Name: 生物层干涉测量(BLI)在转录中研究蛋白质-蛋白质相互作用的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学习生物层干涉测量技术，实时检测GrgA与衣原体RNA聚合酶的蛋白质相互作用。该方法提供定量动力学参数，揭示转录调控机制，灵敏度高于传统pulldown实验。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由美国国立卫生研究院（资助号：AI122034 和 AI140167）以及新泽西健康基金会（资助号：PC 20-18）提供支持。

1. 蛋白质的制备
<ol>
	<li>使用适当截留分子量的透析袋，在 4 ˚C 条件下，将每种用于 BLI 检测的蛋白质（包括 His 标签配体和分析物）在 1,000 倍体积的 BLI 缓冲液（25 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.1 mM EDTA，10 mM MgCl2，0.1 mM DTT，pH 8.0，预冷至 4 ˚C）中透析 4 小时。 
	注意：BLI 检测要求配体浓度足以饱和生物传感器上的结合位点，同时要求分析物高度纯化，以便准确知晓与配体发生反应的分析物的摩尔浓度。His 标签和 Strep 标签蛋白的表达与纯化方法不在本文讨论范围内，可参考先前发表的文献14,15。尽管该系统不要求配体处于高度纯化状态，但仍必须将未纯化的配体也透析至 BLI 缓冲液中，以最大限度减少检测过程中因缓冲液变化引起的白光干涉图样的偏移。</li>
	<li>更换为新鲜的 BLI 缓冲液，继续透析 4 小时。</li>
</ol>
2. 生物传感器的水合与检测设置
<ol>
	<li>在开始检测前约 10 分钟，用移液器将 200 µL BLI 缓冲液加入 PCR 管中。</li>
	<li>戴上手套，用手握住生物传感器较宽的部分，从原始包装中取出 Ni-NTA 生物传感器。</li>
	<li>将生物传感器置于 PCR 管上方，使仅其玻璃尖端浸入 BLI 缓冲液中。</li>
	<li>保持生物传感器尖端浸没至少 10 分钟，以确保充分水合。
	<ol>
		<li>确认在上述步骤中，Ni-NTA 生物传感器的玻璃尖端仅接触 BLI 缓冲液，未接触其他任何物体。 
		注意：本方案使用 Ni-NTA 生物传感器与带 His 标签的配体联用。如有需要，在以下情况可改用 SA-链霉亲和素生物传感器与生物素化配体联用：(i) 配体和分析物均带有 His 标签，或 (ii) 两者均无 His 标签。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开 BLItz 仪器电源。</li>
	<li>确保仪器通过其背面的 USB 数据输出端口与计算机连接。</li>
	<li>在计算机上打开配套软件（例如 BLItz Pro），然后点击屏幕左侧的 Advanced Kinetics（高级动力学）。</li>
	<li>在软件中，根据相应标题输入实验的所有相关信息（包括实验名称、描述、样品编号和蛋白质浓度）。</li>
	<li>点击 Biosensor Type（生物传感器类型），并在下拉菜单中选择 Ni-NTA。
	<ol>
		<li>在 Run Settings（运行设置）标题下，确认摇床设置为 Enable（启用）。</li>
		<li>在 Step Type List（步骤类型列表）标题下，确认列出了 5 个项目：Initial Baseline（初始基线）、Loading（负载）、Baseline（基线）、Association（结合）和 Dissociation（解离）。 
		注意：各步骤持续时间可根据需要调整默认值。为获得最佳结果，建议 Initial Baseline 和 Baseline 时间至少为 30 秒，Association 和 Dissociation 时间至少为 120 秒。Loading 步骤的持续时间（120 至 240 秒之间）取决于配体的浓度及其 His 表位标签与 Ni-NTA 生物传感器之间的亲和力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将水合后的 Ni-NTA 生物传感器从 PCR 管中取出，并通过将生物传感器较宽部分滑入仪器上的传感器支架中将其固定。 
	注意：实验过程中切勿让生物传感器干燥。</li>
	<li>将一个 0.5 mL 黑色微量离心管放入仪器的管架中，并加入 400 µL BLI 缓冲液。</li>
	<li>确认仪器滑块位置正确，使管架位于仪器上黑色箭头前方。</li>
	<li>关闭仪器盖子，使生物传感器尖端浸入微量离心管中的缓冲液中。</li>
	<li>在软件中点击 Next（下一步）以开始记录初始基线。</li>
</ol>
3. 配体在生物传感器上的加载
<ol>
	<li>初始基线步骤记录完成后，打开仪器的盖子。</li>
	<li>将滑块向右移动，使液滴架（而非试管架）位于黑色箭头前方。</li>
	<li>用移液器将 4 µL 透析后的 His 标签配体（来自步骤 1.1）加到液滴架上，然后关闭仪器盖子。 
	注意：所用配体的最佳浓度可能因不同蛋白质而异。通常浓度在 1.0 至 2.0 mg/mL 之间足以在 240 秒内使生物传感器尖端的 NTA 位点达到饱和。</li>
	<li>在软件中点击 下一步 以开始加载。</li>
</ol>
4. 洗去多余的配体
<ol>
	<li>加载步骤记录完成后，打开仪器的盖子。</li>
	<li>将滑块向左移动，使试管架再次位于黑色箭头前方。</li>
	<li>关闭仪器盖子，并确保生物传感器尖端浸入试管架中试管内的BLI缓冲液中。</li>
	<li>在软件上再次点击下一步，开始记录基线。</li>
</ol>
5. 分析物与配体的结合
<ol>
	<li>基线步骤记录完成后，打开仪器的盖子。</li>
	<li>取下液滴架，用移液器吸除残留的蛋白质，并用去离子水（ddH2O）冲洗，共重复5次，以清洁液滴架。
	<ol>
		<li>清洗后，用擦拭纸清洁液滴架表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将清洁后的液滴架重新放回仪器上。</li>
	<li>将仪器上的滑块向右移动，使液滴架再次位于黑色箭头前方。</li>
	<li>用移液器将4 µL透析后的分析物（来自步骤1.1）加到液滴架上，然后关闭仪器盖子。</li>
	<li>在软件界面上点击 下一步，开始结合阶段。</li>
</ol>
6. 分析物与配体的解离
<ol>
	<li>关联步骤记录完成后，打开仪器的盖子。</li>
	<li>将仪器上的滑块向右移动，使管架再次位于黑色箭头前方。</li>
