Name: 用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 了解用于大分子X射线晶体学的一体式样品支架，该支架可在无需操作晶体的情况下实现原位生长和数据采集，适用于常温和低温环境，显著降低背景散射并提高实验效率。

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作者感谢由柏林亥姆霍兹中心运营的BESSY II提供的光束时间及支持，同时感谢样品环境部门和技术设计部门在设计与建造方面提供的帮助，以及对3D打印设备的使用许可。

警告：在后续所有操作中，必须避免用手直接接触黄色聚酰亚胺薄膜，以防对样品台造成污染。同时，强烈建议使用防护镊子进行操作。
1. 样品架
<ol>
	<li>使用三种样品架中的一种。 
	注意：新开发的样品架有三种不同版本，如图1所示。它们均包含一个黑色塑料支撑结构、外侧的气密性环烯烃共聚物（COC）膜以及内侧带微孔结构的聚酰亚胺膜。类型1（图1A）具有固定的外层塑料环，而类型2和类型3（图1B、1C）的外环可在指定的断裂点处机械折断，以便用于自动化样品转移系统（见图1B中的红色箭头）。样品架的设计允许在黄色聚酰亚胺膜上设置多个结晶液滴。由于材料对可见光高度透明，不会影响对结晶实验的观察。21 μm厚的聚酰亚胺膜还具有5 μm的孔隙，便于后续通过浸泡方式进行晶体操作。由于在大分子晶体学中常用的各类衍射数据收集能量下，X射线透过率接近1.0，因此该膜在衍射实验中的背景散射贡献可忽略不计28。</li>
</ol>
2. 设置结晶液滴
<ol>
	<li>使用湿润的无绒布创建一个清洁无尘的表面。从包装盒中取出一个样品架，将其黄色箔面朝上轻轻放置在已清洁的表面上，以避免背面COC箔膜受损或意外穿孔。</li>
	<li>在黄色箔面上设置结晶液滴，推荐最大体积为2 µL，操作方式与常规盖玻片相同。使用移液器轻柔地加样，避免刺破或撕裂箔膜。在1型样品架（图2A）上最多可放置三个液滴，而在2型和3型样品架上，推荐最多放置两个液滴（图2C）。</li>
	<li>将样品架翻转，放置于已预先涂油的24孔Linbro型板的孔腔上。利用样品架上的定位辅助结构（见图1A中的红色箭头）将其引导至最佳位置。</li>
	<li>确保样品架位置正确，以避免不必要的蒸发（图2A）。</li>
</ol>
3. 观察晶体生长
<ol>
	<li>将结晶板置于透射光显微镜下（可使用或不使用偏振片），在不干扰实验的情况下监测晶体生长（图4）。</li>
	<li>当使用专为SBS标准板设计的3型18毫米较小样品架（图1C）时，可利用能够处理SBS标准板的成像机器人，以更自动化的方式监测晶体生长。</li>
</ol>
4. 晶体操作
注意：建议在透射光显微镜下进行所有后续步骤。
<ol>
	<li>冷冻保护
	<ol>
		<li>使用细针头轻轻刺穿COC外层箔膜，确保内层黄色箔膜不受触碰。穿刺位置应紧邻待操作的液滴（图3A，3C）。</li>
		<li>使用细纸芯，将其插入穿刺孔中，小心向前推进，直至接触黄色聚酰亚胺箔膜。保持纸芯与穿孔箔膜接触，纸芯将吸除所有多余溶液。完全去除液体所需时间取决于溶液黏度及母液组成（图3B）。</li>
		<li>待所有液体被吸除后，轻柔抽出纸芯。请记住液滴位置，因为在母液去除后液滴可能不可见。</li>
		<li>使用标准移液器，通过同一穿刺孔，借助挤出式吸头（例如加样枪头）加入少量冷冻保护剂溶液，最大体积为3 µL。液体释放后，立即抽出吸头。黄色箔膜具有孔隙性，允许溶液透过箔膜扩散。晶体获得充分冷冻保护所需时间高度依赖所用溶液及其组分。</li>
		<li>为重新密封具有自愈性能的COC箔膜，用受保护的手指轻压穿刺孔约1秒，并沿穿刺处滑动。轻微压力结合较高温度有助于封闭穿刺孔，前提是穿刺孔不过大。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配体浸泡 
	 
