Name: 新生大鼠脑组织在神经端子突形圆锥花序分布超微结构形态分析中的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 学习透射电镜技术制备新生大鼠脑组织，用于突触囊泡分布的形态计量分析。该方法可实现高分辨率成像，帮助研究者定量研究突触超微结构与功能关系。

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本研究由美国国立卫生研究院/国家普通医学科学研究所资助项目K08 123321（资助对象：N.L.）以及弗吉尼亚大学麻醉学系的资金支持。作者谨此感谢Alev Erisir（弗吉尼亚大学生物学系，夏洛茨维尔，弗吉尼亚州）在透射电子显微镜技术方面的出色培训与技术协助，以及对本文稿提出的宝贵批评意见。作者同时感谢弗吉尼亚大学先进电子显微镜中心在样品切片和染色后处理过程中提供的技术支持。

所有研究均经弗吉尼亚大学（弗吉尼亚州夏洛茨维尔市）机构动物护理和使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院的指南进行。
1. 通过血管灌注进行固定
注意：大鼠脑血管灌注方法的总体描述此前已在本期刊中详细说明13，不在本实验方案的范围之内。然而，以下步骤专用于新生大鼠脑组织的制备，以获得高质量的电镜图像，用于对突触前末梢单位内突触小泡分布进行定量分析。
<ol>
	<li>配制4%多聚甲醛
	<ol>
		<li>在通风橱内的搅拌器上，将800 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）置于2 L玻璃烧杯中，加热至约60 °C，避免缓冲液沸腾。</li>
		<li>加入40 g多聚甲醛粉末，持续搅拌。</li>
		<li>测量pH时，逐滴加入10 N NaOH，直至溶液变澄清。最终pH应为7.2–7.4。</li>
		<li>加入剩余的0.1 M PB，定容至1 L。冷却后，用0.45 μm滤膜过滤，4 °C过夜保存。 
		注意： 灌注前一天制备新鲜的多聚甲醛。 
		注意： 吸入醛类蒸气可导致鼻部症状和呼吸道刺激。皮肤接触可引起皮炎。操作醛类时应在通风橱中进行，并佩戴手套、防护服和护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 Tyrode 溶液
	<ol>
		<li>将1 L蒸馏水置于搅拌板上的玻璃烧杯中。加入NaCl（8 g）、KCl（0.15 g）、CaCl₂（0.24 g）和MgCl₂（0.1 g），搅拌至完全溶解。2 （0.1 g），MgCl2 (0.006 g)，NaH2PO4 (0.055 g)，NaHCO₃3 （1 g）葡萄糖和右旋糖（1 g）放入烧杯中。</li>
		<li>持续搅拌并测量 pH 值，保持 pH 在 7.2 至 7.4 之间。 
		注意： Tyrode 溶液也可商业获取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将4%多聚甲醛与戊二醛混合，使戊二醛终浓度为2%。取40 mL电子显微镜级50%戊二醛加入1 L的4%多聚甲醛溶液中，于磁力搅拌器上充分混匀。 
	注意： 灌注一只新生大鼠的躯体大约需要 100 mL 多聚甲醛-戊二醛固定液。因此，1 L 固定液至少可灌注 10 只新生大鼠。多聚甲醛与戊二醛应在使用前即刻混合。灌注前将所有溶液恢复至室温。</li>
	<li>一旦获得左心室通路（参见整体动物灌注方案）13），在120 mmHg的灌注压力下用Tyrode溶液冲洗血管系统30秒。 
	注意： 灌注的成功在一定程度上取决于能否完全排除血管床中的血液</li>
	<li>以相同压力用多聚甲醛-戊二醛溶液灌注10分钟。 
	注意： 维持恒定的灌注压力对于避免引入伪影至关重要。此外，灌注液的温度不应低于大鼠的体温，以防止血管收缩。</li>
	<li>将固定好的脑组织从颅骨中取出，置于新鲜的多聚甲醛-戊二醛固定液中，4 °C 下过夜。 
	注意：此处可暂停本实验方案。</li>
</ol>
2. 脑切片
<ol>
	<li>将固定后的脑组织包埋于4%琼脂糖中，并将脑-琼脂糖块粘附至振动切片机载物台上 
	注意：其他实验室在无琼脂糖支撑的情况下，通过在振动切片机上实现稳定的组织块固定也获得了高质量的切片</li>
	<li>切取50 μm厚度的切片，将切片机设置为低频率和低速度。 
	注意：切片可在含0.05%叠氮化钠的0.1 M磷酸缓冲液中于4 °C保存数年。</li>
	<li>将切片置于培养皿中的0.1 M磷酸缓冲液中，在解剖显微镜下检查切片并挑选适合包埋的样本 
	注意：此步骤可暂停实验流程。</li>
</ol>
3. 漂洗
注意：使用醛类固定后、四氧化锇后固定前，必须对样本进行冲洗，因为残留的固定剂可能会产生四氧化锇沉淀
<ol>
	<li>用移液器将 0.1 M PB 加入带盖的短型广口玻璃小瓶中。每个小瓶中放入一个样本，确保样本完全浸没在溶液中，防止干燥。 
	注意：从本步骤开始，直至固定、脱水和浸润过程中的所有溶液更换步骤完成，样本均应保留在同一小瓶中，直到准备进行平包埋为止。</li>
	<li>用 0.1 M PB 清洗样本，每次 3 分钟，共清洗两次，然后用微量移液器吸除 PB。 
	注意：由于新生大鼠脑组织对渗透压变化极为敏感12,35,36,37，因此清洗所用溶液应与固定液的溶剂一致。</li>
</ol>
4. 锇酸后固定
<ol>
	<li>四氧化锇（OsO₄）溶液的制备4) 
	注意： 本作者的实验室利用 OsO4 4% 以水溶液形式提供，装于玻璃安瓿中（5 mL 奥斯mium 四氧化物）4 4% in H2O）。其他实验室已使用OsO4 晶体成功。然而，需要数小时才能溶解 OsO4 载体中的晶体
	<ol>