	<li>在软件中点击 下一步 以开始解离步骤。</li>
	<li>解离步骤记录完成后，打开仪器的盖子。</li>
	<li>取下液滴架和管架。</li>
	<li>用 ddH2O 充分冲洗两者，以去除所有蛋白质残留。</li>
	<li>取下生物传感器并安全弃置。</li>
</ol>
7. 使用不同浓度重复相互作用
<ol>
	<li>对相同的配体-分析物组合，使用不同的分析物浓度重复步骤 2-7。 
	注意：分析物的浓度可能需要在多次运行中进行调整，才能获得最佳结果。根据我们的经验，通常以 75 nM 为起始浓度，采用 1:5:10 的分析物浓度梯度比例即可满足要求。</li>
</ol>
8. 使用软件分析数据
<ol>
	<li>所有运行结束后，通过点击屏幕左侧的 文件，然后选择 另存实验为，在软件中保存数据。</li>
	<li>在“运行数据”标题下，选择 步骤校正与拟合 (1:1)，然后点击 分析 以生成动力学数据。</li>
	<li>要将定量数据导出至工作表并生成图表，请点击 导出为 CSV，并将记录的数据保存为 .csv 文件。使用电子表格软件打开该 .csv 文件。
	<ol>
		<li>为了最有效地展示结合与解离动力学，应删除基线步骤之前的所有数据点，并将后续所有数据点相对于最终基线值进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Vvedenskaya, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+RNA+polymerase+and+the+core+recognition+element+are+a+determinant+of+transcription+start+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interactions between RNA polymerase and the core recognition element are a determinant of transcription start site selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 113 (21), E2899-E2905 (2016).</li>
<li>Feklistov, A., Sharon, B. D., Darst, S. A., Gross, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+sigma+factors%3A+a+historical%2C+structural%2C+and+genomic+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial sigma factors: a historical, structural, and genomic perspective.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 357-376 (2014).</li>
<li>Visweswariah, S. S., Busby, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+bacterial+transcription+factors%3A+how+proteins+take+on+new+tasks%2C+but+do+not+always+stop+doing+the+old+ones%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evolution of bacterial transcription factors: how proteins take on new tasks, but do not always stop doing the old ones.</a> Trends in Microbiology. 23 (8), 463-467 (2015).</li>
<li>Taylor, H. R., Burton, M. J., Haddad, D., West, S., Wright, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trachoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Trachoma.</a> Lancet. 384 (9960), 2142-2152 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+incidence+and+prevalence+of+selected+curable+sexually+transmitted+infections%3A+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+and+Reproductive+Health+Matters%22%5BJournal%5D)">Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections: 2008.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, (2012).</li>
<li>Schmidt, S. M., Muller, C. E., Mahner, B., Wiersbitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+rate+of+persistence+and+respiratory+tract+symptoms+of+Chlamydia+pneumoniae+infection+in+1211+kindergarten+and+school+age+children%5BTitle%5D)+AND+%22The+Pediatric+Infectious+Disease+Journal%22%5BJournal%5D)">Prevalence, rate of persistence and respiratory tract symptoms of Chlamydia pneumoniae infection in 1211 kindergarten and school age children.</a> The Pediatric Infectious Disease Journal. 21 (8), 758-762 (2002).</li>
