Name: 富玛莱酸氢酶含含蛋白质的表达、纯化、结晶和酶测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习FAH结构域蛋白的表达与纯化方法，使用大肠杆菌IPTG诱导系统和镍NTA亲和层析技术。本方案涵盖FPLC纯化、结晶及酶活性测定，为研究FAHD1在线粒体能量代谢中的功能提供可靠实验基础。

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作者非常感谢Annabella Pittl提供的专业技术支持以及Haymo Pircher进行的初步方法开发。

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</ol>

作者声明无任何披露事项，且不存在竞争性财务利益。H. G. 担任 MoleculeCrafting.HuGs e.U. 的首席执行官兼首席科学官，并通过定制合成方式为本研究提供了酰基丙酮酸酯。via。P. J. D. 实验室的工作得到了奥地利科学基金（FWF）的支持：项目编号 P 31582-B26。本论文的部分出版费用由奥地利科学基金（FWF）在项目编号 P 31582-B26 下承担。A. N. 和 B. R. 由奥地利科学基金（FWF）在项目 P28395-B26 下资助。

关键步骤
FAHD 蛋白对盐浓度非常敏感。在低 NaCl 浓度下，蛋白质在解冻时可能发生沉淀，但通常可在较高盐浓度下完全重新溶解。也就是说，如果 FAHD 蛋白因某种原因发生沉淀，可通过提高盐浓度（&gt;300 µM）进行回收或复性。然而，某些疏水性更强的蛋白质可能无法恢复（例如人源 FAHD2），此时可使用 CHAPS（最高 1%）或甘油（10%）等去垢剂以维持其在溶液中的稳定性。无论何种情况，均建议使用液氮速冻并保存于 -80 °C，因为这种方法解冻过程温和且缓慢。
在3.1.10步骤的Ni-NTA纯化过程中，可能会出现一些意外问题。值得注意的是，如果第二次收集的样品OD值高于第一次样品，表明琼脂糖树脂的用量过高（应记录此情况，并在下次实验中减少树脂用量）。此外，琼脂糖树脂本身在280 nm处会产生OD信号（即树脂床的破坏会产生人为的信号）。如有疑问，建议使用其他方法（如Bradford法或BSA法）测定蛋白质浓度。
在酶学测定中，有三个关键方面需要考虑。首先，准确测定蛋白质浓度对于获得正确的比活性至关重要。蛋白质的纯度水平会影响实验结果，因此需要进行估算。对于带标签的蛋白质，必须计算标签部分的质量，并相应地校正比活性。对于本方案第7节中描述的简单测定，Ni-NTA纯度足以区分活性与非活性底物、辅因子等。而在更复杂的米氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）测定中，则必须准确确定所有反应物和底物的浓度。特别是使用草酰乙酸（其会随时间自发脱羧）时，必须根据自发脱羧反应对酶促反应部分进行校正（假设这两个反应同时发生）。此外，还需考虑底物酮-烯醇互变异构引起的光密度信号初始变化。第三，必须正确调整浓度和体积。即使酶和底物浓度相同，不同反应体系体积也可能导致不同的实验结果。如果每孔中酶量过多，液体的黏附效应实际上可能造成结果偏差。
为评估米氏动力学，建议先以 100 µL、200 µL 和 300 µL 的反应体系进行初步实验，以确定最佳组合。类似的因素也适用于动力学测定中酶与底物浓度的比例。每单位底物中酶过多或每单位酶中底物过多，都会使系统偏离线性稳态的米氏动力学范围。因此需要通过初步实验优化这些条件。第 8 节提供了人源 FAHD1（野生型）蛋白的示例性调整方案，结果可得到动力学图谱（例如 图 5B 所示）。
进行结晶时，将一滴蛋白质溶液用移液器滴加在盖玻片中央，并与一滴结晶缓冲液混合，该结晶缓冲液通常由缓冲剂（例如 Tris-HCl、HEPES）和沉淀剂（例如聚乙二醇、硫酸铵）组成。可选择性地加入一滴抑制剂溶液以进行共结晶（如本实验方案中的草酸盐）。随后将盖玻片倒置，覆盖在含有结晶缓冲液的储液井上方，并借助密封油将井口完全密封（图6B）。理想情况下，在实验开始时液滴内不发生沉淀，即蛋白质仍保持溶解状态。由于储液井中沉淀剂的浓度高于液滴中的浓度，液滴中的水分子会通过蒸发逐渐扩散至井内气氛中，直至与储液井达到平衡。水分向储液井的扩散导致液滴体积缓慢减少，进而引起液滴中蛋白质和沉淀剂浓度的同步升高。当蛋白质溶液达到所需的过饱和状态（即亚稳态）时，可能发生自发成核并继而生长出晶体。达到过饱和状态是结晶的必要条件，但并非充分条件。蛋白质结晶需要同时满足有利的热力学和动力学条件，并且在很大程度上取决于待结晶蛋白质本身不可预测的性质22。
修改与故障排除
在E. coli中表达蛋白时，表达效率可能较低。对于每种新蛋白，可能需要测试不同的IPTG浓度、表达温度和诱导时间（例如室温下数小时或4°C过夜），以确定最佳表达条件。对于疏水性较强的FAHD蛋白，有时会观察到蛋白在包涵体中沉淀。在此类情况下，建议在其他表达系统（如昆虫细胞）中进行蛋白表达，因为包涵体的形成概率较低26。
由于FAHD蛋白对盐浓度、辅因子浓度以及pH值敏感，不同同源物、直系同源物及点突变变体的纯化策略可能因实验条件而异。此处描述的纯化方法适用于野生型人源和鼠源FAHD1蛋白。对于等电点（pI）不同的蛋白，可能需要调整化学试剂（如NaCl和咪唑）的浓度以及pH值。值得注意的是，并非所有His标签蛋白均能有效结合Ni-NTA树脂。若蛋白在Ni-NTA柱上的结合效率较低，可通过调整Ni-NTA洗脱缓冲液中的NaCl和咪唑浓度，或改变pH条件，以提高纯化效果。若仍无效，可跳过Ni-NTA步骤，直接进行离子交换层析，这也可能实现成功的纯化。若蛋白能够结合Ni-NTA柱但无法被洗脱，加入数毫摩尔（mM）的EDTA可能有助于破坏Ni2+复合物。
