利用体外批次发酵系统分析内源性代谢物与人体肠道微生物群的相互作用

本方案可广泛用于内源性物质与人体肠道微生物群相互作用的高通量快速筛选。具有成本低、避免宿主代谢干扰的优点。该方法具有用于诊断的潜力。

首先，在磁力搅拌器上将BIF EPS和淀粉分别溶于热水中，使两者的浓度均为每升8克。在制备好的基础培养基VI中，加入100毫升BIF EPS溶液，制成培养基VI BIF溶液；加入100毫升淀粉溶液，制成培养基VI淀粉溶液。

将两种含碳源的培养基以及不含碳源的对照培养基在121摄氏度下高压灭菌15分钟。待其冷却至室温后，加入海门（haymen）和半胱氨酸。将每种培养基各5毫升转接到培养管中。

然后置于厌氧培养箱中保存。将剩余的培养基在4°C下保存。为了制备人粪便样本，将1克新鲜粪便样本转移至含有10毫升、pH为7、0.1摩尔的厌氧PBS溶液的玻璃烧杯中。

然后使用玻璃棒搅拌，制成匀浆。在厌氧环境中，将过滤后的粪便匀浆各500 µL分别加入三种已准备好的发酵培养基中。随后，在37 °C条件下进行孵育。

在24小时和48小时后，于厌氧环境中收集两毫升发酵样品。随后在厌氧环境外以6000 × g离心3分钟。小心将上清液转移至新的离心管中，用于多糖降解分析和短链脂肪酸测定。

将离心沉淀物保存在 -80 摄氏度。将 0.2 µL 发酵上清液点样于每块预先涂覆的硅胶 60 薄层色谱铝板上，并轻轻旋转以铺展。然后使用热风烘风机干燥。

将样品板的一端浸入20毫升的甲酸：正丁醇：水溶液中数分钟，直至电泳迁移接近另一端。然后用镊子取出板子，用吹风机吹干。随后将板子浸入间苯二酚试剂中染色两分钟。

再次干燥。将板转移至120摄氏度的烘箱中加热三分钟。然后拍摄板的图像，通过测量TLC条带来评估EPS的降解情况。

为了研究 EPS 对短链脂肪酸（SCFA）生成的影响，将一毫升发酵上清液加入二毫升离心管中，并向每个样品中加入 0.2 毫升 25%（重量/体积）的偏磷酸溶液。涡旋振荡以充分混匀溶液。在 13,000 ×g 条件下离心 20 分钟。

同时，在试管中配制 120 毫摩尔的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸溶液。然后将每种配制好的酸各取 1 毫升加入含有 1.2 毫升 25%（重量/体积）偏磷酸的试管中。将这些混合液作为标准混合溶液装入气相色谱仪的样品瓶中。

从离心机中取出试管，将上清液转移至新的离心管中。使用配备0.22微米滤器的注射器将上清液过滤至新管中，用于气相色谱分析。在本研究中，经厌氧培养72小时后，在PYG平板上的长双歧杆菌（bifidobacterium longum）培养物中观察到黏液状胞外多糖（EPS）的产生。

培养物刮取液经离心后，通过乙醇沉淀和干燥，收集得到类纤维素的胞外多糖（EPS）。薄层色谱（TLC）分析显示，人粪便微生物群对淀粉的降解速率快于对BIF EPS的降解。主坐标分析表明，培养物VI的BIF组与淀粉组彼此分离聚类，说明EPS与淀粉的可利用性对人粪便细菌群落结构具有差异性影响。

效应量的线性判别分析显示，与VI型淀粉培养样本相比，VI型BIF培养样本中柯林斯菌属（collinsella）、粪球菌属（coprococcus）、副杆菌属（parabacteroides）和红假单胞菌属（rhodopseudomonas）的丰度显著更高。此外，气相色谱检测结果显示，从发酵培养物中测得的短链脂肪酸（SCFA）包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和戊酸。在发酵24小时和48小时后，VI型BIF、VI型淀粉和VI型培养组之间的六种短链脂肪酸中有五种浓度相似，且无统计学差异。

然而，在发酵48小时后，培养VI BIF组中的丙酸浓度显著高于培养VI淀粉组。该实验需在厌氧条件下进行，固定后的样品应尽快转移至厌氧培养箱中。部分薄层色谱（TLC）试剂具有危害性。

使用时应谨慎。