<li>De Puysseleyr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+presence+and+zoonotic+transmission+of+Chlamydia+suis+in+a+pig+slaughterhouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the presence and zoonotic transmission of Chlamydia suis in a pig slaughterhouse.</a> BMC Infectious Diseases. 14 (560), (2014).</li>
<li>Hulin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+preference+and+zoonotic+potential+of+Chlamydia+psittaci+and+C.+gallinacea+in+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Host preference and zoonotic potential of Chlamydia psittaci and C. gallinacea in poultry.</a> Pathogens and Disease. 73 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Belland, R., Ojcius, D. M., Byrne, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+of+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia.</a> Nature Review of Microbiol. 2 (7), 530-531 (2004).</li>
<li>Belland, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Nicholson, T. L., Olinger, L., Chong, K., Schoolnik, G., Stephens, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+stage-specific+gene+regulation+during+the+developmental+cycle+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Global stage-specific gene regulation during the developmental cycle of Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 185 (10), 3179-3189 (2003).</li>
<li>Tan, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTan%2C+M+%22Intracellular+pathogens+I%3A+Chlamydiales%22">Intracellular pathogens I: Chlamydiales</a>. Tan, M., Bavoil , P. M. , ASM Press. 149-169 (2012).</li>
<li>Domman, D., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Following+the+Footsteps+of+Chlamydial+Gene+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Following the Footsteps of Chlamydial Gene Regulation.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (12), 3035-3046 (2015).</li>
<li>Bao, X., Nickels, B. E., Fan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+protein+GrgA+activates+transcription+by+contacting+the+nonconserved+region+of+%CF%8366%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 109 (42), 16870-16875 (2012).</li>
<li>Desai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+GrgA+in+regulation+of+%CF%8328-dependent+transcription+in+the+obligate+intracellular+bacterial+pathogen+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for GrgA in regulation of σ28-dependent transcription in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis.</a> Journal of Bacteriology. 200 (20), (2018).</li>
<li>Joy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-Free+Detection+of+Biomolecular+Interactions+Using+BioLayer+Interferometry+for+Kinetic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Label-Free Detection of Biomolecular Interactions Using BioLayer Interferometry for Kinetic Characterization.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Analytical Biochemistry. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Stolz, L., Granzow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+and+its+use+in+biomolecular+interaction+analysis+%28BIA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance and its use in biomolecular interaction analysis (BIA).</a> Current Opinion in Structural Biology. 5 (5), 699-705 (1995).</li>