关于结晶过程，需要理解的是，大而复杂的蛋白质分子自发组装成规则的周期性晶格是一种本质上极不可能发生的过程，其结果高度依赖于难以控制的动力学参数。即使结晶实验条件发生微小变化，也可能显著改变结果，导致无法形成晶体。蛋白质纯度通常至关重要。一般而言，在严重过载的SDS-PAGE凝胶中不应观察到其他条带。此外，操作步骤的顺序也可能影响实验结果。例如，为了确保可重复性，通常需要保持加样顺序一致，即先加入蛋白质，最后加入沉淀剂至结晶液滴中（或相反）。无论采用哪种方法，在尝试重复实验或放大实验规模时，都应保持操作方法一致。如果按照此方案未观察到晶体，可对化学沉淀剂的组成、pH值、液滴体积以及蛋白质与沉淀剂的比例进行小幅度调整。耐心以及对液滴持续一致的观察是成功的关键。
关于FAHD1催化机制的说明
本文所述方法专门用于获得高质量的FAHD1蛋白，从而实现了FAHD1晶体的生长，并成功构建了包含FAHD1与抑制剂（草酸盐，PDB:6FOG）复合物的晶体。X射线结构揭示了该酶催化腔的三维构象，这些结果系统地描述了可能对该酶催化机制具有重要作用的氨基酸残基。FAHD1最初被报道具有裂解酰基丙酮酸（乙酰丙酮酸、富马酰丙酮酸）的能力11。随后研究发现，FAHD1还具有催化草酰乙酸脱羧的活性12。尽管底物酰基丙酮酸与草酰乙酸在化学结构上不同，但其化学转化在机理上均涉及一个共同的C3-C4键的断裂过程，当C3-C4键轨道与C2-羰基的π轨道保持正交时，该过程在能量上更易发生15。这种构象有利于在裂解过程中瞬时形成的C3-碳负离子通过共振得以稳定。FAHD1的底物（草酰乙酸和酰基丙酮酸）为柔性分子，可存在互变异构（酮-烯醇式）以及C2-水合形式（图9A）。不同物种之间的平衡主要取决于缓冲液组成、pH值以及金属离子的存在。下文将结合X射线晶体结构分析所揭示的FAHD1催化中心特征，讨论可能的催化机制假说。
<img alt="酮-烯醇互变异构示意图；化学结构；酮式、烯醇式、烯醇负离子形式；pH 7.4 条件下的分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图9"> 
图9：人源FAHD1催化机制的详细说明。 
(A) 草酰乙酸在结晶状态以及中性溶液中主要以Z-烯醇形式存在24。然而，在生理pH条件下，2-酮式是其主要存在形式25。 (B) hFAHD1活性腔的化学示意图15，显示与Mg结合的草酰乙酸（左侧）和酰基丙酮酸（右侧，R1为有机基团；红色箭头表示邻近稳定水分子的亲核攻击）（见讨论部分）。 (C) FAHD1脱羧酶机制（b到c）与水解酶机制（b’到c）中C3-C4断裂优势构象的比较：两种过程均生成与Mg配位的丙酮酸烯醇负离子（见讨论部分）。中间体b和b’预计由Q109稳定，如图B所示（见讨论部分）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig09v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
FAHD1 的脱羧酶活性
草酰乙酸以结晶态存在，且在中性溶液中主要以Z-烯醇式形式存在24。然而研究表明，在生理pH条件（pH 7.4的缓冲体系）下，草酰乙酸主要以2-酮式形式存在25（图9A），且烯醇化并非脱羧反应的先决条件27。值得注意的是，在pH 7.4或更低条件下，Mg2+离子对草酰乙酸不同存在形式的比例无显著影响28。根据结合草酸盐的FAHD1酶复合物结构（PDB: 6FOG15）的引导，将草酰乙酸的酮式构象置于FAHD1的催化中心，发现残基Q109在调控结合态草酰乙酸构象中起构象调节作用15。如另一篇文章所述15，Q109的氨基甲酰基通过氢键作用稳定了草酰乙酸围绕C2-C3键旋转后形成的构象（图9B，左图）。由于该旋转，待断裂的C3-C4键相对于C2羰基的π轨道接近正交排列（图9C）。随后可释放二氧化碳。该过程的初始产物应为共振稳定的丙酮酸镁-烯醇化物。已有对草酰乙酸-Mg复合物的研究表明，烯醇化物形式可形成最稳定的复合物28,29。若假设Mg-丙酮酸烯醇化物复合物具有类似的稳定性，则FAHD1的辅因子可能被占据而无法释放；但赖氨酸残基K123可通过质子化丙酮酸烯醇化物，建立平衡以防止辅因子的丢失15。
上述解释表明，在FAHD1的催化ODx功能中，丙酮酸烯醇式是一种明确的中间产物。在假设模型的这一步骤中，实验数据并未进一步揭示为何封闭的盖子应打开以释放产物。然而可以推断，该提出的机制类似于产物对酶的抑制作用：晶体结构显示，一个保守的水分子被定向朝向FAHD1催化中心，该水分子由残基H30和E33固定，这两个残基位于一段短α螺旋中15，而该螺旋在配体结合和盖子闭合后被诱导形成。如果初级烯醇式与烯醇负离子处于平衡状态，共振稳定的烯醇负离子可被该水分子淬灭生成丙酮酸。所产生的羟基则能够将丙酮酸从Mg辅因子上置换下来，随后盖子打开。最终，催化中心将在线粒体环境中恢复。在此假设情景中，空腔内的水分子相应地发挥酸的作用。
FAHD1 的水解酶活性
酶的水解酶活性隐含地需要形成羟基亲核中间体。该机制通常与酸碱催化活性相结合。反应的过渡态必须通过活性位点内关键氨基酸侧链的构象控制来准备。类比于脱羧酶功能的讨论，以2-酮形式存在的酶结合型酰基丙酮酸将在构象上受到控制，其中4-羰基氧通过与Q109的氢键作用而固定（图9B，右图）。草酸结合态FAHD1的晶体结构（PDB:6FOG）显示，一个保守的水分子被H30和E33残基以短α螺旋的形式定向锚定，使其朝向FAHD1的催化中心15。E33-H30二联体能够使该定向排列的水分子去质子化，所产生的羟基处于理想位置，可进攻由Q109通过构象控制所呈现的酰基丙酮酸的4-羰基15。
