Name: rRNA 2-O-甲基化的脱氧核糖核酸依赖性分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学习使用DNAzyme依赖性消化法分析酿酒酵母25S核糖体RNA的位点特异性2'-O-甲基化。该方法利用短DNA寡核苷酸快速检测snoRNA引导的甲基化事件，为分子生物学实验室提供了一种经济便捷的RNA修饰分析方案。

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感谢 Maya Wilson 和 Aneika Leney 对本文手稿的审阅。本工作由惠康信托基金和英国皇家学会联合资助的亨利·戴尔爵士研究员项目（200473/Z/16/Z）支持。

1. 菌株、培养基和缓冲液配方
<ol>
	<li>准备酵母（S. cerevisiae) 培养基，具体如下：YP（1% w/v 酵母提取物，2% w/v 细菌蛋白胨），以及&#160;20% w/v 的葡萄糖和半乳糖储备液</li>
	<li>按如下方法配制醋酸钠（NaAc）-EDTA（AE）缓冲液：50 mM NaAc pH 5.3 和 10 mM EDTA。</li>
	<li>配制10-23 DNAzyme 4×孵育缓冲液，成分为：24 mM Tris（pH 8.0）、60 mM NaCl；以及10-23 DNAzyme 4×反应缓冲液：200 mM Tris（pH 8.0）和600 mM NaCl。</li>
	<li>配制8-17 DNAzyme 2×反应缓冲液，具体如下：200 mM KCl，800 mM NaCl，100 mM HEPES（pH 7.0），15 mM MgCl₂2，以及 15 mM MnCl2.</li>
	<li>按如下方法配制10×MOPS缓冲液：200 mM MOPS、50 mM NaAc、1 mM EDTA，pH 7.0；以及1.5×上样变性缓冲液：50% v/v 甲酰胺、20% v/v 甲醛、1.5× MOPS缓冲液。</li>
	<li>获取 S. cerevisiae 菌株，BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0); GAL1::SNR13 （与BY4741相同但 GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 （与BY4741相同但 GAL1::SNR47:HIS3mX）可用于此分析的任何其他酵母菌株。</li>
</ol>
2. 脱氧核酶设计
<ol>
	<li>使用合适的数据库查找感兴趣的RNA序列或假定的甲基化位点。对于S. cerevisiae的snoRNA靶标，使用酵母snoRNA数据库：http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14</li>
	<li>为找到感兴趣的甲基化位点（例如snR13依赖性位点），选择“snR13”，并记录修饰核苷酸的位置（例如25S rRNA中由snR13引导的A2281）。</li>
	<li>使用合适的数据库查找修饰核苷酸上下游的序列。对于S. cerevisiae，使用酿酒酵母基因组数据库：https://www.yeastgenome.org/</li>
	<li>搜索目标基因名称，例如RDN25（编码25S rRNA）。</li>
	<li>在“sequence”选项卡中，当使用10-23 DNAzyme检测时，选择甲基化位点上游（5’臂）和下游（3’臂）各10-15个核苷酸；当使用8-17 DNAzyme时，则选择甲基化位点上游（5’臂）和下游（3’臂）各20个核苷酸。</li>
	<li>设计5’臂和3’臂的互补序列。</li>
	<li>用5’臂和3’臂的互补序列分别从两侧连接10-23或8-17 DNAzyme的催化序列。</li>
	<li>向供应商订购该DNAzyme作为常规DNA寡核苷酸。</li>
</ol>
3. S. cerevisiae 生长条件
注意：使用酿酒酵母（S. cerevisiae）BY4741菌株的衍生株，其中SNR13或SNR47小核仁RNA（snoRNA）的表达由可诱导的GAL1启动子驱动。为诱导或抑制其合成，需将细胞培养在含半乳糖的培养基中（启动GAL1依赖性转录）或含葡萄糖的培养基中（抑制GAL1依赖性转录）。作为对照，使用野生型菌株（BY4741）分别在半乳糖或葡萄糖培养基中培养。