		<li>取 5 mL（一支安瓿）4% OsO₄4/2O，打开并放入棕色玻璃瓶中 
		注意： OsO4 是一种强氧化剂，暴露于光线下会迅速被还原。在制备过程中，可通过将 OsO4 在棕色玻璃瓶中</li>
		<li>加入5 mL的0.2 M PB。这将得到10 mL的2% OsO₄40.1 M 磷酸缓冲液 
		注意： 由于新生大鼠脑组织对渗透压变化极为敏感，应使用相同的缓冲液配制醛类固定剂和OsO₄4 溶液12,35,36,37</li>
		<li>加入额外的10 mL 0.1 M PB。最终将得到20 mL的1% OsO₄溶液。4 在 0.1 m PB 中。</li>
		<li>使用一支装有长针头的20 mL注射器吸取1% OsO₄4 并将其置于棕色玻璃瓶或用铝箔包裹的闪烁小瓶中。 
		警告： OsO₄4 具有高度挥发性，其蒸气对鼻腔、眼睛和咽喉有毒。所有操作均应在通风橱中进行，并佩戴手套和防护服，任何身体部位均不得接触OsO4处理和废弃物处置应遵循所在机构的指南。未使用的OsO₄应储存于4 在带有聚四氟乙烯衬垫的磨口棕色玻璃瓶中密封，用双层铝箔包裹瓶子，并置于干燥器中保存。若存在泄漏烟雾，OsO4 会使冰箱内部表面及其内容物变色。在上述储存条件下，OsO₄4 溶液可稳定保存数月。若储存过程中溶液被氧化，会变为灰色，此时应予以弃置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入1% OsO₄4 在样品瓶中的 0.1 M PB 中放置 1 小时。提取 OsO4 1小时后用微量移液器。 
	注意： 在应用 OsO₄ 之前4 在切片过程中，关键是要将样本展开并压平。避免直接将试剂滴加在样本上方，而应利用离心管的管壁，使四氧化锇轻轻滴下4 至离心管底部。样品在OsO₄处理后不久即变为棕色并变硬。4 应用. 从现在开始需轻柔操作，以避免组织损伤</li>
</ol>
5. 漂洗
注意：在四氧化锇（OsO4）后固定后、脱水前，必须对样品进行冲洗，因为残留的固定剂可能与脱水试剂发生反应37。
<ol>
	<li>用 0.1 M PB 缓冲液冲洗 3 分钟，重复 3 次。 
	注意：由于新生大鼠脑组织对渗透压变化极为敏感，清洗步骤应使用与固定剂混合液相同的缓冲液进行12,35,36,37。</li>
	<li>将锇酸溶液及前两次 PB 缓冲液清洗液收集至含 OsO4 的废液容器中，并根据所在机构的规定进行处理。</li>
</ol>
6. 醋酸铀酰的逐级脱水与染色
注意：本作者的实验室使用不溶于水的环氧树脂进行包埋。当使用环氧树脂时，必须在包埋介质渗透之前，将样品中的游离水完全替换为有机溶剂。通过将样品依次浸入浓度递增的乙醇和丙酮溶液系列中，以去除水分12。
<ol>
	<li>醋酸铀酰（UA）的制备
	<ol>
		<li>将一个含有100 mL 70%乙醇（EtOH）的200 mL容量玻璃烧瓶置于搅拌板上。</li>
		<li>向烧瓶中加入4 g UA。用铝箔包裹（UA在光照下会沉淀），并持续搅拌。 
		注意：UA在70%乙醇中溶解缓慢且不完全。使用前应让未溶解的晶体充分沉降。使用前需用0.45 μm滤膜过滤UA溶液。UA溶液可预先配制，储存于棕色瓶中并用铝箔包裹，于4 °C保存数月。 
		警告：UA具有轻微放射性且高度有毒。吸入UA粉末可导致上呼吸道紊乱以及肺、肝、肾疾病。UA在摄入或直接接触皮肤和黏膜时具有危险性。所有操作应在通风橱中进行，并佩戴手套和防护服。操作及废弃物处理应遵循所在机构的相关规定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用50%乙醇（EtOH）脱水1分钟。在加入UA前移除50%乙醇。</li>
	<li>加入4% UA的70%乙醇溶液。静置1小时或过夜。若过夜处理，应置于4 °C冰箱中。 
	注意：盖紧管盖以避免乙醇挥发，并用铝箔覆盖以避免光照。此步骤可作为暂停点。
	<ol>
		<li>根据所在机构的规定处理UA废液及后续两次清洗液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用70%乙醇（EtOH）脱水1分钟。</li>
	<li>用90%乙醇（EtOH）脱水5分钟。</li>
	<li>用100%乙醇（EtOH）脱水，每次5分钟，共2次。</li>
	<li>用丙酮冲洗样品，每次2分钟，共3次。</li>
</ol>
7. 渗透与包埋
注意：组织缺乏足够的刚性，无法在没有树脂基质额外支撑的情况下被切成薄片。因此，必须先进行浸润和包埋，然后才能切片12。
<ol>
	<li>EPON 树脂的制备
	<ol>
		<li>使用一个 60 mL 的灌胃注射器。取下注射器活塞，并用安全针头封住注射器口。</li>
		<li>将注射器开口朝上放置，逐步加入树脂混合物的各组分。加入 22 mL Embed-812（树脂）。加入 DDSA（固化剂）至总体积达 37 mL。加入 NMA（固化剂）至总体积达 50.5 mL。用移液器加入 525 μL DMP-30（促进剂）。由于 DMP 黏稠度高，操作移液器活塞时应极其缓慢。 
		注意：必须按上述顺序添加包埋试剂，促进剂（DMP-30）必须最后加入。为获得具有理想特性的固化块，必须精确使用固化剂和促进剂的用量。建议使用新鲜配制的包埋混合液。</li>
		<li>重新插入活塞，将注射器置于摇床上，持续振荡至少 30 分钟。颜色将由黄色变为琥珀色。 
		注意：所有组分必须充分混合均匀。若混合不充分，将导致组织样本浸透不均及包埋块硬度不均。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在闪烁瓶中将 1 体积 EPON 树脂与 1 体积丙酮混合，并振荡混匀。在去除最后一次丙酮清洗液后，将 1:1 的 EPON:丙酮混合液加入组织样本中。加盖以防止丙酮挥发。2–4 小时后或过夜后去除该 1:1 树脂-丙酮混合液。 
