注射双斑蟋蟀（Gryllus bimaculatus）卵

该技术是用于研究蟋蟀胚胎或幼虫发育实验的基础方法。此技术的主要优势在于其灵活性，可支持多种实验方法，例如利用RNA干扰或基因组操作的技术。实验操作将由实验室的首席研究员Hadley Wilson Horch进行演示。

开始此操作时，用滴水润湿斜面仪的旋转研磨平面。将拉制好的针头放入斜面仪中，并将其调整至20度角。缓慢降低针头，直至其刚好接触研磨板，然后研磨2到3分钟。

将带有斜面的针头放置在已粘附于玻璃载玻片的双面胶带上，以评估其斜面。将载玻片置于配备摄像头和图像采集软件的复合显微镜载物台上。使用20倍物镜采集针头的图像。

使用成像软件测量针尖斜面开口近端内腔直径。丢弃任何开口小于8微米或大于12微米的针头。首先，配制40毫升1%的琼脂糖水溶液，并将其倒入10厘米的培养皿中。

在琼脂糖凝固之前，将其表面放置一个制孔模具。待琼脂糖完全凝固后，移除模具，形成孔穴。随后，向琼脂糖孔板中加入含有1%青霉素-链霉素的HBS溶液。

将盖子盖在培养皿上，用帕拉膜（Parafilm）包裹，并在4摄氏度下保存。随后，取一个35毫米的培养皿，装入白色游乐场用沙，制成供蟋蟀产卵的集卵皿。用一块约18厘米×18厘米的正方形纸巾覆盖集卵皿。

通过纸巾用自来水注满。然后倾斜培养皿，轻轻挤压顶部以去除多余的水分。将方形纸巾的角落塞入培养皿下方，并将盛有卵的培养皿放入倒置的皿盖中，以帮助固定纸巾。

将盛有卵的器皿放入蟋蟀饲养盒中，让成年雌性蟋蟀产卵1至2小时。同时，将琼脂糖培养皿置于室温下回温，以备后续用于盛放待注射的卵。准备就绪后，从蟋蟀饲养盒中取出已收集新鲜卵的器皿。

移除纸巾，将孔径在0.5至1毫米之间的筛子置于烧杯上方。用缓慢流动的自来水冲洗产卵皿中的内容物，使其流入筛子。沙粒将穿过筛网落入下方的烧杯中，而蟋蟀卵则保留在筛子的篮体内。

用反渗透水装满一个容器，并将其放入托盘中。将滤网倒置在容器上方，轻轻敲击培养皿，使卵粒落入水中。卵会沉入容器底部。

接下来，使用剪刀剪去 P1000 移液枪枪头的尖端，使其开口直径约为三毫米。将该枪头安装在 P1000 移液器上，用于将卵从容器转移至琼脂糖制卵模具培养皿中。使用塑料镊子将卵在琼脂糖小孔中排列整齐。

每个卵将沉入单独孔的底部。在准备显微注射前，用盖子盖住培养皿。开始时，将盛有卵的培养皿置于解剖显微镜下，选择约10倍的低倍放大。

使用 20 微升上样吸头和 P10 移液器吸取 1.5 微升注射溶液，将上样吸头插入注射针的宽端。将注射溶液排入注射针中。将针插入注射装置，并拧紧，确保针已正确且牢固地插入装置中。

然后小心地将注射装置插入显微操作仪中，注意不要被针头刺伤或折断针头。在显微镜下同时观察卵子和针头，将针头移至培养皿网格左上角的“X”标记附近。缓慢降低针头，直至针尖进入培养皿中的HBS加青霉素-链霉素缓冲液中。

将针头置于视野中央，移动卵皿，使针头比卵靠近皿边缘几毫米。然后，将显微镜调节至适用于罗丹明的滤光片，以观察针头中的荧光，并聚焦于针尖。在显微注射仪上缓慢顺时针旋转平衡旋钮，直至注射液开始从针头渗出，进入悬浮液中。

然后将旋钮略微逆时针旋转，直至染料刚好停止从针头渗出。保持针头位于视野中央，移动卵盘，使针头对准第一个待注射的卵。调节放大倍数至约50倍，使单个卵占据大部分视野。

使用显微操作仪并用手固定卵盘，将注射针移动至注射所需位置。使用显微操作仪推进注射针，将针尖插入第一个待注射的卵中，确保从卵的后端沿长轴垂直方向插入卵体长度的20%至30%处。通过显微注射仪的脚踏开关或注射按钮注入溶液。

卵内出现少量荧光物质团块表明注射成功。随后将针头从卵中退出。若针头退出时意外将卵带出其凹槽，可使用小镊子在退出针头的同时将卵轻轻推回凹槽内。

在本研究中，采用一种技术对蟋蟀卵进行显微注射，该技术是包括RNA干扰和基因组操作在内的多种实验的基础方法。存活率是评估本实验成功与否的重要参数之一。大多数死亡的卵可通过肉眼轻易识别，表现为卵内的卵黄和胚胎组织开始不均匀地聚集，最终大部分卵黄将迁移至卵的一侧。

在注射后四到六天进行评估时，未注射的卵存活率超过85%，而注射了实验试剂的卵通常存活率较低。为了准确理解所进行实验操作的真实效应，必须对注射过程本身的所有方面进行对照，包括针头穿刺、染料和缓冲液的引入，以及载体或双链RNA的存在。评估注射后表型结果的方法取决于所注射的内容。

例如，由于特定 mRNA 被敲低而导致的表型变化可能在整体解剖水平上就十分明显。然而，如果利用 piggyback 转座酶将一段 cDNA 插入蟋蟀基因组，该 cDNA 在 G.bimaculatus 肌动蛋白启动子的调控下编码 EGFP 标记的组蛋白 2B 基因，则可通过荧光激发 EGFP 标记的组蛋白 2B 蛋白，从而在卵中可视化每一个细胞核。在此操作过程中，调节平衡以防止针头堵塞是一个关键步骤。

在后续注射后，您可能需要进行多次调整，因为卵黄有时会堵塞针尖。蟋蟀是一种半变态昆虫，其进化分支位于果蝇等研究较为深入的全变态昆虫的基部。研究蟋蟀的发育将有助于我们更深入地理解动物界中进化与发育的规律。

该技术需要一定的练习。我们建议练习对照注射，直至注射后四到五天的存活率至少达到80%。