<ol>
	<li>在适当的培养基和条件下培养酵母菌株。为分析 GAL1::SNR13 和 GAL1::SNR47 菌株以及相应的野生型菌株，将细胞在 50 mL 含 2% 葡萄糖（YPD）或半乳糖（YPGal）的 YP 培养基中，于 30 °C 培养至对数生长中期。</li>
	<li>在 4 °C 下以 1,000 xg 离心 3 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，保留沉淀。</li>
	<li>用液氮速冻细胞沉淀，并在 -80 °C 保存。 
	注意：液氮可能导致严重的低温灼伤。操作时务必穿戴防护服并采取安全防护措施。 
	备注：细胞沉淀可在 -80 °C 保存长达 1 个月。如需暂停，可在本步骤中断实验流程。</li>
</ol>
4. RNA 提取15
注意：采用最适宜的方法分离 RNA。对于酵母 S. cerevisiae，可使用热酚法提取 RNA。
<ol>
	<li>加入 1 mL 冰冷的水，重悬沉淀，并将重悬的细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 20,000 ×g 离心 10 秒，弃去上清液。</li>
	<li>加入 400 µL AE 缓冲液，重悬细胞。 
	注意：步骤 4.4–4.15 除非另有说明，均在室温下进行。</li>
	<li>加入 40 µL 10% SDS 和 400 µL 酸性苯酚（pH 4.5）。 
	注意：苯酚具有毒性，应在通风橱中操作。使用苯酚时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。</li>
	<li>涡旋振荡 20 秒，充分混匀。</li>
	<li>在 65 °C 孵育 10 分钟。每 2 分钟轻轻打开并关闭管盖以释放压力，并翻转管子 2–3 次以混匀两相。</li>
	<li>将离心管转移至 -80 °C，孵育 10 分钟。</li>
	<li>在实验台上解冻离心管，并在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上层液体转移至另一新管中，该管内含有 400 µL 酸性苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。注意不要搅动中间相。 
	注意：氯仿具有毒性，应在通风橱中操作。使用氯仿时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。</li>
	<li>涡旋振荡 30 秒，充分混匀，然后在室温下以 20,000 ×g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上层液体（约 400 µL）转移至另一新管中，该管内含有 400 µL 氯仿。</li>
	<li>涡旋振荡 30 秒，充分混匀，然后在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上层液体（约 300–350 µL）转移至另一新管中，该管内含有 1 mL 乙醇和 40 µL 7.5 M 醋酸铵（NH4AC）。通过轻轻翻转管子数次进行混匀。</li>
	<li>在 -80 °C 孵育 2 小时，或在 -20 °C 过夜。 
	注意：此处可暂停实验流程。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 ×g 离心 10 分钟。管底将可见少量白色 RNA 沉淀。</li>
	<li>用移液器小心吸除乙醇，避免扰动沉淀。</li>
	<li>加入 1 mL 70% 乙醇，在室温下以 20,000 ×g 离心 5 分钟。</li>
	<li>用移液器吸除 70% 乙醇。</li>
	<li>以 20,000 ×g 离心 15 秒，然后用 2–20 µL 移液器吸除残留的乙醇。</li>
	<li>将离心管敞口置于实验台上 5 分钟，使 RNA 沉淀干燥。 
	注意：RNA 沉淀干燥后颜色会由白色变为透明。</li>
	<li>用 30 µL 无 RNase/DNase 的 H2O 重悬 RNA 沉淀，立即将离心管置于冰上，并使用微量分光光度计测定 RNA 浓度。</li>
	<li>将样品在 -20 °C 冻存。 
