Name: 注射格里鲁斯双形蛋 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学习格里鲁斯双形蟋蟀卵显微注射技术，用于RNA干扰和基因组操作等发育生物学研究。该方法为神经科学和发育生物学实验提供基础技术支持，可应用于胚胎发育研究。

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本项目的研究工作获得了美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所的机构发展奖（IDeA）的支持，资助号为 P20GM10342（授予 HH3），以及美国国家科学基金会资助号 IOS-1257217（授予 CGE）的支持。

1. 硬件设置与材料准备
注意：有关溶液、试剂和设备的详细信息，请参见表1和材料表。
<ol>
	<li>设置解剖显微镜，以便观察卵并引导注射针操作。（图1A 显示配备荧光功能的解剖显微镜。）具备荧光功能更佳，但非必需。</li>
	<li>安置三轴显微操作器，以精确操控注射针的位置（图1A）。</li>
	<li>配备带有管路和持针器的显微注射仪，用于注入微量物质（图1A）。可选配脚踏开关，图中未显示。</li>
	<li>设计并制作用于形成卵井的印模（图1C），通过3D打印机或激光雕刻机打印所需图案的反向结构。 
	注意： 图中所示3D打印样本印模尺寸为4.5 cm × 5 cm，带有128个3 cm × 1 cm × 1 mm的凸起结构，用于形成独立的卵井。有关制作多种可定制模具的详细方法已在其他文献中发表16。</li>
	<li>配制10倍注射缓冲液、HEPES缓冲盐水（HBS）以及四甲基罗丹明葡聚糖染料储备液，并于4 °C保存。</li>
	<li>配制待注射的实验溶液，例如dsRNA、CRISPR/Cas912、转座元件、体外加帽mRNA7,8、药理学试剂17、ZFNs或TALENs9。</li>
	<li>在载玻片上粘贴数层普通实验室胶带，并在其上贴双面胶带，构建一个高出载玻片约1 mm的平台，用于放置针具以进行评估。</li>
	<li>准备一个大小约为40 cm × 60 cm、带盖且顶部有网状通气孔的蟋蟀饲养容器，以保证空气流通。</li>
	<li>添加食物、水和遮蔽材料。</li>
	<li>放入数十只健康成年雄性和雌性蟋蟀。通过翅膀的存在来识别成年蟋蟀。 
	注意： 使用不同羽化后年龄的蟋蟀可能提高产卵量。饲养密度应相对较高，以确保能收集到足够的实验用卵，但不宜过于拥挤，以免发生同类相食现象。例如，在上述尺寸的容器中饲养约24只健康蟋蟀，雌雄比例大致相等，通常可在1至2小时内收集约200枚卵。蟋蟀可在室温下饲养，但若将其维持在温暖（23.5–26 °C）、湿润（40–60%相对湿度）的培养箱中，则其发育和行为表现更佳。</li>
</ol>
2. 制备注射用针头
<ol>
	<li>使用带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（具体尺寸详见材料表）。拉针应在注射当天或注射完成前数天内进行准备。</li>
	<li>将一根玻璃毛细管放入拉针仪中，使其在加热丝上居中，并拧紧旋钮以固定玻璃管。</li>
	<li>将拉针仪的温度设定在接近玻璃斜坡温度的范围（-5 °C 至 +10 °C）。</li>
	<li>采用单步高温程序拉制出具有小开口的长锥形拉针，但需避免末端熔融闭合。 
	注意：例如，当使用材料表中所述配备盒式加热丝的微电极拉针仪时，对于斜坡温度为478的玻璃毛细管，可采用以下参数：加热（Heat）478；拉力（Pull）45；速度（Vel）75；延迟（Del）120。用户应根据实验经验确定获得如图2B所示针头形状的最佳条件。</li>
	<li>对针尖进行斜面打磨，以备注射使用。</li>
	<li>用滴水润湿斜面研磨仪的旋转研磨面（图2A），可使用反渗透（RO）水或二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理的蒸馏水。</li>
	<li>将拉好的针插入斜面研磨仪中，并调整至20°角。</li>
	<li>缓慢下放针头直至其刚好接触研磨面，研磨2至3分钟。</li>
	<li>通过将打磨后的针头放置在粘附于玻璃载玻片上的双面胶带上，评估其斜面效果。</li>
	<li>将固定有针头的载玻片置于配备相机和图像采集软件的复合显微镜载物台上。</li>
	<li>使用20倍物镜采集针尖图像。</li>
	<li>利用成像软件测量斜面开口近端处针头内腔直径（图2C）。理想尺寸为10 µm + 2 µm。</li>