	注意：在进行配体浸泡前，可先去除多余的母液。若需如此操作，请参照步骤4.1.1至4.1.3进行。
	<ol>
		<li>在反应管中，将配体以所需浓度溶解于母液中。</li>
		<li>将溶液在12,000 × g 条件下离心10分钟，以去除不溶性颗粒。如需要，使用温控离心机。</li>
		<li>使用长型挤出式移液枪头，将最大体积为3 µL的含配体溶液加入COC箔膜与聚酰亚胺膜之间的间隙中，随后抽出枪头。</li>
		<li>为重新密封具有自愈性能的COC箔膜，用受保护的手指轻压穿刺孔约1秒，并沿穿刺处滑动（参见步骤4.1.5）。</li>
		<li>将实验样品孵育一段时间，以允许配体通过膜扩散。浸泡时间高度依赖扩散溶液的黏度及其组分29。</li>
		<li>重复步骤4.2.1至4.2.5多次，以依次浸泡不同配体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 常温下原位衍射数据收集
注意：为了最大限度减少溶剂散射，在数据采集前应去除多余的溶液。
<ol>
	<li>确保在已建立条件的稳定湿度控制的光束线环境中进行操作30。</li>
	<li>使用镊子在指定位置轻轻抬起透明的环烯烃共聚物（COC）箔膜，并像打开酸奶杯盖一样将其剥离（图6B）。</li>
	<li>轻轻将样品托从其腔体中取出，并立即插入预先准备好的磁性样品托底座中。此步骤无需使用胶水（图6B）。</li>
	<li>施加轻微压力，以确保样品托在底座中正确就位。</li>
	<li>将样品托安装到光束线测角仪上，并确保其位置正确。根据测角仪的几何结构，样品托可旋转至多160°，而在衍射实验过程中不会产生任何阴影。</li>
	<li>使用滤纸灯芯轻轻从背面接触黄色聚酰亚胺箔膜，以去除多余的母液。请注意，此阶段也可进行配体浸泡或冷冻保护处理。样品现在已准备好进行中心定位和衍射数据采集。</li>
	<li>当使用带有可拆卸外环的样品托时，握住外环并施加轻微压力，在指定的断裂点处将其折断（图6C）。样品现在已准备好进行中心定位和衍射数据采集。</li>
</ol>
6. 低温条件下原位衍射数据采集
注意：建议在进行后续步骤前，先执行步骤 4.1.1 至 4.1.3，以去除样品中残留的母液，从而最大限度地减少溶剂散射。大多数样品可在无需预先冷冻保护的情况下直接转移至液氮中31。若需要冷冻保护，请参见步骤 4.1.1 至 4.1.5。
<ol>
	<li>使用镊子在指定位置轻轻抬起 COC 箔片，并将其剥离（参见步骤 5.1.2）（图 6A）。</li>
	<li>将样品托从腔体中取出，并安装到磁性样品托底座上。可施加轻微压力，以确保正确且紧密贴合（参见步骤 5.1.5，图 6B）。 
	注意：对称分布的指定断裂点可通过施加轻微压力，便于轻松移除样品托外环（参见步骤 5.1.8，图 6C）。此时样品托已准备就绪，可浸入液氮中。样品托类型 2 和 3（图 1B、1C）的几何结构允许其转移至标准 SPINE 样品瓶中，可用于机器人辅助的样品装载（图 6D）。</li>
</ol>

