从外周单核细胞生成诱导神经干细胞,分化至多巴胺能神经元前体,用于移植研究

该协议描述了一种将血液和单核细胞重新编程为神经干细胞的方法，可用于治疗神经退行性疾病，如帕金森病。它提供了一个自体细胞源来治疗神经退行性疾病。此外，转换到诱导神经干细胞和分化到所需的细胞类型所需的时间框架比诱导多能干细胞短。

诱导神经干细胞具有良好的增殖能力，可在应用前进行增殖。由于 iNSC 可以指定到不同的区域特定的神经细胞中，如脊髓神经元或运动神经元，因此此方法可以扩展用于治疗其他神经系统疾病。整个过程需要很长时间，所有步骤都相关且关键，因此视觉演示提供了有关细胞外观的想法，并提供了一些提示，以确保成功生成所需的细胞。

首先，将先前分离的外周静脉血转移到50毫升的圆锥管中，用同等体积的无菌Dulbecco的PBS稀释。在另一个50毫升锥形管中，准备15毫升的灭菌密度梯度介质。以 45 度角倾斜管，缓慢而小心地将 30 毫升稀释的外周血放在密度梯度介质上。

在室温下以 800 倍 g 离心管 15 分钟，离心机制动器设置在关闭位置。吸气黄色，上等离子层，并丢弃它。使用 10 毫升移液器将含有单核细胞的白色多云薄膜层转移到新的 50 毫升锥形管中。

使用 MNCs 将 30 毫升 D-PBS 添加到管中，以 600 倍 g 离心，在 4 摄氏度下 10 分钟。丢弃上经剂后，加入45毫升D-PBS，然后重新暂停细胞。在4摄氏度下以400倍g离心管10分钟后，丢弃上经剂。

用五毫升D-PBS重新暂停细胞，用 trypan 蓝色排除法计算活细胞，留出扩展所需的跨国公司，并冻结剩余的细胞供将来使用。在零下14天，种子跨国公司的密度为每毫升200万至300万细胞，每井6井板与1.5毫升37摄氏度，预热的跨国公司介质。在37摄氏度，5%的二氧化碳孵育两天。

在负11日，使用灭菌移液器收集细胞与介质，并转移到一个新的15毫升锥形管。在室温下以250倍g离心5分钟，丢弃上先代，将细胞重新在预加热的 MNC 介质中重新暂停。在用锥泛蓝计算可行细胞后，在六井板中以每毫升100万个细胞的密度播种。MNC在预加热的跨国公司介质中播种。

在37摄氏度下孵育，三天孵育5%的二氧化碳，并在天减8天和负4天在MNC介质中重复细胞收集、离心和电镀。此程序中的仙台病毒是危险的，所有涉及仙台病毒的程序必须在安全柜中执行。所有接触仙台病毒的尖端和管子在处置前都应使用乙醇或漂白剂进行处理。

在第零天，收集 MNC 介质中的细胞并转移到 15 毫升锥形管中。在200次g中离心5分钟后，吸升液，用一毫升预加热的MNC介质重新向细胞增殖。用锥盘蓝色计算活细胞，然后用预热的跨国公司介质重新暂停，在24孔板中每井20万个细胞的浓度。

将含有仙台病毒的零下80摄氏度储存的管子从含有仙台病毒的储存中解冻5至10秒，然后在室温下解冻。解冻后，立即将它们放在冰上。将解冻的仙台病毒加入24孔板的井中，与跨国公司的感染率为10。

为了便于细胞的附着，将1000次g的板离心30分钟，然后将板在37摄氏度、5%的二氧化碳下放在培养箱中。第一天，将带介质的细胞转移到15毫升的离心管。要进一步分离剩余的细胞，每井用一毫升的跨国公司介质冲洗井，并将带介质的细胞加入管中。

在200次g中离心5分钟后，吸升液，用500微升新鲜预热的MNC介质重新悬浮细胞，并加入24井板的井。在第二天，在D-PBS中，使用以前稀释过的每微升50微克每微升50微克的一毫升每孔，在室温下将六孔板涂覆至少两个小时。从六孔板中吸出聚 D-lysine，在垂直清洁的长凳上干燥约 10 分钟。