	<li>丢弃开口直径小于8 µm或大于12 µm的针头。</li>
	<li>将针头存放于带盖容器中以防灰尘污染。使用一条石蜡条或类似材料将针头垫高，使其不直接接触容器底部，以防止针尖断裂（图2D）。</li>
</ol>
3. 卵的收集与准备
<ol>
	<li>通过在收集卵前的夜间或至少8–10小时内，使蟋蟀无法接触任何湿润的产卵基质（如水瓶、产卵皿），以最大化其产卵数量。 
	注意： 由于雌性具有体内储存精子的能力，若实验上必须精确控制受精时间，则可能需要采用不同时间点的操作流程18.</li>
	<li>配制40 mL 1%的琼脂糖水溶液，倒入10 cm的培养皿中。</li>
	<li>在琼脂糖凝固之前，将其表面放置一个鸡蛋井印模。</li>
	<li>琼脂糖凝固后，取下印章，露出加样孔（图1C).</li>
	<li>用含有1%青霉素/链霉素的HBS填充琼脂糖凝胶孔板。</li>
	<li>将盖子盖在培养皿上，用封口膜封好，于 4 °C 保存。 
	注意： 培养皿可在 4 °C 下保存数天，但使用前应恢复至室温，以避免产生冷凝水。</li>
	<li>用白色游乐场沙子填满一个35 mm的培养皿，制成蟋蟀产卵用的卵收集皿（图1B). 
	注意： 指定的沙子 材料表 砂粒大小应适宜。若砂粒过大，会损伤鱼卵。</li>
	<li>用一张裁剪成约 18 cm x 18 cm 的正方形纸巾盖住盛蛋的器皿&#160;厘米，并将其置于铺有沙子的培养皿顶部。用此纸巾覆盖装有自来水的培养皿。</li>
	<li>倾斜培养皿，轻轻挤压顶部以去除多余的水分。</li>
	<li>将纸巾方块的四个角塞入培养皿底部边缘下方，并将盛有卵的培养皿放入倒置的皿盖中，以帮助固定纸巾覆盖物。</li>
	<li>将盛有卵的培养皿放入蟋蟀饲养箱中，让成年雌性蟋蟀产卵1至2小时。 
	注意： 此处相对较短的时间可确保所有卵在注射时处于相似的发育阶段。若需在细胞化之前进行注射，则应在产卵后14小时内完成注射。19.</li>
	<li>同时，将琼脂糖培养皿（来自步骤 3.6）放置于室温下回温，以备用于盛放待注射的卵。</li>
	<li>从蟋蟀饲养盒中取出装有新鲜产出卵的卵收集皿，移除纸巾覆盖物。将孔径为0.5–1 mm的筛子置于容量不小于500 mL的烧杯上图1B).</li>
	<li>将产卵皿中的内容物（沙子和卵）在缓流的自来水下冲洗至过滤器中，使沙粒穿过过滤器网孔落入下方烧杯的水中，而将蟋蟀卵留在过滤器篮中。</li>
	<li>用反渗透水（RO水）装满一个容器，并将其放入托盘中。将滤网倒扣在容器上方，轻敲培养皿，使卵粒落入水中。卵粒会沉入容器底部。</li>
	<li>用剪刀剪去P1000移液枪枪头的尖端，使其开口直径约为3 mm。将该枪头装在P1000移液器上，用于将卵从容器转移至琼脂糖卵模具培养皿中，尽量减少水分的转移。</li>
	<li>使用塑料镊子将卵整齐排列在盛有含1%青霉素/链霉素的HBS的琼脂糖孔中。每个卵将沉入单独孔的底部。在准备注射前，用培养皿盖覆盖。</li>
</ol>
4. 准备显微注射仪
<ol>
	<li>将显微注射仪连接至压缩空气或气体源（本实验方案使用压缩空气或N2优化）。 
	注意：若使用便携式气罐，需充气至至少75 psi。在注射过程中气罐压力会逐渐下降，可能需要重新充气；当压力低于40 psi时，注射将变得困难。</li>
	<li>打开显微注射仪。将注射时间设为0.17秒，压力设为10–15 psi。 
	注意：所需的确切压力取决于针头的开口大小，必须在每次注射实验或更换新针头时通过实验经验确定。</li>
	<li>确保显微注射仪的BALANCE旋钮已调至0（通常为完全逆时针方向），且显微注射仪已加压并处于注射模式。</li>
</ol>
5. 注射
<ol>
	<li>使用1 mL注射器和0.45 µm针头滤器过滤约500 µL的10倍注射缓冲液。</li>
	<li>混合注射试剂（以下细节适用于按文献12所述方法制备的dsRNA的注射）。 
	注意：在初次学习该技术时，设计并实施多个对照实验可能是明智的选择。例如，仅穿刺卵而不注射、单独注射缓冲液加染料，或注射缓冲液加染料及对照试剂（如eGFP dsRNA），这些均可有效评估注射流程中各因素可能带来的干扰程度。不同对照组的存活率见图3。</li>
	<li>以4 μL的dsRNA分装样品作为起始量。</li>
	<li>向dsRNA分装样品中加入0.5 μL过滤后的10倍注射缓冲液。</li>
	<li>加入0.5 μL浓度为50 mg/mL的四甲基罗丹明葡聚糖染料储备液。若在无荧光功能的解剖显微镜下操作，则应使用酚红替代。</li>