<ol><li>Berman, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Protein Data Bank.</a> Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).</li>
<li>Mac Sweeney, A., D'Arcy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+mounting+protein+crystals+at+room+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for mounting protein crystals at room temperature.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (1), 165-166 (2003).</li>
<li>Kalinin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+sample+mounting+technique+for+room-temperature+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A new sample mounting technique for room-temperature macromolecular crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 38 (2), 333-339 (2005).</li>
<li>Basavappa, R., Petri, E. T., Tolbert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+gentle+method+for+mounting+crystals+in+capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A quick and gentle method for mounting crystals in capillaries.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1297-1298 (2003).</li>
<li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+cryocrystallography-methods+for+cooling+and+mounting+protein+crystals+at+cryogenic+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Macromolecular cryocrystallography-methods for cooling and mounting protein crystals at cryogenic temperatures.</a> Methods. 34 (3), 415-423 (2004).</li>
<li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li>
<li>Gavira, J. A., Toh, D., Lopéz-Jaramillo, J., García-Ruiz, J. M., Ng, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ab+initio+crystallographic+structure+determination+of+insulin+from+protein+to+electron+density+without+crystal+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Ab initio crystallographic structure determination of insulin from protein to electron density without crystal handling.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 58 (7), 1147-1154 (2002).</li>
<li>Martínez-Rodríguez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+crystallographic+studies+of+an+active-site+mutant+hydantoin+racemase+from+Sinorhizobium+meliloti+CECT4114%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary crystallographic studies of an active-site mutant hydantoin racemase from Sinorhizobium meliloti CECT4114.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 64 (Pt 1), 50-53 (2007).</li>
<li>Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryocrystallography+of+biological+macromolecules%3A+a+generally+applicable+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+B%3A+Structural+Science%22%5BJournal%5D)">Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method.</a> Acta Crystallographica Section B: Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).</li>
<li>Teng, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+free-standing+thin+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).</li>
<li>Thorne, R. E., Stum, Z., Kmetko, J., O'Neill, K., Gillilan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+mounts+for+high-throughput+macromolecular+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Microfabricated mounts for high-throughput macromolecular cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 36 (6), 1455-1460 (2003).</li>
<li>Jian-Xun, Q., Fan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+loopless+mounting+method+for+cryocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Physics+B%22%5BJournal%5D)">An improved loopless mounting method for cryocrystallography.</a> Chinese Physics B. 19 (1), 010601(2010).</li>
<li>Kitatani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Technique+of+Manipulating+a+Protein+Crystal+Using+Adhesive+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Express%22%5BJournal%5D)">New Technique of Manipulating a Protein Crystal Using Adhesive Material.</a> Applied Physics Express. 1 (3), 037002(2008).</li>
<li>Mazzorana, M., Sanchez-Weatherby, J., Sandy, J., Lobley, C. M. C., Sorensen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+adhesive+sample+holders+for+advanced+crystallographic+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">An evaluation of adhesive sample holders for advanced crystallographic experiments.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (Pt 9), 2390-2400 (2014).</li>
<li>Wierman, J. L., Alden, J. S., Kim, C. U., McEuen, P. L., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+as+a+protein+crystal+mounting+material+to+reduce+background+scatter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Graphene as a protein crystal mounting material to reduce background scatter.</a> Journal of Applied Crystallography. 46 (5), 1501-1507 (2013).</li>
<li>Parkin, S., Hope, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+Cryocrystallography%3A+Cooling%2C+Mounting%2C+Storage+and+Transportation+of+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Macromolecular Cryocrystallography: Cooling, Mounting, Storage and Transportation of Crystals.</a> Journal of Applied Crystallography. 31 (6), 945-953 (1998).</li>
<li>Papp, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+compact+and+precise+sample+holder+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Scientific Reports. 5, 10451(2015).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+crystallography+using+a+micro-patterned+silicon+chip+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular crystallography using a micro-patterned silicon chip with minimal background scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 968-975 (2016).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (3), 321-323 (2012).</li>
<li>Mueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixed+target+matrix+for+femtosecond+time-resolved+and+in+situ+serial+micro-crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Structural+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Fixed target matrix for femtosecond time-resolved and in situ serial micro-crystallography.</a> Structural Dynamics. 2 (5), 054302(2015).</li>
<li>Feld, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Z+polymer+sample+supports+for+fixed-target+serial+femtosecond+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Low-Z polymer sample supports for fixed-target serial femtosecond X-ray crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1072-1079 (2015).</li>
<li>le Maire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-plate+protein+crystallization%2C+in+situ+ligand+soaking+and+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">In-plate protein crystallization, in situ ligand soaking and X-ray diffraction.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (9), 747-755 (2011).</li>
<li>Soliman, A. S. M., Warkentin, M., Apker, B., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+high-performance+X-ray+transparent+crystallization+plates+for+in+situ+protein+crystal+screening+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Development of high-performance X-ray transparent crystallization plates for in situ protein crystal screening and analysis.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (7), 646-656 (2011).</li>
<li>Aller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+diffraction+in+high-throughput+structure+determination+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Application of in situ diffraction in high-throughput structure determination platforms.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1261, 233-253 (2015).</li>
<li>Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrystalDirect%3A+a+new+method+for+automated+crystal+harvesting+based+on+laser-induced+photoablation+of+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68 (Pt 10), 1393-1399 (2012).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+harvesting+and+processing+of+protein+crystals+through+laser+photoablation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).</li>
<li>Antimonov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-area+Kapton+x-ray+windows%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+X-Ray%2FEUV+Optics+and+Components+X%22%5BJournal%5D)">Large-area Kapton x-ray windows.</a> Advances in X-Ray/EUV Optics and Components X. 9588, 95880F(2015).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+dyes+into+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F%3A+Structural+Biology+Communications%22%5BJournal%5D)">Penetration of dyes into protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications. 75 (2), 132-140 (2019).</li>
<li>Bowler, M. G., Bowler, D. R., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raoult%27s+law+revisited%3A+accurately+predicting+equilibrium+relative+humidity+points+for+humidity+control+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Raoult's law revisited: accurately predicting equilibrium relative humidity points for humidity control experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (2), 631-638 (2017).</li>
<li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+cryocooling+of+naked+crystals%3A+are+cryoprotection+agents+always+necessary%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary?</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (10), 902-906 (2011).</li>
<li>Mueller, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macromolecular+crystallography+beamlines+at+BESSY+II+of+the+Helmholtz-Zentrum+Berlin%3A+Current+status+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Physical+Journal+Plus%22%5BJournal%5D)">The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives.</a> The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141(2015).</li>
<li>Bowler, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+and+Experience+of+Controlled+Crystal+Dehydration%3A+Results+from+the+European+Synchrotron+HC1+Collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22Crystal+Growth+%26+Design%22%5BJournal%5D)">Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration.</a> Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).</li>
<li>Yano, O., Yamaoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+properties+of+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Cryogenic properties of polymers.</a> Progress in Polymer Science. 20 (4), 585-613 (1995).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 71 (Pt 11), 2328-2343 (2015).</li>
</ol>

关于所报道的样品支架，柏林亥姆霍兹中心已向德国专利商标局提交专利申请，登记号及登记日期如下：DE 10 2018 129 125.6，登记日期2018年11月20日th，2018；DE 10 2018 125 129.7，注册日期10月11日th，2018年；DE 10 2017 129 761.8，注册日期12月13日th，2017年。随后基于DE 10 2017 129 761.8的优先权，通过PCT途径提交了国际专利申请PCT/DE2018/101007。2018年12月6日提交了实用新型注册申请，编号为DE 20 2018 106 955.1th，2018年。该样品载具已由德国耶拿的Jena Bioscience公司以商品名XtalTool和XtalTool/HT commercially available。

