淀 (eCLIP) 方法, 有效鉴定小鼠睾丸蛋白质结合 rna

RNA结合蛋白在转录本上的空间排布是转录后调控的关键决定因素。因此，我们开发了单核苷酸分辨率的紫外交联免疫沉淀技术（iCLIP），可实现RNA结合蛋白结合位点的精确全基因组定位。...

iCLIP——全转录组范围内单核苷酸分辨率的蛋白质-RNA 相互作用图谱绘制

通过RIP-Chip分离和鉴定RNA相关复合物的逐步实验方案。...

从细胞提取物中分离和鉴定核糖核蛋白复合物中mRNA、microRNA及蛋白质组分的RIP-Chip方法

本视频演示了增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法，用于鉴定小鼠睾丸中的RNA结合蛋白。eCLIP能够精确定位RNA结合蛋白（RBPs）与其靶RNA相互作用的结合位点。...

一种改进的交联免疫沉淀方法用于高效鉴定小鼠睾丸中与蛋白质结合的RNA

本文描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集的方法，用于分离在真核细胞中形成的特定同源核糖核蛋白复合物（RNP）。我们通过分离与逆转录病毒5'非翻译区结合的同源RNP（其组分包含DHX9/RNA解旋酶A）来展示该方法的适用性。...

利用寡核苷酸定向洗脱法从细胞中分离同源RNA-蛋白质复合物

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

本文描述了一种用于回收内源性形成的mRNA-蛋白质复合物的串联RNA分离流程（TRIP）。具体而言，首先在活体（in...

一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

本文介绍一种从哺乳动物细胞中富集内源性RNA结合位点或RNA:蛋白质（RNP）复合物的"足迹”的实验方案。该方法包括对RNP亚基进行两次免疫沉淀，因此被称为串联RNA免疫沉淀（RIPiT）。...

通过串联RNA免疫沉淀测序（RIPiT-Seq）鉴定RNA:蛋白质复合物的足迹

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方案，称为FbioCLIP-seq，通过FLAG-生物素串联纯化技术来确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶标。...

基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。...

一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于鉴定长链非编码 RNA...

一种基于紫外光的 ChIRP 方法用于可验证地鉴定与长链非编码 RNA 直接相互作用的蛋白质：从培养细胞到小鼠睾丸

了解增强交联免疫沉淀（eCLIP）方法在小鼠睾丸中鉴定RNA结合蛋白靶标的应用。该技术无放射性、省时高效，为研究生殖过程中的转录后调控机制提供了可靠工具。

小鼠睾丸中高效鉴定蛋白结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法

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