值得注意的是，FAH 也提出了类似的机制18。羟基亲核试剂的进攻预期会形成一种氧负离子中间体，在轨道控制的 C3-C4 键断裂过程中得以稳定（图9C）。在此模型中，C3-C4 键的旋转（图9C）发生在 图9B 所示生成的羟基进行亲核进攻之后（即该步骤为酰基丙酮酸的键断裂做好准备）。主要产物为乙酸和 Mg-丙酮酸烯醇负离子。在此假设情形下，乙酸可将烯醇淬灭为丙酮酸，并随后协助产物的释放。在 pH 高于 7.5 且存在 Mg 离子的条件下，酰基丙酮酸在酮式与烯醇式之间存在平衡，其中烯醇式略占优势30。最有可能的是，在随后的盖子结构闭合过程中，这两种形式均可与 FAHD1 的辅因子结合。由于烯醇式结构较为平坦，酶对其烯醇型酰基丙酮酸底物的催化受到阻碍。C3-C4 键的断裂将产生一个无共振稳定的乙烯型碳负离子。
因此，我们提出一个催化酮化步骤，以促进羟基亲核试剂对酰基羰基的进攻。然而，该酮化过程需要FAHD1残基对质子转移进行调控，这将赋予FAHD1固有的异构酶活性。据报道，与未络合形式相比，Mg结合的烯醇氢的酸性可增强一万倍28。结合于Mg的烯醇形式可通过未质子化的K123实现去质子化。K123的去质子化可能由D102的羧酸根协助完成。由D102-K47-K123残基形成的氢键网络可在FAHD1的催化中心充当必要的质子传递通路15。由此生成的中间体烯醇负离子随后可在底物酮化过程中被E33-H30-H2O三联体淬灭15。生成的2-酮形式将受到Q109的构象控制，同时形成的羟基将进攻酰基羰基。综上所述，该讨论表明FAHD1可通过形成空腔的残基之间的协同作用，调控一个水分子在酸与碱状态之间的转换。
该方法的未来应用或发展方向
本文所述方法的未来应用前景十分广泛。FAH超家族中大量原核生物成员的功能仍有待表征。即使对于已知的FAH超家族成员，目前有关其催化活性的信息也极为有限，且大多数结论基于理论推测而非实验数据。将本文所述方法应用于原核生物FAH超家族成员的研究，取决于细菌学领域的具体研究兴趣。另一方面，最近的研究表明，真核生物FAH超家族成员在不同细胞区室（例如细胞质与线粒体）中发挥着关键作用，这凸显了深入表征这些蛋白的必要性（迄今已鉴定出三种）。尤其值得注意的是，现有数据提示某些尚未表征的蛋白可能在线粒体生物学、衰老研究以及癌症研究中执行不同的功能。有观点认为，对这些真核生物FAH超家族成员进行全面的分子和生理学表征，可能为当前生物医学领域的重要研究方向提供关键见解。此外，还需进一步研究FAHD1（及相关酶）的作用机制，以更深入地理解其双功能特性的分子基础，而这一机制目前尚未完全阐明。针对FAHD1突变体的额外研究、核磁共振（NMR）分析以及抑制剂复合物的结构研究，可能有助于揭示FAHD1所具备的真实反应机制。此外，通过计算机辅助设计能够结合Mg辅因子的烯醇类似物，最终有望开发出高效的FAHD1抑制剂。

富马酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）1,2 酶超家族是一类具有高度保守催化FAH结构域的酶3,4,5,6,7,8,9,10。尽管这些酶具有共同的催化中心，但它们具有多种功能，且大多数存在于原核生物中，用于降解来自复杂碳源的化合物3。迄今为止，在真核生物中仅发现该家族的三个成员：命名来源的FAH2，以及富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白1（FAH domain-containing protein 1, FAHD1）11,12,13,14,15 和富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白2（FAH domain-containing protein 2, FAHD2）。FAHD1的缺失与线粒体呼吸功能受损13,16 相关，并与一种可逆性的细胞衰老表型相关14，该表型与电子传递系统中间态功能缺陷有关。人类FAHD1及其在模式系统（小鼠、线虫、癌细胞系、植物等）中的直系同源物，以及部分定点突变变体，已成为具有潜在研究价值的可成药靶点。本研究需要高纯度的重组蛋白，以及基于晶体结构和特异性抗体指导的催化机制信息。
本文描述了在大肠杆菌（E. coli）中表达FAHD蛋白、亲和层析、离子交换层析、硫酸铵沉淀、制备型和分析型凝胶过滤、结晶、X射线衍射以及光度测定等方法。所述方法与实验方案的目的是为从事细菌学、植物生物学以及动物和人类研究等不同领域研究的科研人员提供指导，以鉴定FAH超家族成员，包括在特定研究领域中可能变得重要的尚未表征的超家族成员。本文所述的实验方案可为旨在鉴定其他原核或真核生物FAH超家族成员的研究项目提供有价值的帮助。
本文所述方法的理论基础在于，对于功能尚未充分阐明的蛋白质（特别是生理相关性未知的代谢酶），从纯化的重组蛋白入手，有助于开发出一系列极为宝贵的高质量研究工具，例如体外具有活性的酶制剂、高质量抗体，以及针对特定酶的高效且特异性的药理学抑制剂。所述方法需要使用快速蛋白液相色谱（FPLC）和X射线晶体学。其他替代方法（例如，无需化学诱导即可表达蛋白，或通过加热处理后离心、脱盐及尺寸排阻色谱来展示蛋白纯化过程）可参见 elsewhere17。尽管已有更广泛的方法可用于FAH超家族酶的表达与纯化2,7,9,17,18，但本研究特别聚焦于FAHD蛋白的表达与纯化。
在本文的讨论部分，为了阐明FAHD1蛋白（水解酶、脱羧酶）所催化的反应的化学特性，对其已鉴定的催化机制进行了更详细的描述15。基于先前研究7,15,18（PDB: 6FOG, PDB:6FOH）获得的数据表明，该酶可能还具有第三种活性，即酮-烯醇异构酶活性。