<li>Nelson, R. W., Krone, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+surface+plasmon+resonance+biomolecular+interaction+analysis+mass+spectrometry+%28BIA%2FMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS).</a> Journal of Molecular Recognition. 12 (2), 77-93 (1999).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Analytical Biochemistry. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Visentin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+non-specific+binding+to+measure+the+active+concentration+and+kinetics+of+serum+anti-HLA+antibodies+by+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Overcoming non-specific binding to measure the active concentration and kinetics of serum anti-HLA antibodies by surface plasmon resonance.</a> Biosensors and Bioelectronics. 117, 191-200 (2018).</li>
<li>Baba, A., Taranekar, P., Ponnapati, R. R., Knoll, W., Advincula, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+surface+plasmon+resonance+and+waveguide-enhanced+glucose+biosensing+with+N-alkylaminated+polypyrrole%2Fglucose+oxidase+multilayers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Electrochemical surface plasmon resonance and waveguide-enhanced glucose biosensing with N-alkylaminated polypyrrole/glucose oxidase multilayers.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 2 (8), 2347-2354 (2010).</li>
<li>Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Surface+Plasmon+Resonance+to+Quantitatively+Assess+Lipid-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Using Surface Plasmon Resonance to Quantitatively Assess Lipid-Protein Interactions.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1376, 141-153 (2016).</li>
<li>Wang, D. S., Fan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Surface+Plasmon+Resonance+Sensors%3A+From+Principles+to+Point-of-Care+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Surface Plasmon Resonance Sensors: From Principles to Point-of-Care Applications.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 16 (8), 1175(2016).</li>
<li>Shah, N. B., Duncan, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-layer+interferometry+for+measuring+kinetics+of+protein-protein+interactions+and+allosteric+ligand+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (84), e51383(2014).</li>
<li>Wartchow, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor-based+small+molecule+fragment+screening+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer-Aided+Molecular+Design%22%5BJournal%5D)">Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 25 (7), 669-676 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