	注意：本方案可在此处暂停。</li>
	<li>用纯树脂替换树脂与丙酮的混合液。静置 4 小时或过夜。所有 EPON 废液应置于通风橱内的收集容器中，待聚合后统一处理。 
	注意：本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
8. 平面包埋
注意： 标本以类似三明治的方式夹在两层Aclar膜之间进行平面包埋。
<ol>
	<li>裁剪两块矩形透明Aclar片。用70%乙醇擦拭薄膜使其清洁。修整Aclar片边缘，确保组织切片四周至少有1.5 cm无组织的塑料区域。上层Aclar片的宽度应与底层相同，高度约为底层的三分之二。</li>
	<li>缓慢倾斜装有样本的瓶子，轻轻将组织从瓶底提起。</li>
	<li>使用微型柔性刮刀和细毛刷，小心地沿瓶壁移动切片，并将其转移至Aclar片上。 
	注意：操作切片时需谨慎，避免损伤样本。</li>
	<li>将上层Aclar片轻轻覆盖在样本上方。 
	注意：确保两片Aclar之间有足够的树脂，以完全密封夹层结构。</li>
	<li>轻轻挤出任何滞留的气泡，但避免对切片直接施加压力。擦去多余的EPON树脂。 
	注意：消除气泡至关重要，因为气泡的存在会妨碍样本观察，并削弱树脂结合的稳定性。</li>
	<li>使用耐溶剂笔在Aclar片上标记，并置于60 ͦC烘箱中2–3天以完成聚合。 
	注意：此步骤可作为暂停点。</li>
</ol>
9. 荚膜包埋
注意： 超薄切片机配备有卡盘，用于夹持从包埋模具中取出的圆柱形样品块。圆柱形样品块具有理想的几何形状，可最大程度减少切片过程中产生的振动影响。
<ol>
	<li>轻轻打开夹层的Aclar膜。标本将附着在两张Aclar膜中的一张上。</li>
	<li>使用耐溶剂的笔在含有切片的Aclar膜一侧做标记，靠近组织处进行标记。 
	注意：此步骤必须在打孔取出目标组织之前完成。</li>
	<li>使用打孔器获取切片的圆形样本，确保笔迹标记包含在打孔取出的组织内。</li>
	<li>将包埋胶囊的帽盖开口朝上放置于胶囊架上。&#160;在帽盖中央滴加一滴包埋树脂。</li>
	<li>将打好的圆片放入帽盖中，使组织切片面朝上。当光线照射标本时，笔迹标记会反光可见。</li>
	<li>将胶囊插入帽盖中，并用精细镊子插入标签。将一段打印好的2 cm长纸条卷起并缓缓放入胶囊内壁，使标签贴合胶囊侧壁的弧度。等待聚合完全，使标签永久包埋于树脂中。</li>
	<li>将包埋树脂倒入胶囊内，直至液面与胶囊边缘齐平。</li>
	<li>借助尖头木棒将组织标本轻推至胶囊底部，并置于60 °C烘箱中加热2–3天。 
	注意：注意不要过度按压组织，应使其自然松散地沉降，确保组织与胶囊表面之间保留一层薄薄的包埋介质。此步骤可作为暂停点。</li>
</ol>
10. 修整组织块表面
注意： 样本块切面的小尺寸和适当形状是获得满意切片的前提条件。因此，修整样本块是必要的。
<ol>
	<li>使用锋利的单刃剃刀刀片。使用前立即用丙酮清洁。</li>
	<li>将包埋胶囊块安装在模具夹持器中，并将夹持器置于体视显微镜的载物台上。 
	注意：修块操作应在双目显微镜下并采用斜向照明进行。</li>
	<li>用剃刀刀片从胶囊顶端去除Aclar片。在解剖显微镜光源下，Aclar片呈现为一层有光泽的薄膜。</li>
	<li>以45度角持握剃刀刀片，沿胶囊块的四个侧面进行切割。 
	注意：若用双手持握刀片，可获得更好的修块控制效果。</li>
	<li>进行短切，使块体形成一个侧壁倾角约为45°的短锥形金字塔状。 
	注意：通向样品表面的侧壁保持较短时，可更好地支撑样品面。若块体顶端过薄且过长，在超薄切片过程中将产生振动。理想情况下，目标区域应位于块体端面的中央。</li>
	<li>修剪胶囊顶端，去除多余组织，仅保留目标区域。 
	注意：切片的任何部分均不应无组织覆盖，因为块体端面组织密度的不均是切片困难的主要原因。理想情况下，胶囊端面的表面积不应超过1 mm2。</li>
	<li>将胶囊端面修整为不等边梯形。由于不等边梯形各边长度均不相等，该形状最有利于相对于样品其余部分确定目标区域的方位。 
	注意：在切片过程中，梯形端面的支撑效果优于其他任何形状。</li>
</ol>
11. 切片机切片
注意： 大多数生物样本在其自然状态下过厚，无法被电子束穿透。因此，必须将材料切成薄片，以便电子束能够穿透。
<ol>
	<li>在超薄切片机上沿平行于表面的方向切割薄切片（银色干涉色，600-900 Å）。</li>
	<li>将切片置于载网上。本实验室使用外径为3.05 mm的铜网。 
	注意：本方案可在此暂停。</li>
</ol>
12. 醋酸铀后染色
<ol>
	<li>用蒸馏水配制2%的醋酸铀（UA）溶液。取一个200 mL的容量玻璃烧瓶，加入100 mL蒸馏水并置于搅拌器上。向烧瓶中加入2 g UA。用铝箔包裹（UA遇光会沉淀），持续搅拌。 
	注意：有关UA溶液配制的详细信息，请参见本方案的第6节。</li>
	<li>在培养皿中一块干净的牙科蜡纸上滴加数滴2% UA溶液。</li>
	<li>将载网（切面朝下）漂浮于UA溶液液滴上，持续25分钟。 
	注意：每个载网应分别漂浮在单独的UA液滴上。</li>
	<li>用镊子夹住载网边缘，用塑料洗瓶在室温下以温和的蒸馏水水流冲洗两次。 
	注意：在用铅染色前，切勿使载网干燥。</li>
</ol>
13. 铅染色后处理
<ol>
	<li>准备一个无 CO2 的染色室（空气中的 CO2 是铅沉淀的主要来源）。将一片浸有 1 N NaOH 的滤纸放入培养皿中，在滤纸上放置一小块干净的牙科蜡，并在培养皿一侧放置数粒 NaOH 颗粒。盖上培养皿。
	 