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) pLysS 感受态 E. coli</td><td>Promega</td><td>L1195</td><td>高效蛋白质表达（基于含T7启动子和核糖体结合位点的基因）</td></tr><tr><td>pET 大肠杆菌 T7 表达载体</td><td>MERCK</td><td>-</td><td>http://www.merckmillipore.com/AT/de/life-science-research/genomic-analysis/dna-preparation-cloning/pet-expression-vectors/qFSb.qB.mLQAAAFA6.VkiQ0G,nav</td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m 滤膜单元</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP，0.45 &amp;micro;m，PES 33 mm，未灭菌</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 滤膜单元</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP，0.22 &amp;micro;m，PES 33 mm，非无菌</td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>微型离心管；经高压灭菌</td></tr><tr><td>15 mL Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>离心管</td></tr><tr><td>50 mL Falcon管</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>离心管</td></tr><tr><td>PS 比色皿 分光光度计 半微量</td><td>VWR</td><td>30622-758</td><td>VIS透明比色皿</td></tr><tr><td>紫外比色皿分光光度计半微量</td><td>VWR</td><td>47727-024</td><td>紫外/可见光透明比色皿</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>ROTH</td><td>2316</td><td>用于DE3/pET系统中蛋白表达诱导的化学试剂</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>ROTH</td><td>X998</td><td>用于从镍离子负载的亲和树脂中洗脱聚组氨酸（6xHis）序列的化学物质</td></tr><tr><td>玻璃经济型层析柱</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>-</td><td>http://www.bio-rad.com/de-at/product/glass-econo-column-columns?ID=2cfb1c6e-32e8-4c72-b532-dd39013d707d&amp;&pcp_loc=catprod</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>用于细菌生长筛选的抗生素；抗性基因&amp;oacute;pLysS 质粒的 BL21(DE3) 大肠杆菌中表达；25 &amp;micro;g/mL 终浓度</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>用于细菌生长筛选的抗生素；若所用pET载体编码该抗性，则使用；50 &amp;micro;g/mL 终浓度</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td>用于细菌生长筛选的抗生素；若所用pET载体编码该抗性，则使用；100 &amp;micro;g/mL 终浓度</td></tr><tr><td>Ultra-15，截留分子量 10 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z706345</td><td>用于蛋白质富集的离心滤器；https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z706345?lang=de&amp;reg;离子=AT</td></tr><tr><td>Ultra-0.5 离心过滤装置</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677108</td><td>用于蛋白质富集的离心滤器；https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ALDRICH/Z677108?lang=de&amp;&region=AT&amp;amp;cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold5-2</td></tr><tr><td>草酰乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td>TCA代谢物</td></tr><tr><td>草酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71800</td><td>FAH 超家族酶的竞争性抑制剂</td></tr><tr><td>透析管 cellulose 膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9277</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d9277；或性能相当的产品</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R90101</td><td>一种可用来纯化含有多聚组氨酸（6xHis）序列的重组蛋白的镍离子亲和树脂</td></tr><tr><td>96孔紫外微孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>8404</td><td>紫外/可见光透明平底96孔板</td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白标准品，10 至 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26616?SID=srch-hj-26616</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC 系统</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>使用GE Healthcare的FPLC系统；存在多种定制版本；本研究采用的为 &quot;&amp;Auml;KTA 纯化&quot; 系统</td></tr><tr><td>HiTrap Phenyl HP 柱</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/it/shop/chromatography/prepacked-columns/hydrophobic-interaction/hitrap-phenyl-hp-p-05630</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/zh/cn/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-s-cation-exchange-chromatography-column-p-00723</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/zh/cn/shop/chromatography/prepacked-columns/ion-exchange/mono-q-anion-exchange-chromatography-column-p-00608</td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 75 pg 柱 (G75)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-75-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-05800</td></tr><tr><td>HiLoad Superdex 200 pg 柱 (G200)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>-</td><td>https://www.gelifesciences.com/en/ch/shop/chromatography/prepacked-columns/size-exclusion/hiload-superdex-200-pg-preparative-size-exclusion-chromatography-columns-p-06283</td></tr><tr><td>TECAN 酶标仪</td><td>帝肯生命科学</td><td>-</td><td>https://lifesciences.tecan.com/microplate-readers</td></tr><tr><td>乙酰丙酮</td><td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td><td>-</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>苯甲酰丙酮酸</td><td>MoleculeCrafting.HuGs e.U.</td><td>-</td><td>定制合成</td></tr><tr><td>VDX&amp;trade; 24孔板</td><td>哈姆顿</td><td>HR3-142</td><td>通过悬滴蒸汽扩散法用于结晶的24孔板</td></tr><tr><td>石蜡油</td><td>Hampton</td><td>HR3-411</td><td>通过悬滴气相扩散法用于结晶</td></tr><tr><td>盖玻片（22 mm）</td><td>Karl Hecht KG</td><td>14043</td><td>用于悬滴气相扩散法结晶的盖玻片</td></tr><tr><td>LB培养基（Luria broth）</td><td>自制</td><td>-</td><td>一种用于大肠杆菌的通用生长培养基：5 g/L 酵母提取物；10 g/L 酪蛋白胨；10 g/L 氯化钠；12 g/L 琼脂</td></tr><tr><td>NZCYM 培养基</td><td>自制</td><td>-</td><td>一种用于大肠杆菌扩增的更优生长培养基：10 g/L NZ胺；5 g/L NaCl；5 g/L 酵母提取物；1 g/L 酪蛋白氨基酸；2 g/L MgSO₄；调节pH至7.4</td></tr><tr><td>Luria肉汤（LB）琼脂糖平板</td><td>自制</td><td>-</td><td>含LB培养基和抗生素的高压灭菌琼脂平板，用于细菌生长筛选；https://www.addgene.org/protocols/pouring-lb-agar-plates/</td></tr><tr><td>Ni-NTA 