小鼠视网膜冷冻切片的制备用于免疫组织化学

小鼠视网膜解剖是一项非常精细的操作，因其眼球尺寸小、形状特殊，且视网膜组织极为脆弱。熟练操作至关重要，拥有一份提供高效方法和实用技巧的详细方案，是获得高质量视网膜解剖与切片的关键。我们提供一系列提示与建议，帮助研究人员避免常见错误，获取适用于免疫组织化学的高质量视网膜切片。

使用尾部电烙器标记已安乐死小鼠眼睛的颞部区域，轻轻触碰角膜，时间不超过一瞬间，使角膜轻微烧灼但避免穿孔。随后立即使用弯头Dumont 545镊子摘除小鼠眼球。将眼球置于含有1毫升4%多聚甲醛（PFA）与PBS混合液的1.5毫升冻存管中，冰上孵育15分钟。

然后，使用弯曲的Dumont 545镊子将固定好的眼球转移至盛有PBS的改良35毫米解剖培养皿中，并置于解剖显微镜下。用显微刀在角膜缘边界上方垂直于且紧邻烧灼标记处做一个小切口。将弯曲剪刀插入切口，沿角膜缘进行环形剪切，切除角膜。

然后，使用细小的Dumont 5号镊子去除角膜，取出晶状体，并轻柔地将其从眼球后部移开。玻璃体会随晶状体一同被带出，视网膜则显露为覆盖在眼球后杯内部的白色表面。将分离的眼杯在1 mL PBS中于室温下洗涤两次，每次10分钟。

为了对视杯进行冷冻保护，先将其在4°C条件下于15%蔗糖和PBS中平衡过夜，直至沉底。然后将视杯转移至30%蔗糖和PBS中，继续孵育2至3小时，直至沉底。将视杯置于OCT中，并放入10×10毫米的冷冻模具中包埋。

在解剖显微镜下，通过旋转眼球使烧灼标记位于上方，将眼球在冷冻模具中沿背腹轴方向摆放。视神经位于左侧，模具被切去的部分朝向右侧。为快速冷冻视网膜组织，将装有异戊烷的金属杯浸入液氮至杯高的三分之一处，然后将冷冻模具完全浸入异戊烷中，至少保持五分钟。

取出冷冻组织块，用铝箔包裹，并在零下80摄氏度下保存。使用记号笔或油性笔标记冷冻组织块，以记录其方向。将冷冻切片机温度调节至零下20至零下25摄氏度后，将含有包埋眼杯的模具放入其中，并使其在冷冻切片机内平衡至设定温度，持续一小时。

将组织块按背腹方向安装到冰冻切片机中，开始连续切取厚度为10微米的切片。小心地将视网膜切片置于已标注并编号的载玻片上，随后存放于−20摄氏度或−80摄氏度的切片盒中，直至进行免疫染色。在视网膜切片上使用针对视紫红质（光感受器标志物）、谷氨酸脱羧酶65（GAD65，无长突细胞标志物）、谷氨酰胺合成酶（Müller细胞标志物）以及钙结合蛋白（calbindin，水平细胞标志物）的抗体进行免疫组织化学染色。

结果表明，与采用另一种方案获得的低质量视网膜切片相比，本方案所获得的视网膜切片质量高且结构保存良好。富含视紫红质的内节和外节保持垂直且完整，与上方的视网膜色素上皮层几乎无分离。中间神经元（如Gad65阳性的无长突细胞）在内核层和内丛状层中仍保持正常的分层分布。

此外，Müller细胞保持良好，其胞体在从神经节细胞层延伸至外核层的胞质突起中排列整齐。内核层与外丛状层交界处可见形态清晰的水平细胞。标记眼球的上方区域，并在包埋过程中保持方向性，这一点非常重要。

始终在通风橱中使用适当的个人防护装备配制多聚甲醛。