适用于结晶实验。 新型样品架可用于标准悬滴结晶实验，适用于24孔Linbro型板（类型1和2），或每孔直径为18 mm的24孔SBS标准尺寸板（类型3）。它们可替代标准显微镜盖玻片使用。非晶态环烯烃共聚物（COC）箔可确保系统的气密性。由于采用了高透明度的箔材，可通过透射光显微镜对结晶过程进行监测。据我们所知，目前尚无其他适用于24孔结晶板的样品架能够在不将晶体从生长液滴中机械移出的前提下，实现晶体操作或衍射实验。这一点尤为重要，因为该领域内许多研究人员仍依赖此类板进行晶体优化，原因在于与96孔坐滴板相比，此类板可使用更大的液滴体积，从而可能获得更大的晶体。
适用于晶体操作。由于外层环烯烃共聚物（COC）箔具有自愈特性，内层黄色聚酰亚胺箔具有微孔结构，晶体所处环境可被接触，且无需将晶体机械转移至其他容器即可对其进行操作。这使得样品支架使用极为便捷。据我们所知，目前唯一另一种允许以间接且温和方式接触晶体的系统是 CrystalDirect 系统26。然而，CrystalDirect 系统灵活性较低，因其必须使用特殊的 96 孔结晶板。在该系统中，晶体生长所依附的箔片同时也是密封结晶实验的盖片，且不具备自愈能力。这意味着，若通过激光烧蚀在箔片上打孔以向晶体输送配体或冷冻保护剂，该孔洞将保持开放状态，从而增加液体蒸发的风险。这&#160;与我们的设计形成对比：&#160;即使 COC 箔被多次穿刺，晶体也不会直接暴露于外界环境之中。
适用于室温下的原位衍射实验。 可以简单地将样品架从结晶板中取出，粘附到磁性底座上，并置于光束线测角仪上。进行室温衍射实验时，建议将样品置于湿度可控的气流环境中33。在将样品架放置到测角仪之前，可去除晶体周围的母液，以减少背景散射。该装置可保持数小时的稳定性。
所用材料在100 K下用于操作和存储的适用性。用于制造样品台的材料以及聚酰亚胺薄膜在冷却至低温时均不会受到不利影响34。因此，在低温（例如100 K）下使用该样品台不会带来严重问题。
适用于100 K下的原位衍射实验。在氮气流中于100 K下收集数据时，需将样品架从结晶板中取出（如前一段所述），粘附到磁性底座上，并置于光束线测角仪上100 K的气态氮气流中。如有需要，样品也可进行冷冻保护，尽管对于裸露样品而言，大多数情况下可能并不必要31。在100 K条件下进行实验时，2型和3型样品架更为合适，因为其外部塑料环可以移除，因而整体尺寸更小，因此更不易结霜。然而，1型样品架也可使用。只要实验舱内的湿度不过高，且冷冻系统对准良好，样品架结霜实际上并不成问题。
局限性。 样品支架的几何结构允许通过旋转法在总计160°的旋转范围内无障碍地收集衍射数据。这一范围足以获得大多数晶系的完整衍射数据集。在无法实现完整数据收集的情况下，需要合并来自多个晶体的数据。当晶体共同生长时，可能可以通过调节入射X射线束的尺寸，使仅单个晶体的局部区域被照射。在极端情况下，可能需要采用类似于MeshAndCollect方法的数据收集策略35。总之，尽管样品支架存在一定的局限性，但在大多数情况下这些局限均可克服。当然，也有可能遇到所有上述方法均不可行的情况；在此类情形下，可能需要采用其他晶体 mounting 方法。
我们介绍了一种用于大分子晶体学的新型样品 holder，并展示了这种样品 holder 在多种应用中的适用性。考虑到蛋白质晶体操作的简便性和可重复性，以及样品 holder 所具备的独特性质，我们相信这些样品 holder 将成为大分子晶体学样品 holder 工具库中一种有价值的补充。

生物大分子三维结构的知识构成了所有基础生物学、生物化学和生物医学研究的重要基石，甚至延伸至此类研究的某些转化应用方面，例如药物发现。在所有能够以原子分辨率获取此类三维信息的方法中，X射线晶体学是最强大且最突出的方法，这一点由以下事实得以证明：90%的现有结构信息均由X射线晶体学提供1。X射线晶体学的主要前提条件——同时也是其主要局限性——是必须制备出可用于衍射实验的高质量衍射晶体。这一环节至今仍是该方法的主要瓶颈之一。
历史上，蛋白质晶体的衍射数据是在室温下收集的。在收集数据之前，需将单个晶体小心地转移至玻璃或石英毛细管中，并向毛细管内加入母液，以防止晶体干燥，随后将毛细管密封2,3,4。自20世纪80年代以来，由于X射线具有电离特性，且大分子晶体对辐射极为敏感，室温下进行数据收集在该方法上存在严重限制，这一点变得越来越明显。因此，人们发展出通过将大分子晶体冷却至100 K并在如此低温下收集衍射数据的方法，以减轻辐射损伤的影响5,6。由于在低温条件下使用毛细管安装样品时热传导速率较低，变得不切实际。尽管如此，目前仍有研究致力于将毛细管（特别是来自逆扩散结晶实验的毛细管）用于低温衍射实验7,8；但无论怎样，如今在大分子晶体学中，标准做法是将大分子晶体连同其周围一层薄薄的母液一起，用一根细金属丝环固定住进行安装9,10。尽管多年来已对该环状安装法进行了若干改进（例如引入光刻技术制作的环及其他类似结构11），但其基本原理自20世纪90年代初确立以来至今仍在沿用。可以有把握地说，目前绝大多数大分子晶体的衍射数据收集仍然依赖于这一方法5。
随着时间的推移，基于环的晶体 mounting 方法出现了一些有趣的新进展和改进，但这些方法迄今为止尚未在学术界得到广泛应用。其中一种是所谓的无环晶体 mounting 技术，该技术旨在降低背景散射12,13,14。另一种方法是使用石墨烯包覆层包裹晶体样品，以防止其干燥。在这方面，石墨烯是一种非常合适的材料，因其X射线散射背景极低15。
最近，样品载具领域的发展主要集中在标准化载具上，旨在提高样品通量16，或设计可承载多个样品的载具17，例如硅框架上的图案化膜，这类载具能够在序列晶体学领域承载数百个微小晶体18,19,20,21,22。
迄今为止讨论的所有样品安装方法仍需要一定程度的手动干预，这意味着存在对样品造成机械损伤的固有风险。因此，研究人员正在探索新的方法，通过设计样品环境，使晶体在其生长环境中即可收集衍射数据。其中一种方法称为原位法或微孔板筛析法23,24，目前全球多个同步辐射光源的蛋白质晶体学光束线上已实施该技术25。然而，该方法的应用受到晶体板几何参数以及仪器样品位置周围可用空间的限制。
另一种方法体现在所谓的CrystalDirect系统26中。该系统可自动收获整个结晶液滴。用于生长晶体的箔片通过激光进行定制切割，并直接用作样品托27。
本文所述工作的目标是开发一种样品架，使用户能够在不接触晶体样品的情况下，将其从生长室转移至数据采集装置，同时便于对样品进行操作。由于大分子晶体学领域的许多研究人员仍在使用24孔结晶板格式，通过优化大规模初筛实验中确定的条件来促进晶体生长，因此新型样品架的设计兼容这一格式。下文将详细介绍该新型样品架的设计，并展示其在原位数据采集和配体浸泡实验中的操作方法与性能表现。最后，将讨论该样品架在各类实验步骤中的适用性及其局限性。