洗脱缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.4；50–300 mM NaCl；10–200 mM 咪唑；范围：不同FAHD蛋白的最适值有所差异</td></tr><tr><td>Ni-NTA 洗脱缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.4；50–300 mM NaCl；200–500 mM 咪唑；范围：最适值因FAHD蛋白而异</td></tr><tr><td>HIC 上样缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>44 mM NaH2PO4；6 mM Na2HPO4；100 mM NaCl；20 mM DTT；调至pH 7</td></tr><tr><td>HIC 上样缓冲液 AS</td><td>自制</td><td>-</td><td>HIC 运行缓冲液（硫酸铵饱和）；调节至 pH 7：70 g 硫酸铵 + 90 mL 缓冲液，于冷室中搅拌过夜；调节至 pH 7.0</td></tr><tr><td>Mono S 低盐缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>44 mM NaH₂PO₄；6 mM Na₂HPO₄；10–300 mM NaCl；范围：最适值因FAHD蛋白而异</td></tr><tr><td>Mono S 高盐缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>44 mM NaH₂PO₄；6 mM Na₂HPO₄；1-2 M NaCl；范围：最适值因FAHD蛋白而异</td></tr><tr><td>Mono Q 低盐缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl；15 mM NaCl；调至pH 8.0</td></tr><tr><td>Mono Q 高盐缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl；1 M NaCl；10% 甘油；调至 pH 8.0</td></tr><tr><td>G75 / G200 运行缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>15 mM Tris-HCl；300 mM NaCl；调至pH 7.4</td></tr><tr><td>酶活性测定缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>50 mM Tris-HCl pH 7.4；100 mM KCl；1 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>蛋白结晶缓冲液</td><td>自制</td><td>-</td><td>含1 mM DTT的G75 / G200运行缓冲液</td></tr><tr><td>用于结晶的储液溶液</td><td>自制</td><td>-</td><td>100 mM Na-HEPES pH 7.5；5–20 %（w/v）PEG4k；10 mM–200 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr></tbody></table>

富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白的表达、纯化、结晶及酶活性检测

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

富马酰乙酰乙酸水解酶（FAH）结构域蛋白（FAHD）是真核生物中FAH超家族的已鉴定成员。该超家族的酶通常具有多功能性，主要涉及水解酶和脱羧酶的作用机制。本文介绍了一系列连续的方法，用于表达和纯化FAHD蛋白，主要是不同物种（人类、小鼠、线虫、植物等）中的FAHD蛋白1（FAHD1）同源物。所涵盖的方法包括大肠杆菌（E. coli）中的蛋白表达、亲和层析、离子交换层析、制备型与分析型凝胶过滤、结晶、X射线衍射以及分光光度测定。高纯度（&#62;98%）的浓缩蛋白可用于结晶或抗体生产。质量相似或较低的蛋白可用于酶活性测定，或作为抗原用于检测系统（如Western印迹、ELISA）。在本文的讨论部分，概述了FAHD1已鉴定的酶学机制，以更详细地描述其兼具水解酶与脱羧酶的双功能特性。

从已制备好的克隆载体和购买的BL21(DE3) pLysS E. coli出发，通过热激或任何其他合适的方法将质粒导入细菌（图1）。经过短暂扩增后，将转化后的细菌涂布于LB琼脂平板上，过夜培养。此时平板的外观可能因多种潜在误差来源而有所不同，可能无菌落生长（即无菌落）、细菌完全过度生长，或介于两者之间。在图7A中展示了转化效果理想与非理想情况下LB琼脂平板的两个示例。菌落过多通常表明涂板的细菌量过多（较可能），或所用抗生素可能已失效（较不可能）。菌落过少则可能表明转化时使用的质粒量不足（下次应增加用量），或用于筛选细菌的抗生素浓度过高。无论如何，只要出现菌落，通常即为有效转化，因为使用两种选择性抗生素意味着未转化的细菌生长的概率极低。若完全无菌落生长，则可能原因包括：细菌丧失了转化能力（如因储存不当、长期储存、反复冻融等）、热激失败（质粒未成功导入或因温度过高导致细菌死亡）、克隆载体损坏，或误用了错误的选择性抗生素（请核实质粒载体上的抗性基因）。
