富马酰乙酰乙酸水解酶结构域蛋白的表达、纯化、结晶及酶活性检测

本方案描述了高效表达和纯化含FAH结构域蛋白的方法，同时也适用于一般蛋白的表达与纯化。FHD蛋白-1在三羧酸循环及线粒体能量代谢中发挥调控作用。我们已将FHD-1的下调与细胞衰老相关联，而要理解所观察表型背后的分子机制，通常需要获得有关酶活性和蛋白质结构的信息。

通过IPTG诱导型载体系统表达蛋白的主要优势在于，所有方法在任何实验室中都相对便宜且易于建立。通过结合使用多聚组氨酸标签蛋白与镍NTA琼脂糖树脂，可在低成本下利用亲和层析的高度选择性。对于大多数用途而言，由此获得的蛋白质量通常已足够满足需求。

另一方面，FPLC 是一种成熟且通用的方法，与其他方法相比具有多项优势。首先，将 5 到 10 纳克质粒加入到 100 微升处于冰上的 BL21-DE3 pLysS E.coli 感受态细菌中。轻轻敲击离心管以混匀内容物。

将细菌置于冰上 30 分钟，每隔几分钟轻轻敲击试管。将恒温振荡器预热至 42 摄氏度。将含有细菌的试管放入仪器中，加热 90 秒。

然后，立即将离心管置于冰上。冰浴5到10分钟后，加入600 µL NZCYM培养基，并将离心管放入细菌培养箱中。在37 °C下，以中等速度沿振荡方向摇动离心管1小时。

孵育后，取200微升细菌培养物接种于含有相应选择性抗生素的10厘米LB琼脂平板上。将细菌在37摄氏度的细菌培养箱中于LB琼脂平板上过夜培养。成功形成菌落后，挑取单个菌落并将其分散于5毫升含选定抗生素的NZCYM培养基中。

在37摄氏度的细菌培养箱中过夜培养。细菌成功生长后，根据蛋白质产量的需求，将细菌接种于250毫升、500毫升或1升的培养基中进行扩增。随后，在37摄氏度的细菌培养箱中继续培养细菌2至3小时。

孵育后，取样进行光度分析。若600纳米处的光密度达到0.4，加入200微摩尔至1毫摩尔的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。在37摄氏度的细菌培养箱中继续孵育3至5小时后，蛋白质表达即告完成。

通过在5,000 × g条件下离心5分钟收集细菌沉淀。然后弃去上清液，并将沉淀在-20 °C冷冻以进行短期保存。每250 mL原始细菌悬液，向细菌沉淀中加入5 mL选定的缓冲液。

每5毫升缓冲液中加入10微升β-巯基乙醇。使用10毫升巴斯德吸管通过刮擦和吹打将沉淀物强制悬浮。将全部悬浮液转移至50毫升离心管中。

然后超声处理该悬浮液。接着在4°C条件下高速离心30分钟。将上清液在冰上依次用滤器连续过滤。

通过将空的塑料或玻璃层析柱固定在稳定的支架上，并用镍-NTA洗脱缓冲液冲洗，以准备层析柱。每10毫升蛋白悬液使用500微升镍-NTA琼脂糖凝胶浆液加入层析柱中。用镍-NTA洗脱缓冲液完全填充层析柱，注意避免扰动琼脂糖树脂，并依靠重力使缓冲液流过层析柱。

接下来，将蛋白悬液上样至层析柱，依靠重力使样品流过柱体。待样品完全通过后，用镍柱NTA洗脱缓冲液充满层析柱。在柱子下方放置一个紫外透光的比色皿，收集一毫升镍柱NTA洗脱缓冲液。

用空白样品作参比，检测样品在280纳米处的光密度。理想情况下，样品的光密度应大于2.5。由于FAHD蛋白和镍-NTA洗脱缓冲液在冻融过程中会沉淀，因此需将蛋白在冰上用不同的缓冲液透析过夜，每100毫升透析缓冲液中加入一微升DTT。

安装FPLC系统，并用五倍柱体积的20%乙醇冲洗柱子，随后用五倍柱体积的水冲洗。平衡柱子后，将透析后的样品上样至柱子并收集穿流组分。设置梯度洗脱。

梯度洗脱结束后，使用高盐缓冲液继续运行，直至在一个柱体积范围内不再检测到新的洗脱峰。启动微孔板读数仪，并在25摄氏度下平衡30分钟。在酶活性测定缓冲液中配制一毫升浓度为20毫摩尔的待测底物溶液。

根据文本方案中的移液步骤，通过将90微升酶反应缓冲液与5微升酶溶液加入各孔，来制备酶空白孔和样品孔。然后通过向各孔中加入95微升酶反应缓冲液，来制备底物空白孔和样品孔。在开始测量前，立即向六个空白孔中各加入5微升酶反应缓冲液。

向样品孔中加入5 µL的20 mM底物溶液。使用设定为50 µL的多通道移液器轻轻混匀各孔。然后将酶标板插入微孔板读数仪，于255 nm处测定每孔的吸光度。

最后，在电子表格中进行分析。此处展示了转化效果最佳和非最佳情况下的两个LB琼脂平板示例。菌落过多表明可能接种了过多的细菌，或者抗生素可能已失效。

细菌菌落数量过少可能表明转化时使用的质粒量不足，或用于筛选细菌的抗生素浓度过高。收集含有以毫克数量表达的蛋白质的细菌沉淀，并通过SDS-PAGE验证表达情况。在此看似简单的过程中可能会出现一些问题，包括蛋白质形成包涵体或蛋白质未能表达。

如果使用 His 标签标记蛋白，利用镍-NTA 琼脂糖进行亲和层析是一种简便且经济的捕获方法，可去除大部分杂质。若未使用标签，则可通过硫酸铵沉淀结合连续的疏水相互作用层析，同样实现将目标蛋白与大多数其他蛋白分离。随后通过离子交换层析进一步去除残留杂质，再经凝胶过滤层析（分子筛层析）获得纯度足够的蛋白。

所述方法均无特殊难度，但所有方法均需经过训练。初次尝试可能失败，但在进行一些额外调整后，实验终将成功。

本文介绍的所有方法均为蛋白质纯化的通用方法。尽管这些方法针对FAHD蛋白进行了优化，但该方案也可根据需要调整用于纯化其他任何蛋白质。通过所述方法已成功获得重组人FAHD-1蛋白，其高分辨率X射线晶体结构极大地促进了我们对FAHD-1功能的理解，表明该蛋白同时具有脱羧酶和水解酶活性。

本工作中所用细菌为安全菌株，无危害性。所有化学品均应遵循常规安全操作规范，FPLC 色谱柱须小心操作。