将鼠皮皮和皮米与热解辛分离，以检测部位特异性炎症mRNA和蛋白质
2021年9月29日
这里介绍的是一个表皮与真皮分离的协议，用于评估炎症调解器的产生。炎症后，大鼠后爪表皮在4°C下由热利辛从真皮中分离出来。 然后，通过RT-PCR进行表皮分析，通过西方污点和免疫造血术进行蛋白质评估。
我们的协议是一种易于使用和廉价的表皮-皮肤分离技术，用于确定炎症调解人和神经特罗芬在皮肤炎症期间的特定部位生产。该技术的主要优点是在四摄氏度下进行表皮与真皮的酶分离，保持mRNA和蛋白质的完整性。这种方法提供了对在急性和慢性炎症期间敏感初级发病终端的调解人的类型，以便开发新的治疗干预措施。
伤口愈合，皮肤病，慢性伤口和烧伤可以受益于这项研究。这种方法可以应用于其他上皮表面，如胃肠道和角膜。实验室之间的最佳分离时间可能略有不同。
建议将不同的时间点与二元形态评估相结合进行初步实验，以确定分离的质量。在确认对8至9周大的斯普拉格·道利大鼠的踏板反射缺乏反应后，皮下注射右光泽后爪，用PBS稀释的1X兰姆达卡拉吉南100微升。使用卡钳测量后爪骨质厚度，在注射前和注射后6小时和12小时，以确定水肿的体积，以响应刺激。
在适当的实验终点，使用锋利的手术刀从注射的爪子中收获一到两毫米的光泽后爪皮，并使用微分切钳将皮肤在冰上的微中心管中转移到一毫升冷DMEM中，为期15至60分钟。当组织孵育时，在冰上24井细胞培养板的10口井中加入1毫升新鲜制备的活性热解素。在孵化结束时，使用微分切钳将一个皮肤样本转移到每性热解硅井中，层角膜侧面，而不将样品浸入溶液中。
关键是皮肤不要浸入热解素中，并且层角膜要面对，才能实现有效的分离。两到三个小时后，使用微分切钳将一个皮肤样本浸入七到八毫升摄氏四度的DMEM中，让表皮与真皮分离的空间更大。使用钳子轻轻刷皮肤周围周围的表皮，直到在样本的边界观察到接近半透明的表皮。
当表皮明显地与真皮分离时，用一对钳子仔细把握每一层皮肤，然后慢慢地将表皮从真皮中拉出，然后通过光显微镜评估孤立表皮的半透明性，以确保其光学一致性。如果层已正确分离，将表皮和皮肤组织放入 DMEM 中 5 毫摩尔 EDTA 的单个容器中，在 4 摄氏度下放置 30 分钟。热解压素停用后，在室温下用搅拌将部分表皮固定在适当的固定剂中一小时。
在孵化结束时，将固定组织在PBS中10%蔗糖中放置一小时，在室温下搅拌，然后将样品冷冻在合适的组织嵌入基质中进行分割。使用低温统计仪获取 14 微米厚的横截面，并将这些部分解冻安装在明胶涂层玻璃显微镜滑梯上。在滑梯加热器上干燥后，用甲苯蓝色工作溶液将样品涂上 90 秒。
之后，用 PBS 轻轻地用幻灯片清洗蓝色，用水性安装介质对冲盖唇，然后以 50 到 250 倍的放大倍率观察布莱特菲尔德显微镜的表皮。卡拉吉南注射到大鼠后爪引起炎症的典型症状，如注射后6小时和12小时发红和水肿。布莱特菲尔德显微镜可用于评估大鼠粘性后爪皮肤表皮和真皮热解素分离的有效性。
事实上，表皮横截面的甲基蓝染色表明表皮与基线膜上的真皮分离，但表皮斜面和皮帕皮拉的凹痕保持不变。此外，还观察到所有的角蛋白细胞层。分离表皮的温利辛的西层印迹产生一致的结果，表明在4摄氏度的技术中蛋白质水平稳定。
在天真的老鼠表皮中检测到的NGF蛋白很少，但是NGF蛋白水平在卡拉吉南引起的炎症6小时后显著提高。注射后12小时，NGF水平与6小时观察到的水平相比降低，但相对于对照组，NGF水平仍然较高。正如西方斑点分析所预料的，NGF免疫反应没有在天真的控制表皮组织样本中检测到，但在卡拉吉南诱发炎症后的六小时内，在地层颗粒和地层清醒的大多数角膜细胞中观察到NGF免疫反应。
层脊柱的一些细胞也具有NGF免疫反应。当使用热解质分离完好的表皮时，重要的是要记住，最佳分离时间必须由最终用户根据经验确定。各种蛋白质和分子技术可用于验证特定蛋白质和/或原发基因转录的表达，以确认此过程不会改变基础表达。
这种表皮-皮肤分离技术将使研究人员能够回答关于不同皮肤炎症模型中神经特罗芬和炎症介导器的特定部位表达的其他问题。皮里克酸和副甲醛是危险的。在烟气罩中处理这两种化学品，使用个人防护服和手套，处理后洗脸和洗手。
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概述
本协议概述了一种有效的方法，用于分离表皮和真皮以评估炎症介质的产生。该技术在4 掳C 的温度下使用热溶素来保持mRNA和蛋白质的完整性以供后续分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 炎症生物学
- 皮肤病学
背景
- 了解炎症介质对于开发治疗干预至关重要。
- 皮肤炎症影响各种状况，包括慢性伤口和烧伤。
- 保持生物样本的完整性对于准确分析至关重要。
- 该方法可以适用于其他上皮组织。
研究目的
- 评估皮肤炎症过程中炎症介质在特定部位的产生。
- 提供对神经营养因子在炎症反应中产生的见解。
- 促进可能导致新型治疗策略的研究。
使用的方法
- 使用热溶素将表皮与真皮酶解分离。
- 在4 掳C 的温度下进行分离以保持mRNA和蛋白质的完整性。
- 通过RT-PCR分析mRNA。
- 通过蛋白质印迹和免疫组化评估蛋白质。
主要结果
- 成功分离表皮和真皮，同时保持样本完整性。
- 识别能够使初级传入终端敏感化的炎症介质。
- 在伤口愈合和皮肤疾病研究中的潜在应用。
- 该方法可适用于其他上皮表面，如胃肠道。
结论
- 该协议提供了一种研究皮肤炎症反应的可靠方法。
- 获得的见解可以为皮肤相关疾病的治疗方法提供信息。
- 进一步的研究可能探讨不同实验室之间最佳分离时间的差异。
常见问题
Executive Industry Relevance