<img alt="Bacterial growth on agar plates; SDS-PAGE protein analysis; Experimental gel electrophoresis results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="Figure 7"> 
图7细菌转化与IMAC的代表性结果。 
（A） 转化BL21(DE3)菌株的典型LB琼脂平板 E. coli，按照步骤1.1操作获得。左图：菌落分布良好的平板（阳性示例）。右图：仅有一个单菌落的平板（阴性示例）。白色圆圈标记了形态良好的菌落。红色圆圈标记了相互距离过近的菌落，只要存在孤立菌落，就不应挑选这些菌落。 （B） 一系列诱导对照的12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析（“-”表示IPTG诱导前；“+”表示IPTG诱导后、收集菌体前），已调整至总蛋白量相等。此步骤详见1.2步。 (C) Ni-NTA 纯化过程的典型 12.5% 丙烯酰胺 SDS-PAGE 分析 他的标记的FAHD1蛋白。这在方案的第3节中有描述。亲和层析获得的蛋白纯度很高（&gt;70%（黑色箭头），但也观察到一些微小的污染条带（红色箭头）。这些污染来源于非FAHD蛋白与层析柱的结合，以及与FAHD蛋白结合的其他蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig07v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
筛选并挑取已验证的菌落。在营养培养基中扩增后，通过添加化学诱导剂 IPTG 触发蛋白表达。收集含有以毫克量级表达蛋白的细菌沉淀，并通过 SDS-PAGE 验证表达情况（例如参见图 7B）。尽管该过程总体简单，但仍可能出现一些问题。第一，某些蛋白会形成包涵体，因其似乎以某种方式干扰了宿主细菌的正常代谢。在人源 FAHD1 和 FAHD2 的某些点突变中已观察到此类现象。在此类情况下，可考虑改用其他表达系统（如昆虫细胞）进行表达，可能更为合适。例如，从昆虫细胞获得沉淀后，后续蛋白纯化步骤仍可按照本方案所述进行。第二，DE3-pET 系统有时会出现“渗漏表达”现象（即在加入 IPTG 诱导前，蛋白已发生一定程度的表达）。该现象的具体原因尚不明确，但可尝试在低温培养箱中过夜缓慢诱导表达，可能有助于改善。第三，无蛋白表达。这可能是最糟糕的情况，通常提示质粒载体可能已发生突变，建议对质粒进行测序以确认。
如果使用了His标签对蛋白质进行标记，则采用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析是一种简便且经济的捕获方法，可去除大部分杂质（图7C）。其他标签系统也有类似的方法（例如，STREP-II）。若未使用标签，则可通过硫酸铵沉淀联合连续的疏水交换层析，将目标蛋白与大多数其他蛋白质分离（图8A）。然而，通过比较两种方法（图7C 与 图8A），SDS-PAGE分析可证明Ni-NTA方法具有更优的纯化效果。因此，建议使用带His标签的蛋白质。
<img alt="使用色谱图和电泳结果进行蛋白质纯化过程；280 nm mAU分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2.jpg" data-altupdatedat="1762258740000" data-alt="图8"> 
图8：FPLC实验（HIC，离子交换、SEC）的代表性结果。 
(A) 在未标记FAHD1蛋白经硫酸铵（AS）沉淀后，进行HIC-苯基层析的典型色谱图及12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析，操作如方案第4节所述。绿色线条表示不含AS的B缓冲液梯度，在此过程中AS逐渐被洗脱出系统。将本图与图7C比较，可显示Ni-NTA亲和层析相较于HIC-苯基方法的优势，以及使用His-标签系统进行蛋白质纯化的优点。(B) 经Ni-NTA纯化后的His-标签FAHD蛋白进行阳离子交换层析的代表性色谱图及12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。通过盐梯度洗脱，上样样品被分离为不同的蛋白质组分。(C) 经阳离子交换层析后的His-标签FAHD蛋白进行G75分子筛排阻层析（SEC）的代表性色谱图及12.5%丙烯酰胺SDS-PAGE分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59729/59729fig08v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
随后，通过阳离子/阴离子交换色谱法（例如参见图8B）进一步将蛋白质与残留的杂质分离，再进行凝胶过滤色谱（例如参见图8C）。建议按此顺序建立初步纯化策略；然而，应组合使用这些层析柱，并依不同顺序依次调整，直至蛋白质达到足够的纯度。
为了对活性底物和/或辅因子进行“有或无”的判断，可使用经 Ni-NTA 纯化后的 His-标签蛋白，或经离子交换柱纯化后的无标签蛋白进行简单的活性测定。特异性活性和动力学常数的测定必须使用纯度最高的蛋白。可在离子交换柱纯化后的蛋白基础上尝试结晶，但晶体质量几乎总是与蛋白纯度相关。多克隆抗体可在纯化方案的任何阶段针对目标蛋白制备；然而，抗体质量同样与蛋白纯度密切相关。

本文描述了含延胡索酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白的表达与纯化方法，并以实例进行了说明（包括在E. coli中的表达及FPLC纯化）。纯化后的蛋白用于结晶及抗体生产，并应用于酶活性检测。文中展示了若干光度法检测方法，以体现FAHD1作为草酰乙酸脱羧酶和酰基丙酮酸水解酶的多功能性。