	<li>在整个注射过程中，所有材料均需保持在冰上。</li>
	<li>使用20 μL上样尖端和P10移液器将注射溶液装入注射针中。</li>
	<li>吸取1.5 μL注射溶液，并将上样尖端插入注射针的宽口端。</li>
	<li>尽可能将溶液推至针尖深处，并通过轻弹针管去除气泡；注意避免折断针头。</li>
	<li>将盛有卵的培养皿置于解剖显微镜下，选择约10倍的低倍放大（通过10倍目镜观察实现1倍物镜放大）。</li>
	<li>将针插入注射装置并拧紧固定。 
	注意：确保针头正确且牢固地插入装置中。操作时，将针的宽口端从金属套管中稍向外拉出，同时带出套管内的硅胶管。调整硅胶管位置，使玻璃针尖略微突出于硅胶管之外。若未正确操作，硅胶管可能被夹在玻璃针与金属套管之间，导致针尖堵塞。</li>
	<li>小心地将装有针头的注射装置插入显微操作仪。注意针尖锋利，避免碰撞表面造成断裂。</li>
	<li>在显微镜下同时观察卵和针头，移动针头至培养皿网格左上角附近的卵上方。</li>
	<li>降低针头，使其尖端进入培养皿中的HBS加1%青霉素/链霉素缓冲溶液中。</li>
	<li>将针头置于视野中央，并移动卵盘，使针头位置比卵更靠近培养皿边缘数毫米。</li>
	<li>避免针头遮挡卵阵列网格的视野。</li>
	<li>将显微镜切换至适用于罗丹明的滤光片，以便观察针内荧光并聚焦于针尖。</li>
	<li>在显微注射仪上，缓慢顺时针旋转BALANCE旋钮，直至注射溶液开始从针尖渗出进入悬浮液中。此时显微注射仪屏幕上的平衡数值将开始上升，但具体数值并不重要。随后，将旋钮略微逆时针回调，直至染料停止从针尖渗出。 
	注意：每次更换新针头时都必须重新设定此平衡。若未正确设定平衡，即使在注射触发结束后，显微注射仪仍会持续注射一段时间。甚至可能出现仅按一次注射按钮，未平衡的针头即将针内全部内容物排出的情况。</li>
	<li>在针头位于视野中央的情况下，移动卵盘，使针头对准第一个待注射的卵。建议从卵阵列的一个角落开始注射，例如左上角。</li>
	<li>调整放大倍数至约50倍；在此放大倍数下，单个卵将占据大部分视野。</li>
	<li>结合使用显微操作仪及手动移动卵盘，将针头调整至注射所需位置。</li>
	<li>使用显微操作仪推进针头，将其尖端插入第一个待注射的卵中。</li>
	<li>从卵的后端（较钝端）起约20–30%卵长处进针，进针方向垂直于卵的长轴（图1E）。</li>
	<li>通过显微注射仪的脚踏开关或注射按钮进行注射。卵内出现一小团荧光物质即表明注射成功（图1D）。 
	注意：注射过程中部分卵黄被排出卵外是常见现象（图1F），这并不一定意味着被注射的卵将失去活力。</li>
	<li>将针头从卵中撤出。若撤针时卵被意外带出其凹槽，可在撤针的同时使用小镊子将卵轻压回原位。</li>
	<li>若注射过程中针头堵塞，应先将针头从卵中取出，并保持针头浸没于覆盖卵的HBS加1%青霉素/链霉素溶液中，然后使用Clear功能或按下注射按钮清除堵塞。</li>
	<li>继续使用同一根针头，尽可能多地重复注射操作。初学者可能仅能完成约20至30枚卵的注射，但随着熟练度提高，可超过100枚。</li>
	<li>若针头堵塞且无法清除，则丢弃该针头，更换新针头并重新开始（即返回步骤5.7）。</li>
	<li>将注射后的卵盘置于温暖的培养箱（23.5–26 °C）中，环境保持轻微湿润（以减少蒸发），直至胚胎发育至分析所需的阶段。</li>
	<li>至少每24小时移除不再存活的卵（图3A、B），并更换新鲜的HBS加1%青霉素/链霉素悬浮液。</li>
	<li>注射后两到三天，用移液器轻柔吹打或使用塑料镊子将卵转移至加盖培养皿中湿润的滤纸上，滤纸用HBS加1%青霉素/链霉素润湿，继续在温暖湿润的培养箱中发育。</li>
	<li>持续监测卵的发育情况，每天移除不再存活的卵（图3A、B）。</li>
</ol>

<ol><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+August+Krogh+principle%3A+%E2%80%9CFor+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+B%3A+Molecular+and+Developmental+Evolution%22%5BJournal%5D)">The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