Site-specific separation of rat epidermis and dermis using cold thermolysin enables precise quantification of inflammatory mRNA and protein in distinct skin layers. This workflow supports mechanistic de-risking and target validation for inflammatory mediators and neurotrophins relevant to dermatological and wound-healing research. The protocol's preservation of molecular integrity at low temperatures enhances predictive confidence for downstream translational studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of site-specific inflammatory mediator and neurotrophin expression in skin injury models.
- Supports biological de-risking by maintaining mRNA and protein integrity during tissue separation.
- Facilitates functional target validation for mediators implicated in acute and chronic inflammation.
- Improves predictive confidence for advancing skin inflammation targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, intact epidermal and dermal samples for quantitative molecular assays.
- Enables reproducible RT-PCR, western blot, and immunohistochemistry analyses of separated layers.
- Supports assay standardization by preserving tissue architecture and molecular content.
- Provides reliable biological material for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for skin inflammation, wound healing, and sensitization.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of inflammatory biomarkers.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust molecular readouts.
- Facilitates adaptation to other epithelial tissues, broadening translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling precise molecular analysis of skin layers following inflammatory challenge.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for mediator localization and pathway involvement in skin inflammation.
- Screening: Provides standardized, reproducible samples for quantitative molecular assays.
- Analytics: Delivers robust mRNA and protein measurements for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects site-specific molecular changes to disease-relevant endpoints in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow adaptable to various epithelial tissues and inflammatory models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in skin inflammation research.
- Operational Value: Standardizes tissue separation and molecular analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and cross-program applicability in dermatology and inflammation portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, enzymatic digestion, and molecular analysis.
- Needs access to cold incubation, microdissection tools, and analytical platforms for RT-PCR and western blotting.
- Demands cross-team standardization of separation times and quality control via morphology evaluation.
- Adaptable to other epithelial tissues with empirical optimization of separation parameters.
- Optimal separation time and tissue handling must be empirically determined for each lab setting.