	注意：应在网格使用铀酰乙酸（UA）染色前准备好此装置，以确保染色室内的空气无 CO2，待 UA 染色完成后即可进行铅染色。</li>
	<li>配制 4% NaOH 溶液：将 0.2 g NaOH 加入 5 mL 蒸馏水中。</li>
	<li>配制 Sato 三重铅染液。配制 10 mL 时，将 0.1 g 硝酸铅、0.1 g 柠檬酸铅、0.1 g 醋酸铅和 0.2 g 柠檬酸钠加入玻璃瓶中，加入 8.2 mL 蒸馏水，剧烈振荡 5 分钟。超声处理 30 秒后，加入 1.8 mL 新鲜配制的 4% NaOH 溶液。</li>
	<li>在培养皿的蜡面上滴加数滴 Sato 铅染液。</li>
	<li>将经 UA 染色的载网（切片面向下）置于铅染液滴上。
	 
	注意：每个载网应分别漂浮在单独的铅染液滴上。每滴染液应足够小，使载网能漂浮在液滴的穹顶表面，而不是滑落到边缘。</li>
	<li>盖上培养皿，染色 5 分钟。</li>
	<li>用镊子夹住载网边缘，在室温下用塑料冲洗瓶挤出的温和流速煮沸蒸馏水彻底冲洗载网。</li>
	<li>用滤纸吸干载网并妥善保存。
	 