<li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+F+%22Cricket+neurobiology+and+behavior%22">Cricket neurobiology and behavior</a>. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).</li>
<li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorch%2C+HW+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22">The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior</a>. , Springer. Tokyo. (2017).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017(2012).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li>
<li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory%3A+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885(2015).</li>
<li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+in+the+Cricket%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+the+Cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing+in+Animals%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li>
<li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch%2FDelta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li>
<li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Wingless%2FArmadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus+%28Orthoptera%29%2C+as+revealed+by+RNAi+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li>
<li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).</li>
<li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li>
<li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).</li>
<li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li>
<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该技术的两个主要挑战是针头尺寸的优化和胚胎存活率问题。尽管使用较细的针头可提高存活率，但内径更窄的针头会产生更强的毛细作用力，从而更容易导致卵黄进入针管并引起堵塞。在较理想的情况下，可通过注射另一枚卵或按上述方法清理针头来清除堵塞。也可尝试增加显微注射仪的平衡压力，直至将卵黄推出针头。该技术的另一大挑战是存活率问题。在我们的实验中，注射实验溶液后卵的存活率通常介于40%至80%之间。对于刚开始学习该技术的操作者，存活率可能低至10%，但随着练习会逐步提高。如上所述，阴性对照对于研究人员准确评估随着操作熟练度提升而带来的存活率变化至关重要，因为引入不同物质本身可能导致存活率下降（图3C）。
注射时机对于每种实验方法而言同样是一个重要的考虑因素。较老的卵比新鲜产下的卵更难注射，通常情况下，注射较新鲜的卵其存活率也更高。在发育较晚阶段进行针头插入和物质注射可能会导致意外的解剖学损伤。然而，随着操作经验的积累，对孵化后两到三天的卵进行注射也是可行的。在这些阶段，应靶向卵的背侧进行注射，以避免损伤最初在腹侧形成的胚胎。靶向卵的后端可...

