使用电压敏感性染料在脑片中进行全场单光子光学记录

使用电压敏感染料的光学记录方法被认为是一种可视化大脑工作原理的理想技术。该方法使我们能够稳定、可靠地连续记录超过12小时的神经心理动态，从而获得对心理活动的观察视角。我们正致力于拓展该技术的应用范围，以检测化学物质在发育各个阶段引起的神经回路变化，例如对母亲施用有价值的酸类物质。

该技术已相当成熟。请尝试通过采用此处介绍的方法来重复相关研究。开始操作时，将离体头部浸入不锈钢手术托盘中的冰冻人工脑脊液（ACSF）中。

在一分钟内取出脑组织，并将其放入含有冰冻人工脑脊液（ACSF）的烧杯中，持续五分钟。接着，使用解剖刀沿中线将脑组织切分为两半，并将两个半球置于一块4%琼脂块上。然后，将带有两个半脑半球的脑组织块放置于另一块4%琼脂块上。

用滤纸擦去组织块上多余的ACSF。随后，将超级胶水涂抹在振动切片机平台上。将琼脂块放置其上，并用滤纸擦去多余的胶水。

从脑组织琼脂块顶部轻轻加入少量冰冻的ACSF，以帮助凝固多余的超级胶水，并防止胶水覆盖脑组织而影响切片。随后，将平台固定到振动切片机托盘上，并倒入改良的ACSF。将振动切片机调至低速，刀片频率设为最高档位。

然后开始切片。将切片按顺序放置在切片室的角落，以便于区分切片的顺序。通常从一个半球可获得三到五片。

接下来，使用30号针头切除脑干部分。用细头画笔将切片转移至由有机玻璃环固定的膜滤器上。将该环置于湿润的恢复室中，并盖紧盖子以维持内部较高的压力。

将切片放置于膜过滤器上时，调整切片在环内的方向和位置，确保其居中且方向一致。将样品在 28 摄氏度下放置 30 分钟，随后在室温下恢复至少 10 至 30 分钟。染色时，轻轻将 100 µL 染色液加至每个切片上，并在室温下孵育 20 分钟。

接下来，在容器中准备 50 至 100 毫升的 ACSF。将带有样本的环放入其中，以冲洗染色液。然后，将冲洗后的脑片转移至另一个孵育腔室中。

实验前等待超过一小时以确保恢复。开始此操作时，打开放大器、计算机和相机系统，并启动软件。将ACSF倒入50毫升离心管中，并用碳氧混合气（carbogen）通气。

使用蠕动泵循环人工脑脊液（ACSF），并将流速调节至约1毫升每分钟。然后调节吸液管的高度，使实验腔室内的液面始终保持恒定。将接地电极放入腔室内。

随后，用少量人工脑脊液（ACSF）填充玻璃电极，并将其放入电极夹持器中。将夹持器固定到操纵杆上。使用放大器检测，确保电极电阻约为1兆欧。

在记录过程中，将脑片从湿润室转移至实验腔室。将环的边缘用力压入硅胶O形环中。注意不要损坏膜或实验腔室的底部。

在显微镜下，将刺激电极和场电位记录电极的尖端放置在脑片上。通过施加刺激来检测诱发出的反应。确认光学记录系统的视野覆盖了正确的神经环路。

接下来，将激发光强度调节至相机最大容量的大约70%到80%。使用荧光光源，通过采集系统调节焦距。然后开始记录，并在采集完成后使用图像采集软件分析数据。

该图显示了对小鼠海马脑片CA1区的Schaffer侧支进行电刺激时，所记录到的代表性光学信号。这些连续图像展示了在未施加任何空间和时间滤波前的光学信号，而这些图像则展示了对数据先后两次应用5×5×5立方滤波器后的结果。由于成像帧率高且空间分辨率高，滤波处理并未改变信号本身，但有效去除了噪声，这一点也可在单次实验中像素记录的时间进程曲线上观察到。

以下是小鼠与大鼠海马脑片CA1区典型反应的比较。在小鼠海马脑片中，刺激后24毫秒在CA1区远端可观察到较小的超极化反应；而在大鼠海马脑片中，超极化反应更为显著，并超过了去极化反应。脑片染色后可维持12小时以上，期间可进行其他电生理记录。