新生大鼠脑组织制备用于神经末梢突触小泡分布的超微结构形态计量分析

在现有的多种用于透射电子显微镜的组织制备方案中，我们选择了能够实现最佳结构保存并获得高分辨率显微图像的方法，以对突触前末梢突触小泡的分布进行形态计量分析。这些方法所获得的高对比度图像可用于量化突触小泡与突触前膜之间的距离、锚定在突触前膜上的小泡数量以及小泡间的距离等参数。所有这些参数均能反映突触功能状态。

由于突触小泡空间排列的改变可能与突触功能的紊乱相关，这些方法已被用于研究全身麻醉剂对突触发育的影响。这些方法也可用于研究任何药物或处理对突触精细形态的影响，从而深入了解其功能。首先准备四氧化锇，用于对先前通过血管灌注以多聚甲醛和戊二醛固定的鼠脑切片进行后固定。

组织切片经四氧化锇处理后会变得僵硬，因此此后需谨慎操作。此外，在加入四氧化锇之前，请确保切片已完全展平，因为任何褶皱都可能导致组织破裂。

打开一支5毫升的4%四氧化锇水溶液安瓿瓶，将其倒入棕色玻璃瓶中。加入5毫升0.2摩尔磷酸缓冲液，再加入10毫升0.1摩尔磷酸缓冲液，配制成终浓度为1%的四氧化锇溶液。使用配有长针头的20毫升注射器吸取1%四氧化锇溶液，然后将该溶液加入用铝箔包裹的棕色玻璃瓶中。

确保样本已完全展开并压平后，向样本瓶中加入1%四氧化锇和0.1摩尔磷酸盐缓冲液。将样本在室温下用四氧化锇孵育一小时。孵育结束后，用微量移液器吸出四氧化锇，并按照方案所述冲洗切片。

配制醋酸铀酰时，将含有100毫升70%乙醇的200毫升容量玻璃烧瓶置于搅拌板上。向烧瓶中加入4克醋酸铀酰，用铝箔包裹以防止光照引起沉淀，并持续搅拌。用50%乙醇对切片进行脱水处理。

使用配制好的4%醋酸铀染色一小时，随后按照文中的描述进行逐级脱水和冲洗。从60毫升灌胃注射器中取出活塞，并用安全针头将其封口。将注射器开口朝上放置，依次加入树脂混合物的每种成分。

最后用移液器加入525 µL的DMP30。由于DMP黏度很高，移动移液器活塞时应非常缓慢。将活塞重新插入注射器中。

将注射器倒置数次以混匀内容物，颜色将由黄色变为琥珀色。抽出注射器内的空气。

然后将其置于摇床上，持续振荡至少30分钟。取等体积的环氧树脂和丙酮加入闪烁瓶中，振荡混合。在最后一次丙酮漂洗后，将该等体积树脂与丙酮的混合液滴加至组织切片上，并加盖以防止丙酮挥发。

在两到四小时后去除树脂与丙酮的1:1混合液，并替换为纯树脂，孵育四小时。将所有树脂废液置于通风橱内的收集容器中，使其聚合后待后续处理。剪取两块矩形透明聚氯三氟乙烯膜，用70%乙醇擦拭。

修剪样本，使其切片每侧至少留有1.5厘米无组织的塑料边缘，确保上下两片大小宽度一致，但上方薄片的高度约为下方薄片的2/3。缓慢倾斜小瓶，使用精细的驼毛画笔和柔韧的微型刮铲极其轻柔地将样本从瓶底抬起，然后小心地沿瓶壁移动切片，并转移至下方的PCTFE薄片上。

用微型刮刀去除多余的树脂，然后轻轻将上层片材覆盖在样本上。轻轻排出任何滞留的气泡，避免对组织切片直接施加压力，并擦去多余的树脂。使用耐溶剂的记号笔标记片材，然后置于60摄氏度的烘箱中加热两至三天以完成聚合。

轻轻拉开夹层的PCTFE片以打开它们。使用耐溶剂的笔在带有贴附组织的一侧靠近组织处做标记。使用圆孔打孔器获取组织的圆形样本，并确保笔迹标记位于被打下的组织部分中。

当光线照射到标本上时，笔迹会发光。将包埋胶囊的盖子正面朝上放置在胶囊架上。在盖子上滴一滴树脂，然后将打孔的圆片连同朝上的组织切片一起放入盖子内。

将胶囊轻轻以旋转方式插入盖子中。使用精细镊子将一条打印好的、长两厘米的纸质标签卷起并放入胶囊内，确保其贴合胶囊侧壁的弧度。将包埋树脂倒入胶囊内，加至胶囊边缘，然后用尖头木棒将组织样本推至胶囊底部。

将胶囊置于 60 摄氏度的烘箱中加热两至三天以进行聚合。随后按照方案中所述进行切片和染色。电子显微照片显示神经元细胞结构保存良好，细胞膜呈层状且无断裂。

细胞质最终呈颗粒状，无空泡。线粒体既不肿胀也不收缩，外层双膜结构保存完好，内部嵴完整。为了能够观察到突触小泡并测量其与突前膜之间的距离，必须对神经元的超微结构和细微形态特征进行最佳保存。

突触小泡应清晰可辨，并由连续完整的单层膜包被。为了便于对突触小泡分布进行形态计量分析，突触前膜与突触后膜应保持平行且连续完整。组织结构保存不良的电镜照片显示神经元细胞膜发生扭曲和断裂，细胞外间隙明显扩大。

线粒体呈现扩张状态，且其嵴出现肿胀。在另一例组织结构保存不良的样本中，细胞质内出现较大的白色空泡区域，取代了原本细颗粒状的细胞质物质，同时细胞外间隙也有所扩大。人工膜结构的出现极有可能是在戊二醛固定过程中脂质发生移动所致。

处理幼年脑组织时，应使用1摩尔磷酸盐缓冲液作为所有溶液的溶剂，以使渗透压尽可能接近新生大鼠脑组织，从而最大限度地减少组织人为收缩或肿胀。采用这些方法获得的显微图像可用于研究除突触囊泡外多种细胞组分的精细形态及其维度结构关系，例如线粒体、高尔基体和细胞核染色质。

本方案中的多个步骤涉及可能有毒的化学物质。处理醛类、锇、铀和铅化合物时，务必在通风橱中操作，并穿戴个人防护装备。