	注意：确保切片不与滤纸直接接触。</li>
</ol>

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<li>Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+dense+artifactual+deposits+in+tissue+sections%3A+the+role+of+ethanol%2C+uranyl+acetate+and+phosphate+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer.</a> Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在透射电镜（TEM）样品制备过程中，组织切片的操作需要相当高的技巧、专注力和耐心。使用微量移液器添加或移除溶液时，由于表面张力的作用，样品可能被吸入移液器尖端，因此必须格外小心，避免移液器对组织造成损伤。此外，脱水程序中的某些步骤可能短至1分钟，操作者必须迅速操作，以确保及时进入下一脱水步骤，并防止样品干燥或皱缩。其中需特别注意的一个步骤是四氧化锇后固定。组织经四氧化锇处理后会变得僵硬，容易受损。在加入四氧化锇之前，必须确保切片平展地贴附于离心管底部，否则任何折叠都会导致组织断裂。当将经四氧化锇处理的组织转移至Aclar膜进行平面包埋时，操作尤为困难。从离心管底部提起样品时需格外小心，以防碎片化，同时在排除膜夹层中的气泡时也需谨慎。虽然必须排除滞留的空气（因其会影响样品的观察，并削弱树脂结合的稳定性），但直接对四氧化锇处理过的组织施加压力极易造成损伤。另一个需要格外注意的步骤是包埋介质混合液的配制，用于样品的渗透和包埋。EPON 是最常用的包埋树脂，可通过加入固化剂和加速剂使其硬化。必须精确使用规定量的固化剂和加速剂，才能获得具有理想特性的固化块。已有文献描述了采用重量法和体积法测量黏稠树脂的方法。尽管传统上认为重量法更为精确<sup ...