然后将以前稀释的每毫升层压素的5微克每孔1毫升加入到六孔板中，并在37摄氏度下孵育4至6小时。使用前用 D-PBS 清洗板。在第三天，在多D-赖氨酸/层压涂层六孔板上，所有仙台病毒转导MNCS在诱导神经干细胞培养基上。

第5天和第7天，轻轻加入一毫升37摄氏度，预热的 iNSC 介质到六井板的每个井。从第9天到第28天，每天用新鲜的预热的 iNSC 介质更换介质。监测 iNSC 菌落的出现，并在大约两到三周内使用燃烧的玻璃移液器选择具有适当形态的菌落，并转移每个菌落到六井板的单独井中进行扩张。

要建立单侧6-红霉素-多胺-病变小鼠模型，剃光麻醉，成人，雄性，SCID米色小鼠的头，并应用红霉素眼软膏。将鼠标放在立体仪器上，用切口棒固定鼠标。正确插入耳罩，以牢固和适当地定位鼠标头。

用碘和异丙醇对头部进行灭菌，然后用手术刀刀片在头部皮肤上进行约1.5厘米的下垂切口，露出头骨。调整切口杆和耳杆，将啤酒和羊皮的高度差减至小于 0.1 毫米。缓慢地移动和降低微丝针的尖端朝向啤酒，并对待啤酒作为零点。

将尖端移动到坐标为前 0.5 毫米且相对于啤酒的横向 2.1 毫米的位置。缩回尖端，用记号笔标记点，用电子钻头在头骨上打一个小洞。将每毫升5微克的两微升6-催眠胺溶液提取到微西林格中。

将针头返回标记点，并将针头插入到后腹 3.2 毫米。以每分钟一微升的速度从注射器中注射6-hyroxydopamine溶液，将注射针留在位上再放置5分钟，然后慢慢收回。用缝合线闭合切口后，再次在眼睛上涂抹红霉素眼膏。

将鼠标从立体仪器中取下，放入回收笼中，并允许获得食物和水，直到它恢复知觉。PBMNC感染SeV后，它们的形态发生变化，细胞在第五天之前经历了剧烈的死亡。INSC殖民地出现在第12天。

在挑选和转移 iNSC 克隆以扩展多个段落后，它们表现出良好的形态，可以在 iNSC 介质中稳定地自我更新，无论是单层形式还是球体。经过24天的分化，iNSCs被确定为多巴胺神经元，其中大多数表示酪氨酸羟基酶，叉头盒A2，和神经元特异性III类β-图布林标记。在建立了单方6-甲状腺素-多巴胺-帕金森病小鼠模型后，进行了行为评估，以估计帕金森病的症状。

接受细胞移植的小鼠的运动功能明显改善。通过骨质肉、中前脑束和亚斯坦蒂尼格拉帕西坦的TH死后免疫荧光染色，验证了6-甲状腺多胺诱发病变的程度。TH阳性信号在植入细胞的线状体中恢复极大，在SN也轻微恢复。移植三个月后，在存活的细胞中，约13.84%为TH阳性多巴胺能神经元。

约91.72%的TH阳性细胞表示孤立的核受体，约86.76%表示FOXA2，约98.77%与G蛋白耦合向式整流器钾共同标记。将30密耳稀释的外周血铺设到密度梯度介质上时，请缓慢小心地进行，不要干扰梯度界面。应注意避免仙台病毒的反复解冻和冻结，以确保病毒活性高。

当重新编程外周血单核细胞诱导神经干细胞时，请每天密切观察细胞的形态。此外，6-羟基多巴胺对光和温度敏感。小心保护溶液免受光线的利用，并在使用前将溶液放在冰上。

按照这个程序，一个人可以继续研究疾病机制使用家庭PD患者衍生多巴胺神经元培养。人们还可以继续研究移植的细胞如何影响受损的神经元回路。