	注意：RNA 可在 -20 °C 保存长达 1 个月，或在 -80 °C 保存长达 1 年。此处可暂停实验流程，或直接进入下一步。</li>
</ol>
5. DNA酶消化
<ol>
	<li>10-23 DNAzyme 消化
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 离心管中，将 5 µg RNA、200 pmol 10-23 DNAzyme（100 μM 储存液 2 µL）和 2.5 µL 4x 10-23 孵育缓冲液混合，总体积为 10 µL，配制孵育混合液。将离心管置于冰上。</li>
		<li>将离心管转移至设定为 95 °C 的干式加热块中，孵育 3 分钟。</li>
		<li>立即将离心管转移至冰上，孵育 5 分钟。</li>
		<li>短暂离心，然后将离心管放回冰上。</li>
		<li>加入 20 U RNase 抑制剂（例如 0.5 µL RiboLock RNase 抑制剂）。</li>
		<li>将离心管置于设定为 25 °C 的干式加热块中，孵育 10 分钟。</li>
		<li>同时，在 1.5 mL 离心管中配制反应混合液：将 5 µL 4x 10-23 反应缓冲液与 4 µL 300 mM MgCl2 和 1 µL H2O 混合。将该离心管置于设定为 37 °C 的干式加热块中。</li>
		<li>将孵育混合液转移至设定为 37 °C 的干式加热块中，加入 10 µL 预热的反应混合液。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育反应 1 小时。</li>
		<li>将离心管转移至冰上，继续进行步骤 5.3.1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>8-17 DNAzyme 消化
	<ol>
		<li>在 1.5 mL 微量离心管中加入 5 µg RNA，总体积为 6 µL。将离心管置于冰上。</li>
		<li>在 1.5 mL 微量离心管中加入 400 pmol 8-17 DNAzyme（100 μM 储存液 4 µL）。将离心管置于冰上。</li>
		<li>将离心管转移至设定为 95 °C 的干式加热块中，孵育 2 分钟。</li>
		<li>将 RNA 样品转移至冰上。</li>
		<li>短暂离心 DNAzyme 管 5 秒，并在 25 °C 下孵育 10 分钟。</li>
		<li>同时，在 1.5 mL 离心管中加入 10 µL 2x 8-17 反应缓冲液，并在 25 °C 下孵育。</li>
		<li>通过将 10 µL 预热的 2x 反应缓冲液加入 DNAzyme 管中，配制反应混合液。</li>
		<li>将 14 µL 反应混合液转移至 RNA 管中，并加入 20 U RNase 抑制剂。</li>
		<li>在 25 °C 下孵育反应 2 小时。</li>
		<li>将离心管转移至冰上，继续进行 RNA 纯化（步骤 5.3.1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 纯化
	<ol>
		<li>向反应管中加入 350 µL 水和 400 µL 氯仿，涡旋振荡 30 秒充分混匀，然后在室温下以 20,000 xg 离心 5 分钟。</li>
		<li>将上层相（约 300–350 µL）转移至另一新管中，该管内已含有 1 mL 乙醇、40 µL 7.5 M NH4AC 和 1 µL 糖原（10 µg/µL）。通过轻轻翻转离心管数次进行混匀。</li>
		<li>在 -80 °C 下孵育 2 小时，或在 -20 °C 下过夜孵育。 
		注意：此处可暂停操作。</li>
		<li>重复步骤 4.15 至 4.21。</li>
		<li>用 10 µL 无 RNase/DNase 的 H2O 重悬 RNA 沉淀，并立即将离心管置于冰上。</li>
		<li>将样品在 -20 °C 下冷冻。 
		注意：RNA 可在 -20 °C 下保存长达一个月，在 -80 °C 下保存长达一年。此处可暂停操作，或继续进行 RNA 电泳。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. RNA 电泳
<ol>
	<li>用1% SDS喷洒电泳设备（电泳槽、制胶托盘、梳子），静置15分钟，然后用大量ddH2O冲洗。</li>