对生物体基因组进行修饰或调控基因表达的能力，是设计多种验证功能因果关系实验的基础。对于传统遗传学模式生物体系（如 Mus musculus、Danio rerio、Drosophila melanogaster 和 Caenorhabditis elegans）之外的生物体而言，拥有基因组和非基因组修饰技术对于开展具有比较意义和进化相关性的研究也至关重要。无论研究者旨在理解生物体多样性1，还是遵循克罗格原则（Krogh's principle），即每个生物学问题都存在一种最适合解答它的生物体2,3，能够修饰基因组或调控基因表达都是现代实验设计不可或缺的前提。
蟋蟀Gryllus bimaculatus是一种新兴的模式生物。在过去一个世纪中，它被用于神经行为学实验4，而近二十年来，科研人员对蟋蟀的研究兴趣日益增加，尤其关注该生物的进化与发育过程5。蟋蟀是一种半变态昆虫，其进化分支位于已被深入研究的全变态昆虫（如D. melanogaster和Tribolium castaneum）的基部位置6。由于其在进化树上的重要地位，科学家希望在此类昆虫中开展现代而复杂的实验研究，这也促使人们越来越重视将分子工具应用于G. bimaculatus的研究中。
向蟋蟀卵中注射分子试剂可用于基因组编辑实验，以及胚胎中基因表达的非基因组调控。例如，已利用转座酶 piggyBac7,8 构建了携带 eGFP 插入片段的转基因 G. bimaculatus。研究人员已成功利用锌指核酸酶（ZFNs）和类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）在特定基因组区域引入双链断裂，从而构建出 G. bimaculatus 基因敲除模型9。尽管 ZFNs 和 TALENs 能够实现四大模式生物体系之外动物的位点特异性靶向，但这些试剂很快被 CRISPR/Cas9 系统所取代，后者使用更简便、效率更高且具有高度灵活性10。在 G. bimaculatus 中，CRISPR 已被用于构建基因敲除11 和基因敲入品系12,13。除了基因组编辑外，还可将 dsRNA 注射到卵中，以在发育中的胚胎中降低 mRNA 表达水平，从而帮助研究人员理解特定转录本在发育全过程中的功能14,15。此前已有部分关于如何注射蟋蟀卵的简要操作细节发表12。
本文介绍了一种针对早期G. bimaculatus卵进行显微注射的详细实验方案。该方案高效且易于适应不同的实验室条件、注射材料，可能还可推广至其他昆虫。尽管有关基因组修饰和基因敲低实验设计与实施的更多细节已在其他文献中发表12,13，但这些方法最终均依赖于本文所述的显微注射技术。

<table><tbody><tr><td>荧光解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>带荧光功能的体视显微镜</td></tr><tr><td>荧光外部光源</td><td>Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>Narishige</td><td>IM-300</td><td>配件可能包括注射针夹持器、进气管（带管路接头）、交流电源线、脚踏开关、硅橡胶垫圈</td></tr><tr><td>mCherry滤光立方体</td><td>Leica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>适用于mCherry或类似红色染料的滤光立方体即可</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>需与磁力支架（Narishige，型号GJ-8）配合使用</td></tr><tr><td>磁力支架</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>移液管夹持器（针夹）</td><td>Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>连接气源与显微注射仪的管路</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卵井模具</td><td>3D打印</td><td>定制</td><td>使用Lulzbot Taz 5打印机以聚乳酸热塑性材料3D打印而成</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>各种品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱或温控室</td><td>各种品牌</td><td></td><td>需要维持23.5–26 &amp;deg;C的温度。</td></tr><tr><td>蟋蟀饲料</td><td>各种品牌</td><td></td><td>猫粮或鱼饲料均可作为合适的食物。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蟋蟀饮水</td><td>各种品牌</td><td></td><td>水可盛于小瓶中，并通过棉球供给蟋蟀饮用</td></tr><tr><td>蟋蟀庇护所</td><td>各种材料</td><td></td><td>庇护材料可包括揉皱的纸巾或蛋盒</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>货号 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&amp;trade; 硼硅酸盐玻璃毛细管，长度100 mm，内径0.58 mm，外径1.0 mm，带丝</td></tr><tr><td>微量移液管拉制仪</td><td>Flaming/Brown</td><td>型号 P-97</td><td>由Sutter Instrument Co.