KSHV感染细胞中特定基因产物的定量荧光原位杂交（FISH）与免疫荧光（IF）检测

该方案有助于在宿主细胞环境中定量研究病毒基因产物的时间调控规律，尤其适用于疱疹病毒的相关研究。该技术可用于解答涉及宿主与病毒RNA及蛋白质的科学问题。此外，该技术可与生化分析实验同时进行。

将200微升的单细胞悬液加入无菌八孔载玻片的每个孔中，以使细胞贴壁。在37°C、5%二氧化碳条件下培养12-24小时，促进细胞贴壁生长。孵育结束后，吸除上清液及未贴壁的细胞，并立即在冰上用预冷的4%多聚甲醛PBS溶液固定细胞30分钟。固定结束后，用200微升4°C的PBS溶液洗涤细胞，每次5分钟，共洗涤三次。

最后一次洗涤后，每孔加入200 µL预冷的含0.5%Triton-X的PBS溶液，冰上作用10分钟，以对固定细胞进行通透处理。通透结束后，小心取下腔室，避免划破载玻片，并用预冷的PBS冲洗细胞。随后用含4%BSA的预冷PBS溶液在4°C下封闭细胞30分钟，接着在4°C下用含0.1%BSA的PBS溶液稀释的适当多克隆一抗孵育1小时。

孵育结束后，用新鲜的PBS洗涤细胞三次，然后在4摄氏度下，加入与FISH检测抗体相容的荧光标记二抗，孵育一小时。如前所示，再次用PBS洗涤三次后，将样品在含4%甲醛的PBS中重新固定10-15分钟，随后进行第二次透化处理。然后用铝箔包裹载玻片，以保护荧光信号，防止光漂白。

用2倍体积的氯化钠柠檬酸盐溶液洗涤细胞，然后每张载玻片加入45微升杂交溶液。在湿盒中37摄氏度孵育1小时后，加入蒸馏水至目标反义寡核苷酸中，使变性总体积达到10微升。将寡核苷酸在95摄氏度下变性5分钟，然后每张载玻片加入35微升新鲜杂交溶液。

然后将样品置于加湿孵育盒中，在37摄氏度条件下孵育10至24小时，并用铝箔保护。次日，在室温下用2×柠檬酸钠溶液洗涤细胞两次，每次10分钟，随后在25摄氏度条件下用1×柠檬酸钠溶液洗涤一次，持续10分钟。

最后一次洗涤后，将细胞置于预冷的含4%多聚甲醛的PBS中，在冰上固定10-15分钟，随后用新鲜PBS洗涤三次。接着，按所示方法对样本进行通透处理，然后在4°C条件下，用含抗地高辛荧光素FTC和预冷的含0.1%BSA的PBS孵育一小时。孵育结束后，用新鲜PBX洗涤载玻片三次，并在4°C条件下，用预冷的含4%多聚甲醛的PBS固定样本10-15分钟。

在 PBS 中洗涤三次后，将载玻片置于冰上，用含有 0.4 微克/毫升 DAPI 和预冷的含 0.5% Triton-X 的 PBS 溶液对细胞核进行标记，孵育 15 分钟，随后再用 PBS 进行三次最终洗涤。根据实验需要，使用含荧光微球的封片剂将盖玻片封固于载玻片上。用无菌擦拭纸去除多余的封片剂后，以透明指甲油在每张载玻片上封固一片盖玻片，多层涂抹以确保密封，并使用荧光显微镜确认实验是否成功完成。

可在封片后一小时至一周内，使用共聚焦显微镜以630倍放大倍数采集样品图像。这些具有代表性的FISH和免疫荧光结果为半定量性质，主要用于揭示寡核苷酸的定位情况，而非不同荧光染料之间强度的比较，因为这些实验的载玻片制备过程中未包含荧光微球。在这些实验中，潜伏感染和裂解性感染的KSHV细胞其细胞质与细胞核区域及其比值均有所不同。

如图所示，面积受核质比的调控。当在裂解期抑制KSHV DNA复制时，KSHV寡核苷酸转录本的早期裂解期蛋白转为主要定位于细胞质。然而，尽管病毒DNA复制受到抑制，KSHV加尾RNA仍定位于特定的细胞核位点。

从载玻片上移除腔室时，需注意工具上的黏合剂残留应尽可能少，并使用乙醇对细胞进行通透处理以削弱黏合剂的黏性。可同时进行QPCR、Western印迹和高通量测序等生物化学检测，以补充从显微图像中获得的定量数据。