富马酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）结构域蛋白（FAHD）是真核生物中FAH超家族的已知成员。该家族的酶……

本方案描述了高效表达和纯化含FAH结构域蛋白的方法，同时也适用于一般蛋白的表达与纯化。FHD蛋白-1在三羧酸循环及线粒体能量代谢中发挥调控作用。我们已将FHD-1的下调与细胞衰老相关联，而要理解所观察表型背后的分子机制，通常需要获得有关酶活性和蛋白质结构的信息。通过IPTG诱导型载体系统表达蛋白的主要优势在于，所有方法在任何实验室中都相对便宜且易于建立。通过结合使用多聚组氨酸标签蛋白与镍NTA琼脂糖树脂，可在低成本下利用亲和层析的高度选择性。对于大多数用途而言，由此获得的蛋白质量通常已足够满足需求。另一方面，FPLC 是一种成熟且通用的方法，与其他方法相比具有多项优势。首先，将 5 到 10 纳克质粒加入到 100 微升处于冰上的 BL21-DE3 pLysS E.coli 感受态细菌中。轻轻敲击离心管以混匀内容物。将细菌置于冰上 30 分钟，每隔几分钟轻轻敲击试管。将恒温振荡器预热至 42 摄氏度。将含有细菌的试管放入仪器中，加热 90 秒。然后，立即将离心管置于冰上。冰浴5到10分钟后，加入600 µL NZCYM培养基，并将离心管放入细菌培养箱中。在37 °C下，以中等速度沿振荡方向摇动离心管1小时。孵育后，取200微升细菌培养物接种于含有相应选择性抗生素的10厘米LB琼脂平板上。将细菌在37摄氏度的细菌培养箱中于LB琼脂平板上过夜培养。成功形成菌落后，挑取单个菌落并将其分散于5毫升含选定抗生素的NZCYM培养基中。在37摄氏度的细菌培养箱中过夜培养。细菌成功生长后，根据蛋白质产量的需求，将细菌接种于250毫升、500毫升或1升的培养基中进行扩增。随后，在37摄氏度的细菌培养箱中继续培养细菌2至3小时。孵育后，取样进行光度分析。若600纳米处的光密度达到0.4，加入200微摩尔至1毫摩尔的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。在37摄氏度的细菌培养箱中继续孵育3至5小时后，蛋白质表达即告完成。通过在5,000 × g条件下离心5分钟收集细菌沉淀。然后弃去上清液，并将沉淀在-20 °C冷冻以进行短期保存。每250 mL原始细菌悬液，向细菌沉淀中加入5 mL选定的缓冲液。每5毫升缓冲液中加入10微升β-巯基乙醇。使用10毫升巴斯德吸管通过刮擦和吹打将沉淀物强制悬浮。将全部悬浮液转移至50毫升离心管中。然后超声处理该悬浮液。接着在4°C条件下高速离心30分钟。将上清液在冰上依次用滤器连续过滤。通过将空的塑料或玻璃层析柱固定在稳定的支架上，并用镍-NTA洗脱缓冲液冲洗，以准备层析柱。每10毫升蛋白悬液使用500微升镍-NTA琼脂糖凝胶浆液加入层析柱中。用镍-NTA洗脱缓冲液完全填充层析柱，注意避免扰动琼脂糖树脂，并依靠重力使缓冲液流过层析柱。接下来，将蛋白悬液上样至层析柱，依靠重力使样品流过柱体。待样品完全通过后，用镍柱NTA洗脱缓冲液充满层析柱。在柱子下方放置一个紫外透光的比色皿，收集一毫升镍柱NTA洗脱缓冲液。用空白样品作参比，检测样品在280纳米处的光密度。理想情况下，样品的光密度应大于2.5。由于FAHD蛋白和镍-NTA洗脱缓冲液在冻融过程中会沉淀，因此需将蛋白在冰上用不同的缓冲液透析过夜，每100毫升透析缓冲液中加入一微升DTT。安装FPLC系统，并用五倍柱体积的20%乙醇冲洗柱子，随后用五倍柱体积的水冲洗。平衡柱子后，将透析后的样品上样至柱子并收集穿流组分。设置梯度洗脱。梯度洗脱结束后，使用高盐缓冲液继续运行，直至在一个柱体积范围内不再检测到新的洗脱峰。启动微孔板读数仪，并在25摄氏度下平衡30分钟。在酶活性测定缓冲液中配制一毫升浓度为20毫摩尔的待测底物溶液。根据文本方案中的移液步骤，通过将90微升酶反应缓冲液与5微升酶溶液加入各孔，来制备酶空白孔和样品孔。然后通过向各孔中加入95微升酶反应缓冲液，来制备底物空白孔和样品孔。在开始测量前，立即向六个空白孔中各加入5微升酶反应缓冲液。向样品孔中加入5 µL的20 mM底物溶液。使用设定为50 µL的多通道移液器轻轻混匀各孔。然后将酶标板插入微孔板读数仪，于255 nm处测定每孔的吸光度。最后，在电子表格中进行分析。此处展示了转化效果最佳和非最佳情况下的两个LB琼脂平板示例。菌落过多表明可能接种了过多的细菌，或者抗生素可能已失效。细菌菌落数量过少可能表明转化时使用的质粒量不足，或用于筛选细菌的抗生素浓度过高。收集含有以毫克数量表达的蛋白质的细菌沉淀，并通过SDS-PAGE验证表达情况。在此看似简单的过程中可能会出现一些问题，包括蛋白质形成包涵体或蛋白质未能表达。如果使用 His 标签标记蛋白，利用镍-NTA 琼脂糖进行亲和层析是一种简便且经济的捕获方法，可去除大部分杂质。若未使用标签，则可通过硫酸铵沉淀结合连续的疏水相互作用层析，同样实现将目标蛋白与大多数其他蛋白分离。随后通过离子交换层析进一步去除残留杂质，再经凝胶过滤层析（分子筛层析）获得纯度足够的蛋白。所述方法均无特殊难度，但所有方法均需经过训练。初次尝试可能失败，但在进行一些额外调整后，实验终将成功。本文介绍的所有方法均为蛋白质纯化的通用方法。尽管这些方法针对FAHD蛋白进行了优化，但该方案也可根据需要调整用于纯化其他任何蛋白质。通过所述方法已成功获得重组人FAHD-1蛋白，其高分辨率X射线晶体结构极大地促进了我们对FAHD-1功能的理解，表明该蛋白同时具有脱羧酶和水解酶活性。本工作中所用细菌为安全菌株，无危害性。所有化学品均应遵循常规安全操作规范，FPLC 色谱柱须小心操作。

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