	<li>将1.5 g琼脂糖加入127.5 mL ddH2O中，通过微波加热使其溶解。</li>
	<li>向琼脂糖溶液中加入15 mL 10× MOPS缓冲液和7.5 mL 37%甲醛（总体积为150 mL）。 
	注意：甲醛具有毒性，应在通风橱中操作。使用甲醛时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。</li>
	<li>向琼脂糖溶液中加入适量所选凝胶染料（例如，15 µL SYBR Safe DNA凝胶染料）。充分混匀后将琼脂糖倒入制胶托盘中。</li>
	<li>立即在凝胶中插入梳子。</li>
	<li>在通风橱中静置45分钟。若使用对光敏感的凝胶染料，需用铝箔覆盖托盘。</li>
	<li>配制600 mL 1× MOPS缓冲液。</li>
	<li>RNA样品制备
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中，加入10 µL经消化和纯化的RNA样品、5 µL样品变性缓冲液和0.5 µL 6×上样染料。 
		注意：甲酰胺具有毒性，应在通风橱中操作。使用甲酰胺时务必穿戴实验服、防护手套和护目镜。废液应按照机构规定进行处理。</li>
		<li>将RNA样品在70 °C孵育5分钟，随后转移至冰上，继续孵育5分钟。</li>
		<li>上样前短暂离心收集样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将凝胶放入电泳槽中，并加入1× MOPS缓冲液至覆盖凝胶。将每个样品的全部体积（15 µL）上样至凝胶中，在80 V电压下电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3处。</li>
	<li>使用适合检测所选凝胶染料的成像仪对凝胶进行成像（例如，紫外透射仪）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

依赖脱氧核酶（DNAzyme）的消化可作为一种简单快速的方法，用于分析位点特异性的RNA 2’-O-甲基化12,13。当切割位点上游的核苷酸未被甲基化时，脱氧核酶即可切割RNA。与其他方法（如RNase H介导的消化、碱性降解，或在低浓度核苷酸条件下进行逆转录后结合定量PCR或测序）8,10,11,16相比，脱氧核酶方法仅需一条简单的DNA寡核苷酸以及分子生物学实验室中常见的基本试剂。此外，脱氧核酶还可用于类似地分析由H/ACA盒snoRNA介导的RNA假尿苷化12，这使其成为研究snoRNA靶标时的多功能工具。
DNA酶依赖性方法的适用范围仅受限于切割位点的共识序列17。10-23 DNA酶仅能用于分析RY二核苷酸中R位点的2’-O-甲基化，而8-17 DNA酶则可识别位于鸟嘌呤上游的核苷酸修饰。因此，诸如鸟嘌呤-腺嘌呤（GA）、腺嘌呤-腺嘌呤（AA）、嘧啶-腺嘌呤（YA）和嘧啶-嘧啶（YY）二核苷酸中第一个核苷酸的2’-O-甲基化等修饰则无法被检测。此外，还需考虑DNA酶依赖性切割效率较低的问题12。尽管某些DNA酶几乎能够完全切割RNA（图3B），但许多DNA酶仅能部分消化其靶标（图3B）。切割效率可能取决于切割位点周围的序列。例如，含有连续相同核苷酸的RNA区域可能影响DNA酶活性序列的正确结合位置。此外，形成强二级结构的RNA区域可能发生重新杂交，从而抑制DNA酶与靶序列的结合。为克服这些问题，可对10-23 DNA酶及其RNA底物进行反复的加热和冷却循环处理18。
我们采用DNA酶法来研究rRNA的2’-O-甲基化。也可 &#160;使用该技术分析其他RNA修饰，例如N6m⁶A（N6-甲基腺苷）19核糖体RNA由于含量丰富，可通过电泳进行分析，并在紫外光下直接观察其切割产物。然而，该方法不适用于丰度较低的RNA，如RNA聚合酶II生成的编码RNA（mRNA）和非编码RNA（ncRNA）。这类RNA通常无法通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的RNA染色直接检测。在此类情况下，DNAzyme依赖性切割可通过Northern印迹法进行可视化，或通过PCR/定量PCR间接检测，也可利用能够区分2′-O-甲基化RNA与非甲基化RNA的聚合酶（例如KlenTaq DNA聚合酶）进行定量PCR分析。20,21.

