富玛莱酸氢酶含含蛋白质的表达、纯化、结晶和酶测定
June 20th, 2019
用实例描述了含紫酯水酶的表达和纯化(在大肠杆菌、FPLC中的表达)。纯化蛋白用于结晶和抗体生产,并用于酶测定。提出了选定的光度测定法,以显示FAHD1的多功能性,如牛酸脱碳酶和丙烯酰胺水酶。
我们的协议描述了有效表达和纯化FAH域的方法，这些方法含有蛋白质，但也含有一般蛋白质。FHD蛋白-1在TCA周期和线粒体的能量代谢中起着调节作用。我们能够将FHD-1下调节与细胞衰老关联，一般需要有关酶活性和蛋白质结构的信息，以便了解观察到的表型背后的分子机制。
通过IPTG可感染载体系统表达蛋白质的主要优点是，所有方法都相对便宜，而且易于在任何实验室中建立。通过将多组蛋白型蛋白质与镍NTA agarose树脂结合使用，可以低成本地利用亲和力色谱的巨大选择性。在大多数情况下，这种质量获得的蛋白质可能就足够了。
另一方面，FPLC 是一种成熟且通用的方法，与其他方法相比具有若干优点。首先，在冰上插入5至10纳米的质粒，放入100微升的可胜任的BL21-DE3 pLysS大肠杆菌中。稍微轻点管子，以混合内容物。
将细菌放在冰上30分钟，每隔几分钟轻轻敲击一次管子。将热摇床加热至 42 摄氏度。将装有细菌的管子放在仪器中加热90秒。
然后，立即将管子放在冰上。在冰上放置5至10分钟后，加入600微升的NZCYM介质，将管子放入细菌培养箱。以中等速度在 37 摄氏度的摇动方向上摇动管子一小时。
孵育后，在含有选择抗生素的10厘米LB加糖板上培养200微升的细菌。在37摄氏度的温度下培养细菌培养箱中LB阿加板上的细菌。成功形成菌落后，选择一个菌落，用选定的抗生素将它分散在NZCYM的五毫升中。
细菌孵化器中的培养在37摄氏度过夜。细菌生长成功后，根据蛋白质数量的需求，在250毫升、500毫升或1升批次的介质中扩增细菌。然后，培养细菌，在37摄氏度的细菌培养箱中繁殖两到三个小时。
孵育后，绘制一个样本进行光度分析。如果600纳米的光学密度达到0.4，则应用200微摩尔至1毫摩尔的异丙基-贝塔-D-thiogalactopyranosid。在37摄氏度的细菌培养箱中，三到五个小时后，蛋白质表达就耗尽了。
通过离心收集细菌颗粒，在5000次G下收获5分钟。然后，丢弃上一杯，将颗粒冷冻在零下20摄氏度，进行短暂储存。对于原始细菌悬浮液的每 250 毫升，将所选缓冲液的 5 毫升涂抹到细菌颗粒中。
每5毫升应用缓冲液中加入10微升β-甲醇。使用 10 毫升巴斯德移液器通过刮擦和移液机械地将颗粒强制悬浮。将所有悬浮液转移到 50 毫升管中。
然后对悬浮液进行声波化。接下来，在4摄氏度的高速下离心机30分钟。在冰上连续过滤上清液。
通过将空塑料或玻璃柱连接到稳定的固定器，并用镍 NTA 运行缓冲液进行清洗，准备空塑料或玻璃柱。对于每10毫升的蛋白质悬浮液，将500微升镍NTA阿加罗斯浆料涂抹到柱子上。用镍 NTA 运行缓冲液完全填充柱，确保不破坏加糖树脂，并允许缓冲液通过重力运行。
接下来，将蛋白质悬浮液应用到柱子上，让样品通过重力运行。样品通过后，用镍 NTA 运行缓冲区填充列。在柱子下面放置一个紫外线透明玻璃，并收集一毫升镍 NTA 洗脱缓冲液。
检查样品的光学密度为 280 纳米，与空白样品。以最佳方式，样品的光学密度大于 2.5。由于FAHD蛋白和镍NTA洗脱缓冲液在冷冻和解冻时会沉淀，因此每100毫升透析缓冲液使用一微升DTT在冰上对另一个缓冲液进行透析。
设置一个FPLC系统，用五列卷20%乙醇，然后五列水洗涤柱。平衡列后，将拨号样本应用于列并收集流。设置渐变洗脱。
渐变完成后，使用高盐缓冲器运行，直到在一列卷范围内不再检测到峰值。启动微板读卡器，在 25 摄氏度下平衡 30 分钟。准备一毫升20毫升基板溶液，在酶测定缓冲液中进行测试。
根据文本协议中的移液方案，用5微升酶溶液将90微升酶测定缓冲液移液到井中，制备酶空白和样品井。然后通过将95微升酶测定缓冲液移入井中制备基板空白和样品井。在测量之前，在六个空白井上应用五微升酶测定缓冲液。
将 20 毫摩尔基板溶液的五微升涂在样品井上。在 50 微升设置下使用多通道移液器轻轻混合油井。然后，将板插入微板读卡器，并在 255 纳米下测量每个井。
最后，在电子表格中执行分析。此处描述了两个示例 LB agar 板在最佳和非最佳变换之后。太多的细菌菌落表明，两种细菌被镀上，或者抗生素可能过期。
太少的细菌菌落可能表明，要么没有足够的质粒用于转化，要么使用太多的抗生素来选择细菌。含有以毫克为单位的表达蛋白的细菌颗粒被收获，并通过SDS页面验证表达。在这个本来简单的过程中，可能会出现一些问题，包括形成内含物体或未表达的蛋白质。
如果使用 His-tag 标记蛋白质，则使用镍 NTA agarose 的亲和力色谱是一种简单而廉价的捕获方法，可消除大多数污染。如果不使用标签，硫酸铵沉淀和连续疏水交换色谱的组合也可能将蛋白质与大多数其他蛋白质分离。蛋白质通过离子交换色谱进一步从残留的污染中分离，然后通过大小排除色谱获得足够纯的蛋白质。
描述的方法都不难。但所有方法都需要培训。第一次尝试可能会失败，但经过一些额外的调整后，实验将成功。
这里介绍的所有方法都是蛋白质纯化的一般方法。虽然该协议专门用于FAHD蛋白质，但可以适应任何人们希望净化的蛋白质。通过所述方法获得了重组人类FAHD-1，高分辨率X射线结构通过作为脱卡基酶和水解酶的功能，极大地促进了我们对FAHD-1的理解。
这项工作中使用的细菌是安全菌株，不危险。一般安全指南适用于所有化学品，应谨慎处理 FPLC 柱。
概述
本文描述了FAH结构域蛋白的表达和纯化，特别关注FAHD1。方法包括在大肠杆菌中表达和通过FPLC纯化，应用于结晶和酶活性测定。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 蛋白质工程
背景
- FAHD1在TCA循环和线粒体能量代谢中发挥调节作用。
- FHD-1的下调与细胞衰老相关。
- 了解酶活性和蛋白质结构对阐明分子机制至关重要。
- IPTG诱导的载体系统对蛋白质表达具有成本效益。
研究目的
- 提供FAH结构域蛋白高效表达和纯化的协议。
- 通过酶活性测定展示FAHD1的多功能性。
- 促进对细胞过程分子机制的进一步研究。
使用的方法
- 使用IPTG诱导在大肠杆菌中表达蛋白。
- 通过镍NTA亲和层析进行纯化。
- 使用FPLC进行进一步纯化和分析。
- 使用光度测定法评估酶活性。
主要结果
- 成功表达和纯化了FAHD1蛋白。
- 通过光度测定法证明了酶活性。
- 提供了关于FAHD1结构和功能特性的见解。
- 建立了可在各种实验室中轻松实施的协议。
结论
- 所概述的方法对研究FAH结构域蛋白有效。
- 了解FAHD1的作用可以为代谢调节提供见解。
- 这些协议可以帮助未来研究蛋白质功能和细胞机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