<table><tbody><tr><td>AF Satetiss</td><td>RS Components</td><td>101-5738</td><td>无绒纸，多家零售商</td></tr><tr><td>导管</td><td>Dispomed Neoject</td><td>25 G 5/8&quot; 0.5 x 16，货号：10026</td><td>多家零售商</td></tr><tr><td>COC 箔</td><td>HJ-Bioanalytik GmbH</td><td>900360</td><td></td></tr><tr><td>ComboPlate</td><td>Greiner Bio-one / Jena Bioscience</td><td>662050 / CPL-131</td><td>预涂油板，多家零售商</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Jena Bioscience</td><td>CV-100</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td>0.1 - 2.5 &amp;micro;L 体积</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>30125150</td><td>1.5 mL g-Safe Eppendorf Quality，制造商货号</td></tr><tr><td>福赛斯·乌斯贝克</td><td>FisherScientific</td><td>10750313</td><td></td></tr><tr><td>GELoader Eppendorf 质量检测</td><td>Eppendorf</td><td>30001222</td><td>挤出的&amp;nbsp; 提示（0.2 - 20 &amp;micro;升），制造商货号</td></tr><tr><td>磁性冻存管</td><td>分子尺度</td><td>MD7-402</td><td></td></tr><tr><td>Thermo 微型离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R21</td><td></td></tr><tr><td>纸芯</td><td>dental2000</td><td>64460</td><td>多零售商纸芯套装</td></tr><tr><td>Rotiprotect Nitril-eco&amp;nbsp;</td><td>卡尔·罗斯</td><td>TC14.1</td><td>无粉，多家零售商</td></tr><tr><td>SuperClear 板</td><td>Jena Bioscience</td><td>CPL-132</td><td>预涂油的培养皿</td></tr><tr><td>UHU 超级胶水</td><td>UHU 有限公司 &amp;amp; Co KG</td><td>45545</td><td>制造商货号，多家零售商</td></tr><tr><td>VeroBlackPlus</td><td>Alphacam</td><td>OBJ-40963</td><td>制造商货号</td></tr><tr><td>XtalTool&amp;nbsp;</td><td>Jena Bioscience</td><td>X-XT-101</td><td>样品架套装</td></tr><tr><td>XtalTool HT</td><td>Jena Bioscience</td><td>X-XT-103 / X-XT-104</td><td>SPINE 兼容样品架套装</td></tr><tr><td>XtalToolBases</td><td>Jena Bioscience</td><td>X-XT-105</td><td>磁性样品架底座套装</td></tr></tbody></table>

一种用于大分子x射线晶体学且背景散射极低的多功能样品支架

An All-in-one Sample Holder for Macromolecular X-ray Crystallography with Minimal Background Scattering

大分子X射线晶体学（MX）是获取生物大分子高分辨率三维结构信息的最主要方法。该方法的前提是需要从待研究的大分子中生长出高度有序的晶体样品，然后将其制备用于衍射实验。这一制备过程通常包括将晶体从其生长溶液中取出，浸泡于配体溶液或冷冻保护剂溶液中，随后将晶体固定在适合实验的样品支架上。该过程中一个严重的问题是，大分子晶体通常机械稳定性差，较为脆弱。因此，这类脆弱晶体的操作很容易成为结构解析过程中的瓶颈。任何施加于此类精细晶体的机械力都可能破坏分子的规则排列，导致晶体衍射能力下降。本文介绍一种新型的一体化样品支架，该支架的开发旨在最小化晶体操作步骤，从而提高结构解析实验的成功率。该样品支架可通过替代常规使用的显微镜盖玻片来支持晶体液滴的设置。此外，它允许在不打开结晶腔室且无需直接操作晶体的情况下，原位进行晶体处理操作，如配体浸泡、冷冻保护和复合物形成。最后，该样品支架的设计支持在常温和低温条件下直接采集原位X射线衍射数据。使用该样品支架后，晶体从结晶到衍射数据采集过程中的损伤风险显著降低，因为不再需要对晶体进行直接操作。