经销</td></tr><tr><td>磨针仪/微研磨器</td><td>Narishige</td><td>型号 EG-45/EG-400</td><td>EG-400包含显微镜头</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>CellTreat</td><td>产品编号 229693</td><td>直径90 mm</td></tr><tr><td>细沙</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>白色儿童用沙</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB000972</td><td>Agarose GPG/LE 超纯级</td></tr><tr><td>卵筛：超细斜纹网不锈钢锥形筛</td><td>US Kitchen Supply</td><td>型号 SS-C123</td><td>孔径应在0.5–1.0 mm之间</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>货号 15070-063</td><td>Pen Strep</td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>黑色防静电，118 mm</td></tr><tr><td>注射器滤器，直径25 mm，孔径0.45 &amp;micro;m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td><td>与1 mL注射器配合使用</td></tr><tr><td>1 mL注射器，带结核菌素滑动针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>与注射器滤器配合使用以过滤注射缓冲液，Luer-Lok接头注射器也可使用</td></tr><tr><td>气罐（可选）</td><td>Midwest Products</td><td>Air Works&amp;reg;</td><td>便携式气罐</td></tr><tr><td>罗丹明染料</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>葡聚糖-四甲基罗丹明，分子量10,000</td></tr><tr><td>20 µL上样吸头</td><td>Eppendorf</td><td>订单号 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &amp;mu;L Microloader</td></tr><tr><td>复合显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>20倍物镜</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite&amp;nbsp; 软件</td><td>Leica</td><td>LAS</td><td>此处使用版本4.6.2</td></tr></tbody></table>

注射gryllus bimaculatus卵

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

在发育中的生物体中改变基因功能是多种实验的核心。尽管在传统模式生物体系中已开发出极为强大的遗传学工具，但在大多数其他生物体中操纵基因或信使RNA（mRNA）仍然困难。与此同时，进化和比较研究依赖于在多种不同物种中探索基因功能，这就需要发展和改进适用于当前非遗传操作友好型物种的基因表达操控技术。本实验方案描述了一种将试剂注入蟋蟀卵以检测特定操作对胚胎或幼虫发育影响的方法。文中详细说明了如何收集卵并使用斜面针头进行注射的操作步骤。这一相对简单直接的技术具有灵活性，且有望适用于其他昆虫。单次实验中可收集并注射数十枚卵，仅注射缓冲液的存活率随着操作熟练程度提高而提升，最高可达80%。该技术可支持多种实验方法，包括药理学试剂的注射、体外加帽mRNA的注射以表达目标基因、双链RNA（dsRNA）介导的RNA干扰、利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）与CRISPR相关蛋白9（Cas9）试剂实现基因组编辑，以及利用转座元件构建瞬时或稳定的转基因品系。

蟋蟀容易在潮湿的基质中产卵，提供充足的潮湿沙土或土壤等材料可诱导其大量产卵。若在产卵前先让蟋蟀缺乏产卵基质8–10小时，则效果尤为显著。在洁净沙土中产出的卵可轻松分离并收集（图1B），随后放入特制的卵孔板中用于显微注射（图1C）。可使用解剖显微镜、显微注射仪和显微操作器（图1A）对单个卵进行多种物质的注射（图1D）。注射部位位于卵的后端附近，大约在前后轴方向的20–30%处（图1E）。由于卵的前端较尖、后端较钝，但两者差异通常较细微，因此区分较为困难（图1E）。将卵左右轻轻滚动通常有助于辨别两端。注射针退出后，有时会观察到卵黄被排出（图1F），但此现象似乎不会...