蛋白质-蛋白质相互作用对于转录及其他生物学过程的调控至关重要。这类相互作用通常通过下拉实验进行研究。尽管下拉实验操作相对简便，但其定量性较差，且可能无法检测到较弱但具有生物学意义的相互作用。相比之下，生物膜干涉技术（BLI）能够实时检测配体与分析物之间的结合与解离过程，从而提供结合速率常数、解离速率常数以及总体亲和力。
与下拉实验相比，BLI 实验具有更高的灵敏度。例如，GrgA-σ28 相互作用可通过 BLI 在较低的纳摩尔浓度下检测到分析物，而下拉实验则无法实现（未发表数据）。与下拉实验不同，BLI 不依赖检测抗体，而检测抗体可能会显著影响灵敏度。
更重要的是，BLI 分析能够提供蛋白质间相互作用的机制性见解，而下拉实验则无法做到这一点。σ28 与不同 GrgA 构建体之间的相互作用即为一例。与 NH-GrgA 相比，NH-GrgAΔ138-165 和 NH-GrgA138-165 在结合 σ28 时的 ka</...

转录是以DNA为模板生成RNA分子的过程，是基因表达的第一步。细菌的RNA合成始于RNA聚合酶（RNAP）全酶与特定启动子的结合1,2。RNAP全酶（RNAPholo）由一个多亚基的催化核心（RNAPcore）和一个σ因子组成，其中σ因子负责识别启动子序列。转录激活因子和阻遏因子统称为转录因子（TFs），通过结合RNAP核心组分、σ因子和/或DNA来调控基因表达。根据生物体的不同，其基因组中可能有相当一部分基因编码转录因子，以响应生理需求和环境信号来调节转录过程3。
Chlamydia 是一种专性细胞内寄生细菌，可导致人类和动物多种疾病4,5,6,7,8。例如，Chlamydia trachomatis 全球范围内被认为是人类最主要的性传播病原体之一，也是部分发展中国家致盲的主要原因4,5。Chlamydia 具有独特的生活周期，其特征是两种交替存在的细胞形态：原体（elementary body, EB）和网状体（reticulate body, RB）9。EB 能在细胞外环境中存活，但不能增殖；EB 通过内吞作用进入宿主细胞，并在接种后数小时内于宿主细胞质的空泡中分化为体积更大的 RB。RB 不再具有感染性，通过二分裂方式进行增殖。大约在感染后 20 小时，RB 开始重新分化为 EB，并于感染后 30–70 小时左右从宿主细胞中释放出来。
衣原体发育周期的进程由转录过程调控。在衣原体近1000个基因中，绝大多数在中期（即网状体RB活跃复制阶段）表达；而在原体EB进入宿主细胞后，仅有少量基因被转录，以启动EB向RB的转化；另有一小部分基因则在后期被转录或转录水平上升，以促进RB向EB的分化10,11。
沙眼衣原体基因组编码三种σ因子，即σ66、σ28和σ54。其中σ66相当于大肠杆菌（E. coli）及其他细菌中的管家型σ70因子，负责识别早期和中期基因以及部分晚期基因的启动子；而σ28和σ54则参与某些晚期基因的转录。目前已知多个基因同时含有依赖σ66的启动子和依赖σ28的启动子12。
尽管衣原体具有复杂的发育周期，但在其体内发现的转录因子数量却很少13GrgA（先前注释为假设蛋白CT504）在 C. trachomatis 血清型 D 和 CTL0766 在 C. trachomatis L2）是一种 沙眼衣原体-特异性TF最初被识别为σ的激活因子66-依赖基因14亲和沉淀实验表明，GrgA通过结合σ来激活它们的转录66 以及DNA。有趣的是，后续研究发现GrgA也能与σ共沉淀28，并从σ启动转录28-依赖型启动子 体外15. 为了研究GrgA对σ的亲和力是否相似或不同66 和 σ28，我们转而采用BLI。BLI实验表明，GrgA与σ相互作用66 比与σ的亲和力高30倍28，表明 GrgA 可能在 σ 中发挥不同的作用66依赖性转录和σ28依赖性转录15.
BLI 通过检测从生物传感器尖端固定化蛋白层反射的白光干涉图样，并将其与内部参考层的干涉图样进行比较，从而实现检测16。通过对这两种干涉图样的分析，BLI 能够提供有关结合到生物传感器尖端的蛋白量的有价值且实时的信息。固定在生物传感器尖端的蛋白被称为配体，通常借助常见的抗体或表位标签（例如多聚组氨酸标签或多聚生物素标签）进行固定，这些标签对生物传感器尖端上的相应颗粒（如 NTA 或链霉亲和素）具有亲和力。当第二种蛋白（称为分析物）与生物传感器尖端的配体结合时，会引起生物传感器光学密度的变化，从而导致干涉图样发生变化。通过在不同浓度的分析物条件下重复实验，BLI 不仅可提供配体与分析物之间相互作用的定性信息，还可提供定量的亲和力数据16。
据我们所知，我们是首次采用BLI技术来表征转录过程中蛋白质-蛋白质相互作用的研究者15。在本研究中，我们证明了一个先前被发现对σ28结合必需的GrgA片段确实介导了该结合反应。本文重点介绍BLI实验的操作步骤、BLI结合动力学图谱的生成以及相关动力学参数的获取。本文未涉及配体和分析物的制备（及纯化）方法。

