应用生物层干涉技术（BLI）研究转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用

转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用传统上使用透析法进行研究。然而，透析法仅能提供定量信息。我们采用生物膜干涉技术（biolayer interferometry, BLI）来克服这一局限。

与Por dan相比，BLI可检测结合伙伴之间的实时结合与解离过程，还能生成定量的动力学参数，这些参数可反映相互作用机制。BLI技术听起来可能令人望而生畏，但实际上并不难掌握。要使用该技术，只需具备BLI仪器及配套软件的使用权限即可。

本视频将帮助您轻松掌握BLI技术。在开始检测前约10分钟，用移液器将200微升BLI缓冲液加入PCR管中。戴上手套，用手握住生物传感器较宽的部分，从原始包装中取出一个镍NTA生物传感器。

将生物传感器置于 PCR 管上方，使生物传感器的玻璃尖端浸入 BLI 缓冲液中。保持传感器尖端浸没至少 10 分钟，以确保充分水化。开启 Blitz 仪器。

确保仪器通过其背面的USB数据输出端口连接到计算机。在计算机上打开配套软件，然后点击屏幕左侧的“Advanced Kinetics”（高级动力学）选项。在软件中，根据各个标题，在对应的栏目下输入实验的所有相关信息。

单击“生物传感器类型”，然后从下拉菜单中选择镍 NTA。各步骤的持续时间可根据需要从默认值进行修改。为获得最佳结果，初始基线和基线阶段至少使用 30 秒，结合和解离阶段使用 120 秒。

从PCR管中取出水合的镍NTA生物传感器，并通过将传感器较宽的一端滑入仪器的传感器支架上，将其固定在仪器的传感器安装位置。将一个0.5毫升黑色微量离心管放入仪器的管架中，并用移液器向其中加入400微升BLI缓冲液。关闭仪器盖子，使生物传感器的尖端浸入微量离心管的缓冲液中。

在软件中点击“下一步”以开始记录初始基线。初始基线步骤记录完成后，打开仪器的盖子。将滑块向右移动，使液滴支架位于黑色箭头前方。

用移液器吸取4 µL透析后的His标签配体，滴加到液滴支架上，然后关闭仪器盖子，仪器将自动开始记录上样步骤。上样步骤记录完成后，打开仪器盖子。将滑块向左移动，使管架再次位于黑色箭头前方。

关闭仪器盖子，并确保生物传感器尖端浸入试管架中试管内的BLI缓冲液。仪器和软件将自动开始记录基线步骤。基线步骤记录完成后，打开仪器盖子。

取下液滴架，用移液枪吸出其中的蛋白质溶液，并用双蒸水冲洗，共重复五次。最后一次清洗后，用擦镜纸擦拭液滴架表面。将液滴架重新放回仪器上。

将仪器上的滑块向右移动，使液滴支架再次位于黑色箭头前方。用移液器将4微升透析后的分析物加到液滴支架上，然后关闭仪器盖子，仪器将自动开始记录结合阶段。结合阶段记录完成后，打开仪器盖子。

将仪器上的滑块向右移动，使试管架再次位于黑色箭头前方，然后合上仪器盖子，仪器将自动开始记录解离步骤。解离步骤记录完成后，打开仪器盖子，取下液滴架和试管架。用双蒸去离子水彻底冲洗两者，以洗去任何残留的蛋白质。

取出生物传感器并妥善丢弃。使用不同的分析物浓度，对相同的配体-分析物组合重复上述步骤。所有运行结束后，点击屏幕左侧的“文件”和“另存实验”以保存软件中的数据。

在“运行数据”标题下，选择“步进校正”和“一对一拟合”，然后点击“分析”以生成动力学数据。要将定量数据导出到工作表并生成图表，请点击“导出为CSV”，并将记录的数据保存为CSV文件。使用电子表格软件打开该CSV文件。

全长GrgA由288个氨基酸组成。如图所示，其中一段28个氨基酸的中间区域可直接与Sigma 28结合。此处使用带有C端His标签的中间区域作为配体，首先将其固定在镍NTA生物传感器的探针末端。

展示了三种不同分析物浓度的实验记录，每种记录均从配体结合前30秒开始，至最后一次洗涤开始后两分钟结束。在去除前两个阶段的数据点并重置基线后，可更清晰地观察到配体与分析物的结合与解离过程。在洗去未结合的以及带有末端His标签的GrgA 138至165后，加入Sigma 28，实时记录其与分析物的结合过程。

最后，在洗涤后记录实时解离过程。在进行BLI实验前，需从配体和分析物中去除甘油。如文中所述，我们建议在透析后尽快进行BLI实验。

利用BLI对转录过程中的蛋白质-蛋白质相互作用进行表征后，可以进一步研究该相互作用如何影响转录的起始、延伸和/或终止。