样品架类型1的设计可适配24孔Linbro板中的一个孔。每个单独的样品架在外圈两侧均设有定位辅助结构，以确保其在孔边缘上的最佳定位（图1A，图2A）。最多可在黄色聚酰亚胺膜上放置三个结晶液滴，每个液滴最大体积为2 µL（图2B）。对于类型2和类型3的样品架，建议最多放置两个液滴，每个液滴最大体积为2 µL。一个24孔Linbro板可容纳24个样品架（图3D）。
使用24孔Linbro板和1型样品架进行了一次结晶实验。在样品架的黄色聚酰亚胺膜上，将1 µL的鸡蛋清溶菌酶溶液（15 mg/mL）与1 µL母液混合，母液成分为50 mM NaAc pH 4.7、500 mM NaCl和25%（w/v）PEG-6000（表1）。液滴在293 K条件下与500 µL母液平衡，5小时后观察到尺寸为40–50 µm的晶体（图4）。可通过透射光显微镜（图4）在有或无偏振器的情况下观察晶体生长过程。高透明度薄膜可确保在使用常规光学显微镜或自动晶体成像系统时，对晶体生长状况进行最佳观察和监测。尚未测试使用紫外光进行晶体生长观察的效果。
去除晶体周围的母液后，将含有鸡蛋清溶菌酶晶体的样品架从结晶板中取出，并置于HZB-MX 14.3号光束线的湿度控制气流中32。在室温下，使用150 μm光束、13.8 keV能量、4 × 1010 光子/秒通量，以每幅图像5秒的曝光时间，按1°步长采集衍射数据。典型的衍射图像如图5所示。衍射图像上未检测到升高的背景散射信号。更多实验细节及相关数据处理统计信息列于表2中。
<img alt="动态流体模拟装置示意图；用于流动分析与优化的旋转圆盘设计。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：新型样品支架的示意图。样品支架由黑色塑料支撑体构成，其外侧覆盖一层非晶态环烯烃共聚物（COC）薄膜。该薄膜（以蓝色表示）具有高透明性、自愈合特性，并能确保实验的气密性。内层薄膜（以黄色表示）由生物惰性聚酰亚胺制成，对X射线高度透明。结晶液滴可置于该薄膜上。样品支架的外缘设有两个定位辅助结构，由红色箭头指示（图A），可用于将样品支架精确地放置在已预先涂油的结晶板腔体上。（A）1型样品支架，直径22 mm，带有固定式外部支撑环。（B）2型样品支架，直径22 mm，带有可拆卸外部支撑环。（C）3型样品支架，直径18 mm，带有可拆卸外部支撑环。后两种设计旨在与基于SPINE标准的自动化样品装载机器人配合使用，实现高通量操作。图B中红色箭头标示了预设的断裂点。图C中黑色箭头指示的是定位标记。黄色薄膜外周突出的定位销钉用于在生产过程中对齐聚酰亚胺薄膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于流体操控实验的微流控芯片装置，展示液体处理过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2： 样品支架可像常用的显微镜盖玻片一样，用于24孔Linbro板。 它可使腔体密封且不漏气。定位辅助结构可确保样品支架在腔体上的正确位置（图A中的红色箭头）。最多可在1型样品支架上放置三个独立液滴（图B），而在2型或3型样品支架上建议最多放置两个液滴。每个液滴推荐的最大体积为2 µL。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="采用注射器注入法制造微流控装置；液体分布；实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：24个I型样品架可适配于一个24孔板。 样品架可在24孔板上以两种方向放置，如图所示（图D）。使用套管刺穿背面的环烯烃共聚物（COC）箔膜，通过将纸芯轻轻插入同一孔中，以去除结晶液滴中的过量溶液（图A和C）（图B）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，结晶；溶液中的小晶体；比例尺标记为200微米。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4： 通过配备偏振器的透射显微镜观察到的鸡卵清溶菌酶晶体图像。 单个晶体可与沉淀的蛋白质溶液清晰区分。本图像中晶体的平均尺寸为40 µm × 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="X射线晶体学衍射图谱，展示原子结构分析与电子密度图谱绘制" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5：在样品支架上生长的溶菌酶晶体的典型X射线衍射图像。 在暴露于X射线之前，需将晶体周围多余的母液全部去除。衍射数据在BESSY II电子储存环的BL14.3线站上，于室温条件下收集。32 使用湿度可控的样品环境，相对湿度为97.5%。样品支架未引起明显的背景升高。图像中的虚线表示分辨率环。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="微流控芯片制备过程示意图，展示实验室装置中的组装步骤和组件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59722/59722fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6： 准备样品支架以进行衍射数据采集。 首先使用镊子轻轻提起环烯烃共聚物（COC）薄膜并将其剥离（图A）。随后，将样品支架从腔体中取出，并插入磁性底座的中心孔中，直至达到标记位置（图B）。握住中心部分，对外圈施加轻柔压力，利用对称分布的预定断裂点使中心部分分离（图C）。移除后，可将样品支架浸入液氮中，并转移至标准SPINE样品管中。例如，将其放置于样品托（puck）中后，可运送至同步辐射设施，自动样品装载机器人会将其识别为常规样品（图D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59722/59722fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>结晶详细信息</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>方法</td>
			<td>悬滴法，蒸气扩散法</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>板类型</td>
			<td>SuperClear Plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度 (K)</td>
			<td>293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋白质浓度 (mg mL-1)</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储液组成</td>
			<td>50 mM NaAc pH 4.7, 500 mM NaCl, 25 % (w/v) PEG-6000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>液滴体积与比例</td>
			<td>2 µL 总体积，1:1 比例（蛋白质 : 母液）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>储液体积</td>
			<td>500 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>孵育时间</td>
			<td>12 小时</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：所描述的结晶实验的实验细节。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>数据收集与处理</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>波长 (Å)</td>
			<td>0.89429</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>温度 (K)</td>
			<td>293</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>探测器</td>
			<td>Rayonix MX225 CCD </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶体-探测器距离 (mm)</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每张图像的旋转范围 (°)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总旋转范围 (°)</td>
			<td>120</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>每张图像的曝光时间 (s)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空间群 </td>
			<td>P43212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶胞参数 (Å)</td>
			<td>a = 79.01, b = 79.01, c = 37.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> mosaicity (°)</td>
			<td>0.07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分辨率范围 (Å)</td>
			<td>39.50 - 1.35 (1.37 - 1.35)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总衍射点数</td>
			<td>191940 (8932)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>唯一衍射点数</td>
			<td>27020 (1292)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>数据完备性 (%)</td>
			<td>99.88 (99.20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多重性</td>
			<td>7.1 (6.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>平均 I/σ(I)</td>
			<td>15.0 (1.9)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rmeas35 (%)</td>
			<td>6.3 (107.0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpim36 (%)</td>
			<td>2.4 (40.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC1/237 </td>
			<td>99.9 (68.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISa38</td>
			<td> 16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilson B因子 (Å2)</td>
			<td>17.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：衍射数据收集与处理统计信息。