本文介绍了一种蟋蟀卵显微注射的实验方案，该技术是开展蟋蟀多种实验研究的基础方法，包括但不限于RNA干扰和基因组编辑。

注射Gryllus bimaculatus卵

改变发育中生物体的基因功能是多种实验的核心。尽管已有极为强大的遗传学工具被开发……

该技术是研究蟋蟀胚胎或幼虫发育实验的基础方法。此技术的主要优势在于其灵活性，可支持多种实验方法，例如利用RNA干扰或基因组操作的技术。实验操作将由实验室首席研究员Hadley Wilson Horch进行演示。开始此操作时，用滴水润湿斜面仪的旋转研磨平面。将拉制好的针头放入斜面仪中，并将其调整至20度角。缓慢降低针头，直至其刚好接触研磨板，然后研磨2到3分钟。将带有斜面的针头放置在已粘附于玻璃载玻片的双面胶带上，以评估斜面。将载玻片置于配备摄像头和图像采集软件的复合显微镜载物台上。使用20倍物镜采集针头的图像。使用成像软件测量针尖斜面开口近端内腔的直径。丢弃任何开口小于8微米或大于12微米的针头。首先，配制40毫升1%的琼脂糖水溶液，并将其倒入10厘米的培养皿中。在琼脂糖凝固之前，将其表面放置一个制孔模具。待琼脂糖完全凝固后，移除模具，形成孔穴。随后，向琼脂糖孔板中加入含有1%青霉素-链霉素的HBS溶液。将培养皿盖上盖子，用帕拉膜（Parafilm）包裹，并在4°C下保存。随后，取一个35毫米的培养皿，装入白色游乐场用沙子，制成蟋蟀产卵用的卵收集皿。用一张约18厘米×18厘米的正方形纸巾覆盖卵皿。通过纸巾用自来水注满。然后倾斜培养皿，轻轻挤压顶部以去除多余的水分。将方形纸巾的四个角塞入培养皿下方，并将盛有卵的培养皿放入倒置的皿盖中，以帮助固定纸巾。将盛有卵的培养皿放入蟋蟀饲养盒中，让成年雌性蟋蟀产卵1至2小时。同时，将琼脂糖培养皿置于室温下回温，以备后续用于盛放待注射的卵。准备就绪后，从蟋蟀饲养盒中取出已收集新鲜卵的培养皿。移除纸巾，将孔径在0.5至1毫米之间的筛子置于烧杯上方。用缓慢流动的自来水冲洗产卵皿中的内容物，使其流入筛子。沙粒会穿过筛网落入下方的烧杯中，而蟋蟀卵则保留在筛子的篮体内。用反渗透水装满一个容器，并将其放入托盘中。将滤网倒置在容器上方，轻轻敲击培养皿，使卵粒落入水中。卵会沉入容器底部。接下来，使用剪刀剪去 P1000 移液枪枪头的尖端，使其开口直径约为三毫米。将该枪头安装在 P1000 移液器上，用于将卵从容器转移至琼脂糖制卵模具培养皿中。使用塑料镊子将卵在琼脂糖小孔中排列整齐。每个卵将沉入单独孔的底部。在准备显微注射前，用盖子盖住培养皿。开始时，将盛有卵的培养皿置于解剖显微镜下，并选择约10倍的低倍放大。使用 20 微升上样吸头和 P10 移液器吸取 1.5 微升注射溶液，将上样吸头插入注射针的宽端。将注射溶液排入注射针中。