<table><tbody><tr><td>BLItz 仪器</td><td>ForteBio</td><td>45-5000</td><td></td></tr><tr><td>透析管 cellulose 膜</td><td>MilliporeSigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>Dip and Read Ni-NTA 生物传感器托盘</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td>即用型Ni-NTA生物传感器用于检测多聚组氨酸标签蛋白</td></tr><tr><td>滴液架</td><td>ForteBio</td><td>45-5004</td><td></td></tr><tr><td>PCR管（0.2 mL）</td><td>Thomas Scientific</td><td>CLS6571</td><td></td></tr><tr><td>微型离心管（黑色）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>03-391-166</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MilliporeSigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T095100</td><td></td></tr></tbody></table>

应用生物层干涉技术（bli）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

一种转录因子&#160;转录因子（TF）是一种通过与RNA聚合酶、其他转录因子和/或模板DNA相互作用来调控基因表达的蛋白质。GrgA是一种新型转录激活因子，仅存在于专性胞内细菌病原体中 沙眼衣原体 使用亲和 beads 进行的蛋白质下拉实验表明，GrgA 结合两种 σ 因子，即 σ66 和 σ28，可识别在不同发育阶段对基因产物需求各异的启动子集合。我们利用BLI技术对这些相互作用进行了验证和进一步表征。相较于pull-down实验，BLI具有多项优势：1）可实时监测结合伙伴之间的结合与解离过程；2）可获得定量的动力学参数；3）能够检测到pull-down实验常无法捕获的结合事件。这些特性使我们得以推断GrgA在基因表达调控中的生理功能 沙眼衣原体以及可能的详细相互作用机制. 我们预计，这种相对经济的技术在研究转录及其他生物过程方面将具有极高的应用价值。

通过BLI实验，我们先前已证实GrgA与σ的结合28 依赖于GrgA蛋白的28个氨基酸组成的中间区域（残基138-165）15因此，与N端带有His标签的全长GrgA（NH-GrgA）相比，缺失该区域的GrgA截短突变体（NH-GrgAΔ138-165）表现出结合速率降低和解离速率升高，导致整体亲和力下降300万倍（表1）。在此，我们证明该中间区域可直接结合σ28 在缺乏GrgA蛋白其余部分的情况下。在这些实验中，将N端带有His标签的中间区域（NH-GrgA138-165）用作配体，首先将其固定于Ni-NTA生物传感器的探针尖端图1A）。在洗去生物传感器上未结合的NH-GrgA138-165后，与分析物σ进行实时结合反应28 在加入σ后记录28最后，记录洗脱后的实时解离过程。图中显示了三种不同分析物浓度的实验记录，记录时间从配体结合前30秒开始，至洗脱开始后2分钟结束。 <strong class="xfig...

转录因子（TF）与RNA聚合酶的相互作用通常通过下拉实验进行研究。我们采用生物层干涉技术（BLI）来表征GrgA与衣原体RNA聚合酶之间的相互作用。与下拉实验相比，BLI能够检测实时的结合与解离过程，具有更高的灵敏度，并且定量能力更强。