Expression and purification of FAH domain-containing proteins enable mechanistic studies of mitochondrial metabolism and cellular senescence pathways. High-purity protein production supports structural and functional characterization, informing target validation in metabolic disease research. The protocol provides a scalable, cost-effective approach for generating recombinant proteins applicable across discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of FAHD1's role in TCA cycle regulation and energy metabolism.
- Operational Value: Facilitates production of recombinant protein for functional assays and structural studies.
- Strategic Value: Supports hypothesis testing linking FAHD1 downregulation to cellular senescence phenotypes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified FAHD1 enables quantitative photometric assays to measure hydrolase and decarboxylase activity.
- Operational Value: Nickel NTA affinity chromatography provides reproducible capture of His-tagged proteins.
- Strategic Value: Enables enzyme activity readouts for compound screening and mechanism-of-action studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: High-resolution X-ray structures from purified protein inform structure-based drug design.
- Operational Value: Purification pipeline yields protein suitable for crystallization and antibody generation.
- Strategic Value: Supports translational continuity from biochemical mechanism to phenotypic validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, supporting target validation through biochemical and structural characterization.
- Discovery Biology: Enables functional testing of FAHD1 in metabolic pathways and senescence models.
- Screening: Produces assay-ready protein for photometric activity measurements.
- Analytics: Generates quantitative enzyme activity data via photometric assays at 255 nm.
- Translational Research: Provides structural insights linking FAHD1 function to mitochondrial metabolism.
- Enterprise Reuse: Purification protocol is adaptable to other recombinant proteins beyond FAHD1.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of FAHD1 as a dual-function hydrolase/decarboxylase target.
- Operational Value: Standardized purification yields >98% pure protein suitable for downstream applications.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying FAHD1's biochemical role in cellular phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metabolic targets based on mechanistic confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression in E. coli and FPLC operation.
- Dependent on access to nickel NTA resins, FPLC systems, and photometric plate readers.
- Necessitates standardization of IPTG induction, buffer conditions, and assay protocols across teams.
- Adaptation may be needed for non-His-tagged proteins using alternative purification strategies.
- Purification efficiency can be affected by protein solubility and inclusion body formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:12
Expression of FAHD Proteins in Competent E. coli
3:44
Lysis of Bacterial Pellets and Filtration of Debris
4:33
Purification of His-tagged FAHD Proteins using Ni-NTA Affinity Chromatography
5:59
Purification of FAHD Proteins via Ion Exchange Chromatography
6:35
Basic FAHD Activity Assays with Substrates Oxaloacetate and Acetylpyruvate
7:53
Results: Expression and Purification of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Proteins
9:19
Conclusion