RNA 修饰在基因表达调控中发挥着重要作用。由 C/D 盒和 H/ACA 盒小核仁 RNA（snoRNA）分别引导的 RNA 2’-O-甲基化和假尿苷化，能够保护 RNA 免受降解，并稳定其高级结构1,2,3。目前已鉴定的 snoRNA 靶标主要存在于核糖体 RNA（rRNA）和小核 RNA（snRNA）中。然而，在高等真核生物中，可能存在数百种功能尚未明确的 snoRNA，其中部分 snoRNA 可能识别多种 RNA1,4,5,6,7。因此，能够识别和分析 snoRNA 引导的修饰的方法，是揭示细胞过程调控机制的重要工具。
可通过生物信息学方法鉴定由C/D盒snoRNA引导的潜在2’-O-甲基化位点，并利用多种实验技术加以验证，包括RNase H介导的切割，以及依赖于低浓度脱氧核苷三磷酸（dNTPs）条件下逆转录反应的位点特异性或全基因组范围方法8,9,10,11。这些技术灵敏度高，但操作繁琐且成本较高，因此可能不适用于初步或快速检测。其中一种最简单且低成本的鉴定2’-O-甲基化位点的方法是DNA酶依赖性RNA切割法12。DNA酶是一类短的单链、具有催化活性的DNA分子，能够特异性地在RNA的特定位置进行内切酶样切割。其结构包含一个保守且具有催化活性的核心序列，以及位于5’和3’端的结合臂，这些结合臂由可变序列组成，设计用于通过Watson-Crick碱基配对与目标RNA杂交（图1）。因此，5’和3’结合臂可将催化核心递送至RNA上的特定位点。当切割位点上游紧邻的核苷酸发生2’-O-甲基化修饰时，DNA酶介导的切割反应会被抑制12,13。这一特性使得DNA酶成为分析潜在或已知RNA 2’-O-甲基化位点的非常实用的工具。
有两种类型的脱氧核酶用于RNA修饰分析12。10-23脱氧核酶的活性序列（图1A）由15个核苷酸（5’RGGCTAGCTACAACGA3’）组成，可在靶向的RNA嘌呤-嘧啶（RY）二核苷酸周围形成一个环状结构，并催化这两个核苷酸之间的断裂。RNA上的嘌呤（R）不与脱氧核酶发生碱基配对，且脱氧核酶上的2’-O-甲基化会抑制切割反应。10-23脱氧核酶的结合臂通常为10至15个核苷酸长。第二类脱氧核酶8-17脱氧核酶（图1B）含有14个核苷酸的催化序列（5’TCCGAGCCGGACGA3’）。其中核苷酸C2、C3和G4分别与C9、G10和G11配对，形成一个短的茎环结构。8-17脱氧核酶可在任何鸟嘌呤上游切割RNA，该鸟嘌呤与脱氧核酶活性序列的第一个胸腺嘧啶不完全配对。鸟嘌呤上游的RNA核苷酸不与脱氧核酶碱基配对，其2’-O-甲基化会阻碍切割反应。8-17脱氧核酶需要约20个核苷酸长度的同源臂，以引导脱氧核酶靶向特定序列。
本文提供了一种利用10-23和8-17 DNA酶依赖性方法分析酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）核糖体RNA中2’-O-甲基化的分步实验方案12,13（图1C）。该方案可轻松适用于其他生物体和RNA种类，可用于快速进行位点特异性的RNA 2’-O-甲基化的初步或深入分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸性酚</td><td>SIGMA</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>VWR</td><td>A2114</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>SIGMA</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher scientific</td><td>10293850</td><td></td></tr><tr><td>无DNase/RNase水</td><td>Fischer Scientific</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyme</td><td>Integrated DNA Technology</td><td>定制寡核苷酸DNA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Fisher scientific</td><td>10437341</td><td></td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>半乳糖</td><td>SIGMA</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>SIGMA</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>异戊醇</td><td>SIGMA</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;em&gt;2&lt;/em&gt;</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;em&gt;2&lt;/em&gt;</td><td>SIGMA</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>SIGMA</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid蛋白胨（细菌培养用）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid酵母提取物粉末</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase抑制剂（40 