应用生物层干涉技术（BLI）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用

转录因子（TF）是一类通过与RNA聚合酶、其他转录因子和/或模板DNA相互作用来调控基因表达的蛋白质。GrgA

转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用传统上使用透析法进行研究。然而，透析法仅能提供定量信息。我们采用生物膜干涉技术（biolayer interferometry, BLI）来克服这一局限。与Por dan相比，BLI可检测结合伙伴之间的实时结合与解离过程，还能生成定量的动力学参数，这些参数可反映相互作用机制。BLI技术听起来可能令人望而生畏，但实际上并不难掌握。要使用该技术，只需具备BLI仪器及配套软件的使用权限即可。本视频将帮助您轻松掌握BLI技术。在开始检测前约10分钟，用移液器将200微升BLI缓冲液加入PCR管中。戴上手套，用手握住生物传感器较宽的部分，从原始包装中取出一个镍NTA生物传感器。将生物传感器置于 PCR 管上方，使生物传感器的玻璃尖端浸入 BLI 缓冲液中。保持传感器尖端浸没至少 10 分钟，以确保充分水化。开启 Blitz 仪器。确保仪器通过其背面的USB数据输出端口连接到计算机。在计算机上打开配套软件，然后点击屏幕左侧的“Advanced Kinetics”（高级动力学）选项。在软件中，根据各个标题，在对应的栏目下输入实验的所有相关信息。单击“生物传感器类型”，然后从下拉菜单中选择镍 NTA。各步骤的持续时间可根据需要从默认值进行修改。为获得最佳结果，初始基线和基线阶段至少使用 30 秒，结合和解离阶段使用 120 秒。从PCR管中取出水合的镍NTA生物传感器，并通过将传感器较宽的一端滑入仪器的传感器支架上，将其固定在仪器的传感器安装位置。将一个0.5毫升黑色微量离心管放入仪器的管架中，并用移液器向其中加入400微升BLI缓冲液。关闭仪器盖子，使生物传感器的尖端浸入微量离心管的缓冲液中。在软件中点击“下一步”以开始记录初始基线。初始基线步骤记录完成后，打开仪器的盖子。将滑块向右移动，使液滴支架位于黑色箭头前方。用移液器吸取4 µL透析后的His标签配体，滴加到液滴支架上，然后关闭仪器盖子，仪器将自动开始记录上样步骤。上样步骤记录完成后，打开仪器盖子。将滑块向左移动，使管架再次位于黑色箭头前方。关闭仪器盖子，并确保生物传感器尖端浸入试管架中试管内的BLI缓冲液。仪器和软件将自动开始记录基线步骤。基线步骤记录完成后，打开仪器盖子。取下液滴架，用移液枪吸出其中的蛋白质溶液，并用双蒸水冲洗，共重复五次。最后一次清洗后，用擦镜纸擦拭液滴架表面。将液滴架重新放回仪器上。将仪器上的滑块向右移动，使液滴支架再次位于黑色箭头前方。用移液器将4微升透析后的分析物加到液滴支架上，然后关闭仪器盖子，仪器将自动开始记录结合阶段。结合阶段记录完成后，打开仪器盖子。将仪器上的滑块向右移动，使试管架再次位于黑色箭头前方，然后合上仪器盖子，仪器将自动开始记录解离步骤。解离步骤记录完成后，打开仪器盖子，取下液滴架和试管架。用双蒸去离子水彻底冲洗两者，以洗去任何残留的蛋白质。取出生物传感器并妥善丢弃。使用不同的分析物浓度，对相同的配体-分析物组合重复上述步骤。所有运行结束后，点击屏幕左侧的“文件”和“另存实验”以保存软件中的数据。在“运行数据”标题下，选择“步进校正”和“一对一拟合”，然后点击“分析”以生成动力学数据。要将定量数据导出到工作表并生成图表，请点击“导出为CSV”，并将记录的数据保存为CSV文件。使用电子表格软件打开该CSV文件。全长GrgA由288个氨基酸组成。如图所示，其中一段28个氨基酸的中间区域可直接与Sigma 28结合。此处使用带有C端His标签的中间区域作为配体，首先将其固定在镍NTA生物传感器的探针末端。展示了三种不同分析物浓度的实验记录，每种记录均从配体结合前30秒开始，至最后一次洗涤开始后两分钟结束。在去除前两个阶段的数据点并重置基线后，可更清晰地观察到配体与分析物的结合与解离过程。在洗去未结合的以及带有末端His标签的GrgA 138至165后，加入Sigma 28，实时记录其与分析物的结合过程。最后，在洗涤后记录实时解离过程。在进行BLI实验前，需从配体和分析物中去除甘油。如文中所述，我们建议在透析后尽快进行BLI实验。利用BLI对转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用进行表征后，可以进一步研究该相互作用如何影响转录的起始、延伸和/或终止。