我们描述了制备新生大鼠脑组织的方法，以获得高质量的电子显微图像，用于深入分析神经末梢突触小泡的空间分布1,2。采用这些方法处理样品后所获得的高对比度显微图像，也可用于研究多种细胞组分的精细形态及其维度结构关系3,4。
透射电子显微镜（TEM）是一种强大的工具，可用于对细胞器及其他细胞结构的形态进行定量研究。截至目前，除通过高压冷冻实现的冷冻固定技术外，尚无其他研究方法能够在无需免疫标记的情况下，提供对脂质膜和细胞器同等分辨率的观察。然而，冷冻置换技术尚未得到广泛应用，通常还需要昂贵的设备和较长的制样时间。
为了充分利用透射电子显微镜（TEM）的高分辨能力，最优的样品制备至关重要。样品制备的主要目标是尽可能保持组织在活体状态下的结构，最小化结构改变，增强样品对比度，并使组织在处理过程以及暴露于电子束时能够抵抗细胞组分的流失。多年来，多个实验室已提出并不断完善多种用于TEM组织制备的实验方案。其中许多研究集中于突触小泡最佳可视化的方法5,6,7,8,9,10,11。在当前广泛使用且已被确立为金标准的多种成熟方法中，我们选择了化学固定、后固定、整块染色、逐级脱水、树脂包埋以及切片后染色等步骤，旨在最大限度地保存组织超微结构并获得优异的图像对比度。值得注意的是，在处理新生大鼠脑组织时，精细超微结构的保存尤为具有挑战性。事实上，幼龄动物的中枢神经系统相比成年脑组织具有更高的含水量、更显著扩大的细胞外间隙以及更松散的细胞间连接12。这使得新生大鼠脑组织对渗透压变化极为敏感，在经过不同张力溶液的逐级处理时极易产生人为收缩和/或肿胀 artifacts12。因此，我们在样品处理过程中所使用的溶液，其渗透压尽可能接近新生大鼠脑组织的生理渗透压。我们的目标是获得高质量、高分辨率的电子显微图像，以对神经末梢处突触小泡的空间分布进行定量分析。具体而言，我们旨在测量神经末梢内突触小泡的数量、突触小泡与突触前质膜之间的距离、锚定在突触前膜上的小泡数量、突触小泡的大小以及小泡之间的间距1。
良好的化学固定是获得高质量电子显微图像的前提，此类图像可提供研究突触小泡形态及其空间组织所需的精细结构细节。尽管存在多种固定方法，但通过血管灌注对脑组织进行固定明显优于其他方法。由于血管灌注固定在全身循环停止后立即开始，因而缩短了脑组织缺氧与固定剂对蛋白质发生交联之间的时间间隔，从而最大限度地减少了细胞结构的改变。此外，由于固定剂能迅速从血管床进入细胞外和细胞内空间，因此可实现快速且均匀的渗透12,13,14。先用戊二醛进行初次固定，再用四氧化锇进行二次固定（后固定），可极好地保存超微结构15,16,17。戊二醛与多聚甲醛的混合液还具有渗透速度更快的优点12。
由于生物组织本身不够坚硬，无法在没有树脂基质支撑的情况下被切成薄片，因此在进行薄切片之前需要将其包埋在介质中。在透射电子显微镜（TEM）中，通常使用与水不相混溶的环氧树脂作为包埋介质。当使用此类基质时，必须先用有机溶剂完全置换样品中的游离水，然后才能进行树脂渗透。水分的去除是通过将样品依次浸入浓度递增的乙醇和/或丙酮溶液系列中实现的12。在本实验方案中，样品首先被平铺包埋于柔性的Aclar片之间，随后再包埋入包埋胶囊中。最终得到的组织位于圆柱形树脂块的顶端，这种几何形状最不易受到切片过程中微动振动的影响。
使用重金属染色以增强组织内源性对比度是样品制备的另一个重要方面。透射电子显微镜（TEM）中的图像对比度源于组织中原子对电子的散射。然而，生物材料主要由低原子量的分子（如碳、氢、氧和氮）组成。因此，要产生足够的散射对比度，需要将高原子量的原子引入组织的细胞组分中。这一过程通过使用重金属对样品进行染色来实现12,18,19。四氧化锇、铀和铅是常用的重金属电子染色剂，它们能强烈结合脂质。
锇（原子序数76）是已知最致密的金属之一。它既是一种固定剂，也是一种染色剂，尽管在透射电子显微镜（TEM）中主要作为可靠的固定剂使用12。在现有的多种固定方法中，先用戊二醛、再用锇进行双重固定的方案在减少样品制备过程中细胞成分流失方面最为有效。这两种固定剂可稳定最大数量的不同类型分子，尤其是蛋白质和脂质，从而实现对组织超微结构的优异保存12,14,15,16,17。
铀（原子序数92）是最重的用作电子染色的金属，通常以醋酸铀酰的形式使用。与锇类似，它既可作为染色剂也可作为固定剂，但在透射电子显微镜（TEM）中主要用作染色剂20,21。在醛类固定的组织中，含核酸和膜性结构可被铀盐强烈且优先地染色22,23。在锇酸处理之后、脱水之前用醋酸铀酰处理组织，可稳定膜性结构和含核酸的结构，同时增强对比度，使得一些仅用锇染色难以观察到的结构细节得以识别12,24,25。据认为，醋酸铀酰可能通过与在锇酸处理过程中沉积于脂质膜上的还原态锇结合，从而稳定超微结构24。当醋酸铀酰在包埋前应用，并作为超薄切片的后染色剂时，可获得最佳对比度12。
铅（原子序数82）是透射电子显微镜（TEM）中最常用的染色剂，主要用于超薄切片的后染色。铅盐具有很高的电子不透明性，可与多种细胞结构结合，包括膜结构、核内和胞质蛋白、核酸以及糖原26,27。当采用双重染色法时（即先用醋酸铀酰染色，再用铅染色），后者可起到增强醋酸铀酰染色效果的作用。例如，经戊二醛固定的染色质在使用铅进行后染色后，其对醋酸铀酰的摄取量可提高三倍28,29,30,31,32。铅还可增强其他金属（如锇）所产生的染色效果。据认为，在还原态锇存在的情况下，铅盐通过与磷脂的极性基团结合，从而对锇固定的组织中的膜结构进行染色33。使用醋酸铀酰和铅进行染色的一个潜在缺点是，尤其是在染色时间较长的情况下，许多不同的结构成分会被同等且非特异性地染色，因而彼此之间可能难以区分12。
近年来引入了多种替代性光源，例如光学超分辨率光激活定位显微镜中的光源，显著提高了光学显微镜的分辨率34。然而，由于光学显微镜依赖组织化学和免疫细胞化学方法来可视化单独标记的蛋白质或酶，透射电子显微镜（TEM）能够同时显示所有结构组分的能力在深入研究组织结构的形态学特征及其空间维度关系方面仍然无与伦比。特别是，尚无其他技术能够提供进行突触前神经末梢突触小泡分布形态计量分析所必需的形态学细节。但需要注意的是，电镜图像记录的是生物体死亡后组织的结构状态，因此无法提供有关突触前小泡转运及胞吐过程动态变化的信息。因此，当研究的主要目标是探讨突触小泡转运与胞吐的动态性和（或）功能性特征时，应考虑采用其他技术手段，如FM染料活体成像和膜片钳电生理学技术。