U/&amp;micro;L）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SIGMA</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>SIGMA</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA凝胶染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>SIGMA</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>152VR5C01M -80&amp;deg;C超低温冰箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL锥形瓶</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combicup VX200涡旋振荡器</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-11微量分光光度计</td><td>Denovix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳槽（20 cm托盘）</td><td>SIGMA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FiveEasy F20 pH计</td><td>Appleton Woods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 21微量离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 8R离心机（配备适用于50 mL离心管的转子）</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge Plus小型离心机</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer HC恒温金属浴</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OLS26摇床水浴锅</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac电源供应器</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna酶依赖性分析rrna的2'-o-甲基化

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

导向盒C/D型核仁小RNA（snoRNA）可催化核糖体RNA和核小RNA的2’-O-甲基化。然而，在高等真核生物中，大量snoRNA可能非特异性地识别其他RNA分子，并对多个靶点进行2’-O-甲基化。本文提供了一种快速且低成本的位点特异性2’-O-甲基化分析方法的分步操作指南，该方法采用一种已建立的、使用短DNA寡核苷酸（称为DNA酶，DNAzymes）的技术。这些DNA片段包含催化序列，可在RNA的特定共识位点进行切割，同时具有可变的同源臂，用于引导DNA酶靶向特定RNA序列。当RNA切割位点邻近的核苷酸发生2’-O-甲基化时，DNA酶的活性将受到抑制。因此，DNA酶仅受限于被切割序列的共识序列，是快速分析snoRNA介导的RNA 2’-O-甲基化的理想工具。我们以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中由snoRNA snR13和snR47指导的25S核糖体RNA的2’-O-甲基化为例，展示了该技术的简便性，并提供了基于DNA酶检测方法的详细实验方案。

最近在snoRNA成熟的研究背景下，已证明DNA酶依赖性切割在rRNA修饰分析中的应用价值13。该DNA酶依赖性检测方法被用于证明，S. cerevisiae中pre-snoRNA 5’端前体加工的缺失会影响25S和18S rRNA的2’-O-甲基化水平13。