application-biolayer-interferometry-bli-for-studying-protein-protein

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

生物层干涉测量(BLI)在转录中研究蛋白质-蛋白质相互作用的应用

在本视频中，我们演示了生物层干涉技术（BLI），用于实时检测配体与目标分析物之间的分子间相互作用。BLI通过测量白光从生物传感器表面固定化配体层反射后产生的干涉图样变化，来监测溶液中分析物与配体相互作用时所引起的变化。...

生物层干涉技术检测配体与分析物之间的相互作用

本文所述方案介绍了利用生物膜干涉技术（Bio-layer...

生物层干涉技术用于测定蛋白质-蛋白质相互作用动力学及变构配体效应

本方案描述了纯化的hEAG1离子通道蛋白与小分子脂质配体磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）之间的相互作用。实验结果表明，生物膜干涉技术（BLI）可能成为一种用于新型小分子离子通道配体筛选的潜在方法。...

通过生物层干涉技术检测离子通道蛋白与小分子相互作用动力学

本文介绍了一种利用生物膜干涉技术（BLI）监测炭疽毒素组装与解聚过程的实验方案。在生物传感器表面完成毒素复合物的组装与解聚后，将大分子蛋白复合物从传感器表面释放，进而通过电子显微镜和质谱技术分别对其进行可视化观察及组分鉴定。...

利用质谱和电子显微镜分析在生物层干涉技术生物传感器上组装并释放的动态蛋白质复合物

本文介绍了一种改良的CLIP-seq方案，称为FbioCLIP-seq，通过FLAG-生物素串联纯化技术来确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶标。...

基于FLAG-生物素串联纯化的交联与免疫沉淀法进行全转录组蛋白质-RNA相互作用分析

本文介绍了一种利用基于链霉亲和素的生物层干涉技术（BLI）系统研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。文中概述了使用基本或高级结合动力学方法测定相互作用的平衡结合亲和力（KD）所需的关键步骤和注意事项。...

利用基于链霉亲和素的生物膜干涉技术分析DNA-蛋白质相互作用

蛋白质相互作用是细胞功能的核心。通常使用量热法和光谱技术来表征这些相互作用。本文中，我们描述了荧光各向异性作为一种研究Shwachman-Diamond综合征相关突变蛋白（SBDS）与延伸因子样1...

荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具

本文描述了一种用于评估整合膜蛋白相互作用与组装的方法 体外 在脂质邻近环境中与多种伴侣因子相互作用。...

利用支架脂质体在体外重建脂质邻近的蛋白质-蛋白质相互作用 In Vitro

构象柔性在蛋白质功能中起着关键作用。本文介绍了将时间分辨电喷雾电离质谱与氢-氘交换相结合，用于研究有序和无序蛋白质中驱动功能的快速结构变化。...

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱法用于研究蛋白质结构与动力学

本实验方案的目的是通过碱酶法水解鸡羽毛制备角蛋白水解物，并检测将角蛋白水解物添加至化妆品软膏基质中是否能够改善皮肤屏障功能（提高皮肤水合程度并减少经皮水分流失）。实验在男性和女性志愿者中进行。...

从鸡毛中制备角蛋白水解物及其在化妆品中的应用

学习生物层干涉测量技术，实时检测GrgA与衣原体RNA聚合酶的蛋白质相互作用。该方法提供定量动力学参数，揭示转录调控机制，灵敏度高于传统pulldown实验。

应用生物层干涉技术（BLI）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用

探索更多视频