<table><tbody><tr><td>4% 四氧化锇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19170</td><td>水溶液</td></tr><tr><td>50% 戊二醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16310</td><td>电镜级，水溶液</td></tr><tr><td>Aclar 33 C 包埋膜</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425-25</td><td>厚度 7.8 mil，尺寸 8&quot;x10&quot;</td></tr><tr><td>BEEM 包埋胶囊架</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69916</td><td>适用于 &quot;00&quot; 号胶囊</td></tr><tr><td>BEEM 包埋胶囊</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70021</td><td>&quot;00 号，平底（切底型）&quot;</td></tr><tr><td>Butler 包埋块修整器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>69945-01</td><td></td></tr><tr><td>骆驼毛画笔</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>65576-01</td><td></td></tr><tr><td>打孔器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77850-09</td><td></td></tr><tr><td>Embed 812 试剂盒</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铅</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17600</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17800</td><td></td></tr><tr><td>硝酸铅</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>Leica UC7 超薄切片机</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型标尺</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091-23</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19208</td><td>电镜级，颗粒状</td></tr><tr><td>Precision Thelco 实验室烘箱</td><td>Thelco</td><td>51221159</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>StatMark 标记笔</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72109-01</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11760-05</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td>粉末</td></tr></tbody></table>

新生大鼠脑组织制备用于神经末梢突触小泡分布的超微结构形态计量分析

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

我们的实验室以及许多其他实验室已利用透射电子显微镜的高分辨能力来研究突触小泡的形态及其空间组织。为了获得高质量的电子显微照片，从而获取足以进行突触前小泡分布定量分析所需的形态学细节，优化的样品制备至关重要。化学固定是样品制备过程的第一步，对于精细超微结构的保存尤为关键。通过血管灌注戊二醛-甲醛溶液进行固定，随后用四氧化锇处理振动切片机制备的样品，可最大程度地稳定分子（尤其是蛋白质和脂质），并实现超微结构的优异保存。随后组织经过对比染色、逐级脱水及树脂包埋处理。在树脂包埋前对振动切片组织进行醋酸铀酰块染（即“整体染色”），可增强内源性对比度，并在样品处理过程中防止细胞组分被抽提。通过在超薄切片上使用醋酸铀酰进行染后染色，可进一步提高对比度。在醋酸铀酰染色后，再用柠檬酸铅对超薄切片进行双重染色，还可通过铅离子对醋酸铀酰的选择性结合，增强含核酸结构的电子不透明性，从而提高图像分辨率。透射电子显微镜是表征突触小泡形态细节及其在终末膨大内大小与空间分布的强大工具。然而，由于该技术使用固定组织，因此只能间接提供有关活体或动态过程的信息。因此，当研究的主要目标是探讨突触小泡运输和胞吐作用的动态或功能特性时，应考虑采用其他技术方法。

对于透射电镜（TEM）样本保存质量是否满意或存在缺陷，已确立了一些普遍接受的通用标准。这些标准通过四张选定的电子显微照片加以说明（其中两张为最佳制备样本的示例，另两张为制备缺陷样本的示例），这些图像均采用本实验方案所述方法处理幼年大鼠脑组织后获得。
一般来说，高质量的电子显微照片呈现为有序、清晰且整体呈灰度的图像。在制备良好的样品中，膜之间的间隙应充满颗粒状物质，而不应为空。同样，细胞质基质或细胞器内部也不应出现空隙（比较图1A和图2A与图3和图4）。然而需要注意的是，与成年动物脑组织相比，幼龄动物中枢神经系统中的细胞外间隙在一定程度上会扩大，细胞间连接较松散，整体呈现更亮、电子密度较低的外观。膜结构应连续，无扭曲或断裂现象（见图1A和图2A</...

我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率电子显微照片的步骤，用于分析神经末梢突触小泡分布的形态计量学研究。采用这些方法获得的显微照片还可用于研究多种其他细胞组分的形态及其维度结构关系。