在此，我们使用了一种可诱导的snoRNA转录系统，以展示该技术的有效性和简便性。Box C/D snR13引导25S rRNA上两个位点的甲基化，包括腺嘌呤2281（图2A）。该核苷酸后接尿嘧啶，构成10-23 DNA酶可切割的共识二核苷酸（RY）。Box C/D snR47也在25S rRNA上引导两个核苷酸的甲基化（图2B）。第2220位的腺嘌呤后接鸟嘌呤残基，该二核苷酸可被8-17 DNA酶切割。为了诱导或抑制snR13或snR47 snoRNA的合成，我们将可诱导的GAL1启动子插入SNR13或SNR47基因的上游，并在含有半乳糖（GAL1依赖性转录开启）或葡萄糖（GAL1依赖性转录关闭）的培养基中培养细胞。随后，将来自GAL1::SNR13细胞的RNA与设计用于在snR13依赖性位点（即核苷酸2281与2282之间）切割25S rRNA的10-23 DNA酶共同孵育（图2C）。来自GAL1::SNR47菌株的RNA则用靶向snR47依赖性位点（即核苷酸2220与2221之间）的8-17 DNA酶处理（图2D）。作为对照，将野生型BY4741菌株在半乳糖或葡萄糖上生长时提取的RNA分别与两种DNA酶共同孵育。DNA酶处理后的RNA电泳结果显示，从在半乳糖（GAL）上生长的GAL1::SNR13和GAL1::SNR47菌株中提取的25S rRNA保持完整（图3A、B；第3道）。相比之下，从在葡萄糖（GLC）上生长的GAL1::SNR13和GAL1::SNR47细胞中分离的RNA被相应的DNA酶消化（图3A,B；第4道）。在这两种情况下，25S rRNA条带减少，并观察到5’和3’端的切割产物（A和B）。这表明，在GAL1::SNR13和GAL1::SNR47菌株中，当以半乳糖作为碳源且这些snoRNA表达时，25S rRNA在snR13或snR47引导的位点发生了2’-O-甲基化。当在葡萄糖条件下关闭snR13或snR47的表达时，25S rRNA缺乏甲基化，从而允许DNA酶依赖性切割。在野生型样品中未观察到RNA降解（图3A、B；第1和第2道），因为该菌株中snR13和snR47的表达不依赖于半乳糖/葡萄糖。因此，rRNA正常甲基化，对DNA酶活性具有抗性。
总体而言，我们的实验表明，10-23（图3A）和8-17（图3B）DNA酶的切割活性与缺失box C/D类snR13或snR47小核仁RNA相关，明确表明这些小核仁RNA负责25S rRNA在特定位点的2’-O-甲基化。
<img alt="DNAzyme切割过程示意图；序列、切割途径、实验工作流程步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：DNAzyme及其RNA底物。（A）10-23 DNAzyme切割一个嘌呤-嘧啶（RY）RNA二核苷酸。RNA中的R不与DNAzyme配对，而Y与DNAzyme中的R碱基互补。RNA中嘌呤（R）的甲基化会抑制DNAzyme依赖性切割。（B）8-17 DNAzyme在鸟嘌呤上游切割RNA，该鸟嘌呤与DNAzyme催化序列中的第一个胸腺嘧啶不完全配对。鸟嘌呤前的核苷酸未配对，其甲基化可防止DNAzyme依赖性切割。RNA以灰色显示（甲基化位点除外），DNAzyme以紫色显示。N = 任意核苷酸，R = 嘌呤：腺嘌呤或鸟嘌呤，Y = 嘧啶：胞嘧啶或尿嘧啶；CH3- 表示RNA甲基化。DNAzyme活性序列内的碱基配对以虚线标记。蓝色闪电符号标记切割位点。（C）显示DNAzyme依赖性分析步骤的流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="靶向snR13/snR47依赖性甲基化位点的脱氧核酶、基因序列分析、示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：靶向25S rRNA中snR13和snR47依赖性甲基化位点的DNAzyme。（A, B）浏览器截图显示25S rRNA中的snR13依赖性甲基化位点（A）和snR47依赖性甲基化位点（B）。（C）围绕snR13依赖性甲基化位点（A2281）的25S rRNA序列，以及设计用于在A2281与U2282之间切割RNA的10-23 DNAzyme（以紫色显示）。A2281不与DNAzyme配对，而U2282与DNAzyme活性序列的第一个核苷酸形成配对（由蓝线标记）。蓝色闪电符号标记切割位点。（D）围绕snR47依赖性甲基化位点（A2220）的25S rRNA序列，以及设计用于在A2220与G2221之间切割RNA的8-17 DNAzyme（以紫色显示）。A2220不与DNAzyme杂交，而G2221与胸腺嘧啶（T）不完全配对（以虚线表示）。蓝色闪电符号标记切割位点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNAzyme 处理凝胶电泳结果；25S 和 18S rRNA 条带；snR13、snR47 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用 10-23 和 8-17 DNAzyme 依赖性检测方法分析 25S rRNA 位点特异性 2’-O-甲基化。（A）使用 10-23 DNAzyme 分析 snR13 依赖性的 25S rRNA 甲基化。（B）使用 8-17 DNAzyme 分析 snR47 依赖性的 25S rRNA 甲基化。RNA 在变性琼脂糖凝胶中染色后进行可视化。裂解产物 A 和 B 用红色箭头标出。WT = 野生型菌株；GAL = 半乳糖，GLC = 葡萄糖。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍一种依赖脱氧核酶（DNAzyme）的RNA切割实验方案。该方法可实现对RNA 2’-O-甲基化的快速且位点特异性的分析，可用于对snoRNA活性进行初步或主要评估。

DNA酶依赖性分析rRNA的2'-O-甲基化

