生物层干涉测量(BLI)在转录中研究蛋白质-蛋白质相互作用的应用

转录因子(TFs)与RNA聚合酶的相互作用通常使用下拉测定进行研究。我们应用生物层干涉测量(BLI)技术来描述GrgA与衣原RNA聚合酶的相互作用。与下拉检测相比,BLI可检测实时关联和解结,具有更高的灵敏度,并且具有高度定量性。

转录中的蛋白质-蛋白质相互作用传统上是使用波透析研究。然而，波尔透析是纯粹的定量。我们使用生物层干涉测量，或BLI，来克服这个问题。

与Por dan相比，BLI检测粘合伙伴之间的实时关联和分离。它还生成定量动力学参数，这些参数表示相互作用机制。BLI 技术听起来可能令人生畏，但学习使用这项技术并不难，必须访问 BLI 仪器和相关软件。

此视频将使您能够轻松适应 BLI 技术。大约在测定开始前10分钟，移液器200微升的BLI缓冲液进入PCR管。用戴手套的手握住生物传感器的宽部分，从原始包装中取出镍NTA生物传感器。

将生物传感器放在PCR管上，使只有生物传感器的玻璃尖端浸入BLI缓冲液中。保持生物传感器尖端淹没至少10分钟，以确保充分水化。打开闪电战机器。

确保机器通过机器背面的 USB 数据输出端口连接到计算机。在计算机上，打开关联的软件并单击屏幕左侧的高级动力学。在软件中，在各自的标题下键入有关实验的所有适当信息。

单击生物传感器类型，从下拉菜单中选择镍 NTA。每个步骤的持续时间可以根据需要从默认值更改。为了获得最佳结果，初始基线和基线至少使用 30 秒，关联和分离使用至少 30 秒。

从 PCR 管上取出水合镍 NTA 生物传感器，然后通过将生物传感器的宽部分滑到安装上将其贴在机器上的生物传感器支架上。将 0.5 毫升黑色微离心管放入机器的管架中，将 400 微升 BLI 缓冲液移液器放入其中。关闭机器盖，使生物传感器尖端浸入微离心管中的缓冲液中。

单击软件上的"下一步"开始记录初始基线。完成初始基线步骤记录后，打开机器盖。向右移动滑块，使放置支架位于黑色箭头前面。

将带贴有 His 标记的配体移出四个微升，然后关闭机器盖，机器盖将自动开始记录装载步骤。装载步骤完成记录后，打开机器盖。向左移动滑块，使管架再次位于黑色箭头的前面。

合上机器盖，确保生物传感器尖端浸入管架中管的 BLI 缓冲液中。机器和软件将自动开始记录基线步骤。完成基线步骤记录后，打开机器盖。

取出落架并通过移液清除任何蛋白质并用双脱水冲洗，总共五次进行清洁。上次洗涤后，使用纸巾擦拭清洁落架表面。将落架重新更换到机器上。

将机器上的滑块向右移动，使拖放架再次位于黑色箭头的前面。将四个微升的滴答机解入跌落架，并关闭机器盖，机器的盖将自动开始记录关联步骤。关联步骤完成录制后，打开机器的盖。

将机器上的滑块向右移动，使管架再次位于黑色箭头前面并关闭机器盖，该盖将自动开始记录分离步骤。分离步骤完成记录后，打开机器盖并拆下落架和管架。用双脱水彻底冲洗，洗去任何蛋白质。

拆下生物传感器并安全地丢弃它。使用不同的分析物浓度对相同的配体分析物对重复这些步骤。完成所有运行后，单击屏幕左侧的"文件"和"保存实验"来保存软件上的数据。

在"运行数据"标题下，选择"步进校正"和"一对一拟合"，然后单击"分析"以生成动能数据。要将定量数据提取到工作表并生成图形，请单击"导出到 CSV"，然后将记录的数据另存为 CSV 文件。使用电子表格软件打开 CSV 文件。

全长GgA由288个氨基酸组成。如图所示，28个氨基酸中间区域直接结合西格玛28。在这里，标有结束终端 His-tag 的中间区域用作配体，它首先固定在镍 NTA 生物传感器的尖端。

显示三种不同分析物浓度的实验记录，每个实验在配体结合前 30 秒开始，并在最后一次洗涤开始两分钟后结束。在删除前两个阶段的值并重置基线之后，将显示配体分析体关联和分离的增强可视化效果。在从生物传感器上清洗未绑定和终端 His 标记 GrgA 138 至 165 后，在添加西格玛 28 后记录了与分析物的实时关联。

最后，在洗涤后记录了实时分离。在BLI测定之前，甘油从配体和分析物中去除。我们建议在透析后立即进行BLI，如本文中所讨论的。

在描述转录中蛋白质-蛋白质与BLI的相互作用特征后，可以研究这种相互作用如何影响转录启动、伸长和终止。