我们的实验室以及许多其他实验室已利用透射电子显微镜的高分辨能力来研究形态学和空间结构……

在现有的多种用于透射电子显微镜的组织制备方案中，我们选择了能够实现最佳结构保存并获得高分辨率显微图像的方法，以对突触前末梢突触小泡的分布进行形态计量分析。这些方法所获得的高对比度图像可用于量化突触小泡与突触前膜之间的距离、锚定在突触前膜上的小泡数量以及小泡间的距离等参数。所有这些参数均能反映突触功能状态。由于突触小泡空间排列的改变可能与突触功能的紊乱相关，这些方法已被用于研究全身麻醉剂对突触发育的影响。这些方法也可用于研究任何药物或处理对突触精细形态的影响，从而深入了解其功能。首先准备四氧化锇，用于对先前通过血管灌注以多聚甲醛和戊二醛固定的鼠脑切片进行后固定。组织切片经四氧化锇处理后会变得僵硬，因此此后需谨慎操作。此外，在加入四氧化锇之前，请确保切片已完全展平，因为任何褶皱都可能导致组织破裂。打开一支5毫升的4%四氧化锇水溶液安瓿瓶，将其倒入棕色玻璃瓶中。加入5毫升0.2摩尔磷酸缓冲液，再加入10毫升0.1摩尔磷酸缓冲液，配制成终浓度为1%的四氧化锇溶液。使用配有长针头的20毫升注射器吸取1%四氧化锇溶液，然后将该溶液加入用铝箔包裹的棕色玻璃瓶中。确保样本已完全展开并压平后，向样本瓶中加入1%四氧化锇和0.1摩尔磷酸盐缓冲液。将样本在室温下用四氧化锇孵育一小时。孵育结束后，用微量移液器吸出四氧化锇，并按照方案所述冲洗切片。配制醋酸铀酰时，将含有100毫升70%乙醇的200毫升容量玻璃烧瓶置于搅拌板上。向烧瓶中加入4克醋酸铀酰，用铝箔包裹以防止光照引起沉淀，并持续搅拌。用50%乙醇对切片进行脱水处理。使用配制好的4%醋酸铀染色一小时，随后按照文中的描述进行逐级脱水和冲洗。从60毫升灌胃注射器中取出活塞，并用安全针头将其封口。将注射器开口朝上放置，依次加入树脂混合物的每种成分。最后用移液器加入525 µL的DMP30。由于DMP黏度很高，移动移液器活塞时应非常缓慢。将活塞重新插入注射器中。将注射器倒置数次以混匀内容物，颜色将由黄色变为琥珀色。抽出注射器内的空气。然后将其置于摇床上，持续振荡至少30分钟。取等体积的环氧树脂和丙酮加入闪烁瓶中，振荡混合。在最后一次丙酮漂洗后，将该等体积树脂与丙酮的混合液滴加至组织切片上，并加盖以防止丙酮挥发。在两到四小时后去除树脂与丙酮的1:1混合液，并替换为纯树脂，孵育四小时。将所有树脂废液置于通风橱内的收集容器中，使其聚合后待后续处理。剪取两块矩形透明聚氯三氟乙烯膜，用70%乙醇擦拭。修剪样本，使其切片每侧至少留有1.5厘米无组织的塑料边缘，确保上下两片大小宽度一致，但上方薄片的高度约为下方薄片的2/3。缓慢倾斜小瓶，使用精细的驼毛画笔和柔韧的微型刮铲极其轻柔地将样本从瓶底抬起，然后小心地沿瓶壁移动切片，并转移至下方的PCTFE薄片上。用微型刮刀去除多余的树脂，然后轻轻将上层片材覆盖在样本上。轻轻排出任何滞留的气泡，避免对组织切片直接施加压力，并擦去多余的树脂。使用耐溶剂的记号笔标记片材，然后置于60摄氏度的烘箱中加热两至三天以完成聚合。轻轻拉开夹层的PCTFE片以打开它们。使用耐溶剂的笔在带有贴附组织的一侧靠近组织处做标记。使用圆孔打孔器获取组织的圆形样本，并确保笔迹标记位于被打下的组织部分中。当光线照射到标本上时，笔迹会发光。将包埋胶囊的盖子正面朝上放置在胶囊架上。在盖子上滴一滴树脂，然后将打孔的圆片连同朝上的组织切片一起放入盖子内。将胶囊轻轻以旋转方式插入盖子中。使用精细镊子将一条打印好的、长两厘米的纸质标签卷起并放入胶囊内，确保其贴合胶囊侧壁的弧度。将包埋树脂倒入胶囊内，加至胶囊边缘，然后用尖头木棒将组织样本推至胶囊底部。将胶囊置于 60 摄氏度的烘箱中加热两至三天以进行聚合。随后按照方案中所述进行切片和染色。电子显微照片显示神经元细胞结构保存良好，细胞膜呈层状且无断裂。细胞质最终呈颗粒状，无空泡。线粒体既不肿胀也不收缩，外层双膜结构保存完好，内部嵴完整。为了能够观察到突触小泡并测量其与突前膜之间的距离，必须对神经元的超微结构和细微形态特征进行最佳保存。突触小泡应清晰可辨，并由连续完整的单层膜包被。为了便于对突触小泡分布进行形态计量分析，突触前膜与突触后膜应保持平行且连续完整。组织结构保存不良的电镜照片显示神经元细胞膜发生扭曲和断裂，细胞外间隙明显扩大。线粒体呈现扩张状态，且其嵴出现肿胀。在另一例组织结构保存不良的样本中，细胞质内出现较大的白色空泡区域，取代了原本细颗粒状的细胞质物质，同时细胞外间隙也有所扩大。人工膜结构的出现极有可能是在戊二醛固定过程中脂质发生移动所致。处理幼年脑组织时，应使用1摩尔磷酸盐缓冲液作为所有溶液的溶剂，以使渗透压尽可能接近新生大鼠脑组织，从而最大限度地减少组织人为收缩或肿胀。采用这些方法获得的显微图像可用于研究除突触囊泡外多种细胞组分的精细形态及其维度结构关系，例如线粒体、高尔基体和细胞核染色质。本方案中的多个步骤涉及可能有毒的化学物质。处理醛类、锇、铀和铅化合物时，务必在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。

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