介绍了一种用于大分子X射线晶体学的新型样品架及其相应的操作方案。该系统可在无需任何晶体操作或装 mounted 的情况下，实现晶体生长、晶体浸泡以及在常温和低温条件下的原位衍射数据收集。

一种用于大分子X射线晶体学且背景散射极低的多功能样品支架

大分子X射线晶体学（MX）是获取生物大分子高分辨率三维结构信息的最主要方法。

这种样品支架可用于晶体生长和收集X射线衍射数据。该样品支架专为在MX领域广泛使用的24孔板上使用而设计。非常重要的一点是，无需进行任何操作步骤。具备此处所述这些特点的样品台此前并不存在。亲眼看到某个事物总是比仅仅阅读相关描述要好得多。通过观看视频，潜在用户可以立即理解这种新型样品台的特点与复杂细节。首先，使用一块湿润的无绒布创建一个洁净无尘的表面。从盒子中取出一个样品架，将其黄色箔面朝上，轻轻放置在清洁的表面上，以避免背面的环烯烃共聚物（COC）箔膜受到损坏或意外穿孔。在黄色箔膜上设置结晶液滴，操作方式与常用盖玻片上的操作相同。使用移液器轻轻滴加液滴，避免刺破或穿透铝箔。在2型和3型样品架上，建议最多滴加两滴；在1型样品架上，最多可滴加三滴。将样品架翻转，放置在已预先涂油的24孔Linbro型培养板的一个孔腔中。利用样品架上的定位辅助结构，将其引导至最佳位置。确保样品架位置正确，以避免不必要的蒸发。将结晶板置于透射光显微镜下，无论是否使用偏振器，均应无干扰地监测晶体生长过程。在透射光显微镜下进行冷冻保护操作。使用细针头轻轻刺穿外层 COC 薄膜。确保内层黄色箔纸保持 untouched。穿刺位置应紧邻待操作的液滴。将一根细纸灯芯插入刺出的孔中。小心地将灯芯向前推进，直至其接触到黄色的聚酰亚胺箔。保持灯芯与带孔箔片接触。灯芯将吸走所有多余的溶液。完全去除液体所需的时间取决于溶液的黏度以及母液的成分。待所有液体被抽吸干净后，轻轻收回纸芯。请记住液滴的位置，因为在移除母液后该液滴可能不再可见。使用标准移液器通过同一孔洞，借助挤出式吸头加入少量冷冻保护液。为重新封闭自愈合的环烯烃共聚物（COC）膜，用受保护的手指轻轻按压孔洞约一秒钟，然后在穿刺处滑动。轻微压力结合升高的温度有助于封闭不太大的穿刺孔。 将配体溶解于反应管中的母液，配制成所需浓度。以12,000 ×g离心10分钟，以去除不溶性颗粒。如有需要，使用温度可控的离心机。使用长型挤出式移液枪头，将最多三微升含配体溶液轻轻加入环烯烃共聚物（COC）箔膜与聚酰亚胺薄膜之间的缝隙中；随后撤出枪头。为重新密封具有自愈性能的COC箔膜，用受保护的手指轻压穿孔处约一秒钟，然后沿穿刺路径滑动手指。将实验样品孵育一段时间，以允许物质在膜间充分扩散。浸润时间很大程度上取决于扩散溶液及其组分的黏度。可重复进行配体浸润步骤，以依次浸润不同的配体。为减少溶剂散射，在数据收集前应去除多余的溶液。确保光束线环境稳定且湿度受控，并处于预先设定的条件。若需在室温下进行原位衍射数据采集，使用镊子在指定位置轻轻抬起透明的环烯烃共聚物（COC）箔膜并将其剥离。随后轻轻取出样品支架，并立即将其插入预先准备好的磁性样品支架底座中。此步骤无需使用胶水。轻轻按压，以确保样品架在底座内正确就位。对于带有可拆卸外环的样品架，握住外环并施加轻微压力，在指定的断裂点处将其折下。样品现已准备好进行中心定位和衍射数据收集。将样品架安装到光束线测角仪上，并确保样品架位置正确。根据测角仪的几何结构，样品架可旋转至多160度，而在衍射实验过程中不会产生任何阴影。使用纸捻轻轻接触黄色聚酰亚胺膜的背面，以去除多余的母液。样品现在已准备好进行中心定位和衍射数据收集。按照室温下的操作准备进行原位低温衍射数据收集，然后将样品浸入液氮中，并转移至与SPINE兼容的小瓶中。样品架类型2和3的几何结构允许其转移至标准SPINE样品瓶中，可用于机器人辅助的样品装载。样品架类型1和类型2设计为可适配24孔Linbro风格板中的一个孔。每个单独的样品架在外缘两侧均设有定位辅助结构，以确保在孔边缘上的最佳定位。使用24孔Linbro型板和1型样品架，将液滴在293开尔文温度下与500微升母液平衡。在透射光学显微镜下（无论是否使用偏振器），五小时后观察到40至50微米的晶体。将含有鸡蛋清溶菌酶晶体的样品架置于HZB-MX 14.3号光束线的湿度控制气流中。此处显示了一张典型的衍射图像。在衍射图像上无法检测到升高的背景散射。必须避免聚酰亚胺箔的污染。此外，准确放置样品架并小心操作晶体至关重要。样品架可用于处理极为脆弱的晶体，这是微小分子晶体学中最关键的步骤之一。使用样品架可显著降低样品被破坏的可能性。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