将针插入注射装置的卡槽内并拧紧，确保针已正确且牢固地插入装置中。然后小心地将注射装置插入显微操作仪中，注意避免被针头刺伤或损坏针头。在显微镜下同时观察卵子和针头，将针头移至培养皿网格左上角的“X”标记附近。缓慢降低针头，直至针尖进入培养皿中的HBS加青霉素-链霉素缓冲液中。将针尖置于视野中央，移动卵皿，使针尖比卵靠近皿边缘几毫米。然后，将显微镜调节至适用于罗丹明的滤光片，以观察针尖中的荧光，并对准针尖进行聚焦。在显微注射仪上缓慢顺时针旋转平衡旋钮，直至注射液开始从针尖渗出，进入悬浮液中。然后将旋钮略微逆时针旋转，直至染料刚好停止从针头渗出。保持针头位于视野中央，移动卵盘，使针头对准待注射的第一枚卵。调节放大倍数至约50倍，使单枚卵占据视野的大部分区域。使用显微操作仪并用手固定卵盘，将注射针移动至注射位置。使用显微操作仪推进注射针，将针尖插入第一个待注射的卵，确保从卵的后端沿卵长轴垂直方向插入卵体长度的20%至30%处。通过显微注射仪的脚踏开关或注射按钮注入溶液。卵内出现少量荧光物质即可表明注射成功。随后将针头从卵中退出。若针头退出时意外将卵带出其凹槽，可使用小镊子在退出针头的同时将卵轻轻推回凹槽内。在本研究中，采用一种技术对蟋蟀卵进行显微注射，该技术是包括RNA干扰和基因组操作在内的许多实验的基础方法。存活率是评估本实验成功与否的重要参数之一。大多数死亡的卵可通过肉眼轻易识别，表现为卵内的卵黄和胚胎组织开始不均匀地聚集，最终大部分卵黄将迁移至卵的一侧。在注射后四到六天进行评估时，未注射的卵存活率超过85%，而注射了实验试剂的卵通常存活率较低。为了准确理解所进行实验操作的真实效应，必须对注射过程本身的所有方面进行对照，包括针头穿刺、染料和缓冲液的引入，以及载体或双链RNA的存在。评估注射后表型结果的方法取决于所注射的内容。例如，由于特定 mRNA 被敲低而导致的表型变化可能在整体解剖学水平上就十分明显。然而，如果利用 piggyback 转座酶将一段 cDNA 插入到蟋蟀基因组中，该 cDNA 在 G.bimaculatus 肌动蛋白启动子的调控下编码 EGFP 标记的组蛋白 2B 基因，则可以通过荧光激发 EGFP 标记的组蛋白 2B 蛋白，从而在卵中可视化每一个细胞核。在此操作过程中，调节平衡以防止针头堵塞是一个关键步骤。在后续注射后，您可能需要进行多次调整，因为卵黄有时会堵塞针尖。蟋蟀是一种半变态昆虫，其进化分支位于果蝇等研究较为深入的全变态昆虫的基部。研究蟋蟀的发育过程将有助于我们更深入地理解动物界中进化与发育的相关机制。该技术需要一定的练习。我们建议练习对照注射，直至注射后四到五天的存活率至少达到80%。

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