用于狂犬病诊断的泛源病毒实时RT-PCR

这种实时RT-PCR适用于在验尸和验尸样本中快速诊断狂犬病。泛利萨病毒底板经过优化，可识别莱萨病毒属的所有成员。这是一种快速、敏感和闭管检测，可检测来自莱萨病毒属的病毒，包括来自临床标本的极致物种。

国际动物技术动物技术动物技术委员会最近接受了分子检测，以报告狂犬病感染。这对于不能总是通过病毒培养或抗原检测方法诊断的分解标本尤其重要。由于这种测定的敏感性，良好的实验室实践，包括不同阶段的分离，对于尽量减少污染风险至关重要。

演示这个程序的将是黛西詹宁斯，一个诊断师从我的实验室。首先使用微体积分光光度计量化RNA。确保机器设置为RNA，并使用一至两微升分子级水使机器正常化并建立基线。

测量RNA浓度，并调整到每微升1微克。使用电子表格规划 PCR 板的布局，同时考虑测试和控制样本。通过消毒表面准备 PCR 工作站，如果使用 UV 柜，请于启动前 10 分钟打开 UV 光。

从冰柜中取出试剂和底片解冻，但随时将酶混合物留在冰上。将试剂和离心机短暂混合以收集液体。根据手稿说明为 Lyssa 病毒和 Beta-Actin 准备 PCR 主混合物。

将主混合物留在冰上，直到准备好使用。混合和离心准备好的主混合，并分配19微升到PCR机兼容板或管条的相关孔。在单独的房间或紫外线柜中，小心添加一微升准备好的RNA。

如果使用 UV 机柜，请于启动前 10 分钟打开 UV 光。测试样本后，添加正向控件和无模板控件。将 RNA 添加到主混合物时，请确保将 RNA 添加到正确的井中。

使用板计划来帮助此步骤。密封板检查盖子是否平整在板上，然后向下旋转以收集井底的所有液体。确保每一个井的液体体积相同，并且没有气泡可见。

然后将样品转移到 PCR 机器。打开程序选择 SYBR 绿色与分离。选择要分析的井选择未知为样品类型，选择SYBR作为荧光染料。

使用样品信息（包括检测是 Lyssavirus L 还是 Beta-Actin）在板布局上标记孔。单击热配置文件设置，并修改手稿中指定的热循环条件。单击"开始"然后选择一个位置以保存文件，然后选中该复选框以在运行结束时关闭灯。

当在灯预热出现之前启动的选项时，单击"立即运行"，但确保灯预热时间少于 15 分钟。完成 PCR 运行后，继续数据分析。首先，分析莱萨病毒扩增图。

正样本显示指数渐变，而负样本具有无 CT 值的平面放大图。接下来，分析测试样本与对照样品一起的莱萨病毒分离曲线结果。Lyssa 病毒阳性样本的熔化温度介于 77 至 80 摄氏度之间，并且与阳性控制重叠。

接下来，分析 Beta-Actin 放大图和分离曲线与控件进行比较，以解释总体结果。查看文本报告并使用详细信息记录控制卡中为控制 RNA 获得的 CT 和 TM 值，以确认运行成功，并报告测试样本结果。该协议用于演示泛莱萨病毒RT-PCR对控制标准病毒的RNA稀释序列的敏感性。

放大曲线表明，只要能检测到10个Lyssa病毒的象形图，分离曲线就可以验证产品的熔化温度。熔化温度用于确认安培康是莱萨病毒特异性的。这里的结果表明，莱萨病毒属的温度范围为77.34至79.67摄氏度。

低于 76.8 或 80.2 的熔融温度值被视为非特异性。这种RT-PCR测定的敏感性也是通过检测三个Lyssa病毒阳性大脑样本的RNA确定的。每微升目标RNA只能检测到0.1个图谱，三个样本中的两个。

值得注意的是，所有公认的莱萨病毒物种的代表都使用这种检测方法被检测。如果分析来自临床样本（如唾液或CSF）的RNA提取物，由于缺少宿主核酸，β-Actin的结果可能是阴性。添加外源控件可以解决此问题。

建议对莱萨病毒阳性样本进行测序，以提供有关狂犬病感染的地理和宿主来源的其他信息。处理莱萨病毒阳性或疑似阳性样本必须遵循当地健康和安全准则。提取的RNA是非传染性的，因此可以在低密封实验室内处理。