用于大分子 X 射线晶体学的一体式样品支架,具有最小的背景散射

介绍了一种利用蛋白质微晶进行X射线晶体学的实验方案。两个分析实例 体内纯化后生长的微晶 在细胞内...

蛋白质晶体的微晶衍射分析 活细胞内 衍射

本文介绍了一种简化方案，用于对来自肺炎链球菌（Streptococcus...

SP0092 碳水化合物转运底物结合蛋白的生化与结构表征

本方法描述了重组Nsa1的克隆、表达和纯化，用于通过X射线晶体学和小角X射线散射（SAXS）进行结构测定，适用于其他含有有序和无序结构域的蛋白质的混合结构分析。...

结合X射线晶体学与小角X射线散射技术对酿酒酵母（S. Cerevisiae）Nsa1蛋白非结构化区域进行建模

本方案详细描述了在室温下用于X射线衍射数据收集的微流控器件的制备与操作方法。此外，还介绍了如何通过动态光散射监测蛋白质结晶过程，以及如何处理和分析所获得的衍射数据。...

微流控芯片用于 原位 晶体X射线衍射与 原位 用于序列晶体学的动态光散射

我们描述了一种光束线装置，可用于对单晶或粉末样品进行快速的二维X射线荧光和X射线微区衍射成像，可采用劳厄法（多色辐射）或粉末法（单色辐射）进行衍射。所获得的图谱可提供有关应变、取向、相分布以及塑性变形的信息。...

同步辐射X射线微衍射与矿物及岩石样品的荧光成像

我们展示了使用MeshAndCollect方法收集多个荧光蛋白Cerulean小晶体的部分衍射数据，从而获得一套完整的衍射数据集，用于后续的结构解析。...

使用 MeshAndCollect 解析荧光蛋白 Cerulean 的结构

本文介绍了如何利用某些同步辐射光束线提供的自动化筛选和数据采集选项。科研人员将低温冷冻的样品送至同步辐射装置，随后对样品的衍射特性进行筛选，自动采集并处理数据集，在条件允许的情况下完成结构解析——整个过程无需人工干预。...

完全自主的生物大分子晶体表征与数据采集

本文详细介绍了用于芯片上透析法蛋白质结晶的微流控芯片的制备方案 原位...

通过微透析芯片法进行蛋白质结晶 原位 X射线衍射研究

数据的信噪比是进行微晶X射线衍射测量时最重要的考虑因素之一。VMXm光束线为此类实验提供了低噪声环境和微束条件。本文介绍了适用于VMXm及其他微聚焦大分子晶体学光束线的微晶样品制备、安装与冷却方法。...

用于VMXm光束线微晶样品制备的工作流程

本文介绍了一种用于在 Diamond Light Source 的 I23 光束线上进行长波长大分子 X...

样品制备与转移方案：在 Diamond Light Source 同步辐射光源 I23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

本文介绍了基于晶体的片段筛选的完整XChem流程，从申请使用权限开始，到后续所有步骤直至数据发布。...

在钻石光源XChem设施实现高效的片段筛选

了解用于大分子X射线晶体学的一体式样品支架，该支架可在无需操作晶体的情况下实现原位生长和数据采集，适用于常温和低温环境，显著降低背景散射并提高实验效率。

一种用于大分子X射线晶体学且背景散射极低的多功能样品支架

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