向导盒C/D类小核仁RNA（snoRNA）催化核糖体RNA和小核RNA的2′-O-甲基化。然而，大量snoRNA在……

DNA酶依赖性消化是研究snoRNA功能的一种有用方法。该方法可快速、简便地分析特定位点的RNA甲基化，仅需一条短的DNA寡核苷酸以及分子生物学实验室中常见的基本试剂。首先针对目标序列设计脱氧核酶（DNAzyme）。利用合适的数据库查找RNA序列或推测的甲基化位点。对于酿酒酵母（S. cerevisiae）的snoRNA靶标，使用酵母snoRNA数据库。为了找到感兴趣的甲基化位点，例如依赖snR13的位点，选择snR13并记录修饰核苷酸的位置。使用适当的数据库（如酿酒酵母基因组数据库）查找该修饰核苷酸上下游的序列。搜索目标基因名称。若使用10至23 DNAzyme检测，应在甲基化位点的上游和下游各选择10至15个核苷酸。若使用8-17 DNAzyme，则选择20个核苷酸。设计5'端和3'端臂的互补序列，并将其分别置于DNAzyme催化序列的3'端和5'端两侧。将DNAzyme作为普通的DNA寡核苷酸进行订购。在适当的培养基和条件下培养目标酵母菌株。当细胞生长至对数中期时，在4°C条件下以1,000 × g离心3分钟收集菌体，并弃去培养基。按照手稿说明进行RNA提取。然后，将RNA沉淀重悬于30 µL无RNase和DNase的水中。将离心管置于冰上，并使用微量分光光度计测定RNA浓度。使用10至23 DNA酶进行DNA酶消化时，配制反应体系：包含5微克RNA、200皮摩尔的10至23 DNA酶以及1× 10至23 DNA酶反应缓冲液，总体积为10微升。随后，将反应管置于95摄氏度的干式加热块中孵育3分钟。孵育结束后立即置于冰上，保持5分钟。短暂离心收集管内液体后，立即将离心管放回冰上。加入20单位RNase抑制剂，将离心管置于设定为25°C的干式加热块中孵育10分钟。同时，通过混合5微升4×10至23反应缓冲液、4微升300摩尔氯化镁和1微升水来配制反应混合液。将该反应混合物置于设定为 37 摄氏度的干式加热块上预热。将含有孵育混合物的离心管放在 37 摄氏度的干式加热块上，加入 10 微升预热的反应混合物。在 37 摄氏度下孵育混合物 1 小时，然后将离心管置于冰上。使用8-17 DNAzyme进行DNAzyme消化时，准备一个1.5毫升的微量离心管，其中含有5微克RNA，总体积为6微升。然后，另准备一个管子，加入400皮摩尔的8-17 DNAzyme。操作过程中，将两个管子均置于冰上保存。将两个离心管转移至设定为95摄氏度的干式加热块中，孵育两分钟。将RNA样本放回冰上，并将含有DNAzyme的离心管离心五秒钟。在25摄氏度条件下孵育DNAzyme十分钟。在DNAzyme孵育的同时，准备10微升的2× 8-17反应缓冲液，并将其预热至25摄氏度。将预热的缓冲液加入含有DNAzyme的离心管中，然后取14微升该反应混合物转移至含有RNA的离心管中，同时加入20单位的RNase抑制剂。在25摄氏度下孵育反应体系2小时，随后将离心管置于冰上。在DNA酶消化后纯化RNA时，向反应管中加入350微升水和400微升氯仿。涡旋振荡30秒，然后在20,000 × g离心5分钟。离心后，将上层液体转移至含有1毫升乙醇、40微升7.5摩尔/升乙酸铵和1微升糖原的新管中。轻轻翻转离心管数次以混匀，随后在-80°C条件下孵育2小时，或在-20°C条件下过夜。按照论文中的说明进行RNA纯化，然后将RNA沉淀重悬于10 µL无RNase和DNase的水中。纯化后立即将RNA离心管置于冰上。进行RNA电泳时，首先将1.5克琼脂糖溶于127.5毫升双蒸水中，通过微波炉加热溶解混合物。然后向琼脂糖溶液中加入15毫升10X MOPS缓冲液和7.5毫升37%甲醛。向琼脂糖溶液中加入适量的凝胶染料。将琼脂糖倒入托盘中，静置冷却45分钟。通过将10微升消化并纯化的RNA与5微升上样变性缓冲液和0.5微升6×上样染料混合，制备RNA样品。将样品在70摄氏度孵育5分钟，随后置于冰上5分钟。将制备好的凝胶放入电泳槽中，并用一倍浓度的MOPS缓冲液充满电泳槽。将全部15 µL样品加入凝胶加样孔中，在80伏电压下电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3处。使用适当的成像设备对凝胶进行分析。该技术的价值可通过一个可诱导的snoRNA转录系统来展示。在snR13或snR47基因上游插入可诱导的GAL1启动子，可实现对snoRNA依赖性25S核糖体RNA甲基化的分析。当细胞在半乳糖培养基中生长时，25S核糖体RNA在snoRNA引导的位点发生甲基化，经DNAzyme处理后仍保持完整。相比之下，当由于缺乏半乳糖导致snoRNA表达被关闭时，会发生DNAzyme依赖性切割。此外，在野生型对照中未观察到RNA降解，因为snoRNA的表达不依赖于半乳糖。最近已有研究在snoRNA成熟过程中证实了DNAzyme依赖性切割在rRNA修饰分析中的应用。 采用依赖DNA酶的检测方法表明，在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，5′端及前体snoRNA的加工缺失会影响25S和18S rRNA的甲基化水平。该实验方案需使用有毒性的苯酚和氯仿，应在通风橱中操作。

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