利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用

研究蛋白质-蛋白质相互作用对于理解多个领域的生理过程至关重要。在本视频中，我们介绍一种膜上消化技术，该技术可使研究人员通过质谱法方便地对结合蛋白进行全面分析。该技术的主要优势在于，由于无需通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，因此可提高对粗免疫沉淀物进行蛋白质组学分析的通量。

开始将抗体与磁珠偶联，将抗GFP抗体与磁珠在500微升柠檬酸磷酸盐缓冲液中混合。室温下以50 RPM转速旋转混合物1小时。然后用含有1%吐温20的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤偶联后的磁珠3次。

根据文稿说明裂解转染后的细胞。刮取培养皿中的细胞，并将裂解液转移至1.5毫升离心管中。然后在15,000 × g离心5分钟以澄清裂解液，收集上清液。

通过用 500 微升柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤三次来制备未标记的磁珠。最后一次洗涤后，移除缓冲液，并向磁珠中加入细胞裂解液。将混合物在室温下以 50 转/分钟旋转 30 分钟。

在磁力架上进行磁分离，并收集细胞裂解液。为使目标蛋白与偶联免疫球蛋白的磁珠结合，将磁珠置于磁力架上静置5分钟。弃去柠檬酸盐缓冲液，将细胞裂解液加入磁珠中。

在50 RPM条件下旋转混合物一小时。为将目标蛋白与游离的非目标蛋白分离，用500微升含1%聚山梨酯20的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤后，加入30微升柠檬酸盐缓冲液，在室温下静置五分钟，以洗脱目标蛋白。

为制备膜，使用手术剪将PVDF膜切成3毫米×3毫米的片状，手术剪需在使用前立即清洁。将膜片置于铝箔上，每片加入2至5微升乙醇。在膜完全干燥之前，每片再加入2至5微升蛋白洗脱液，然后空气干燥，直至膜表面变为无光泽状。

然后将膜转移至1.5毫升离心管中，并在4°C下保存。若立即使用，加入2至30微升乙醇，使其变为亲水性。用移液器吸除乙醇，但在膜干燥之前，立即向每根离心管中完全加入200微升基于DTT的反应溶液，在56°C下孵育1小时。

孵育后，将反应液替换为300微升碘乙酰胺溶液，避光孵育45分钟。然后用蒸馏水涡旋洗涤膜两次，每次至少10秒，再用2%乙腈涡旋洗涤一次，每次至少10秒。操作与透明质酸相关的乙腈时可能极为危险。

进行膜上消化操作时，应始终佩戴口罩、护目镜和手套。根据手稿说明配制胰蛋白酶，并向每张膜中加入100微升胰蛋白酶反应溶液。在37摄氏度下孵育过夜，以完成消化。

第二天，将反应液转移至洁净的1.5毫升离心管中，并向膜中加入100微升洗涤液。在60摄氏度孵育膜2小时，然后收集洗涤液并与反应液混合。再向膜中加入100微升洗涤液，超声处理10分钟。

然后收集洗涤液，并将其与反应液混合。用一块实验室封口膜覆盖试管，并用针在膜上刺几个小孔。使用真空浓缩仪将溶液干燥，再将残留物溶解于10 µL的2%甲酸中。

将离心管在 12,000 × g 条件下离心 3 分钟，然后将上清液转移至样品管中。使用与纳米液相/高效液相色谱系统联用的质谱仪分析样品。通过该方案，在钙蛋白酶-6 相关的免疫沉淀物中鉴定出 17 种蛋白质，在 GFP 相关的免疫沉淀物中鉴定出 15 种蛋白质，其中有 11 种在两者中均被鉴定出。

需要注意的是，要对候选蛋白质进行阳性鉴定，至少需要检测到一个高保真肽段片段。在绿色荧光蛋白（GFP）表达裂解液中发生沉淀的蛋白质，以及组蛋白、外源性蛋白和核糖体蛋白，均已从列表中剔除。在膜上进行胰蛋白酶消化前，使用蒸馏水和2%乙腈清洗膜，是膜上蛋白质消化过程中最关键的步骤。

采用该方法后，可通过其他实验（如免疫共沉淀和蛋白质印迹分析）进一步验证目标蛋白的共沉淀。这种简单的方法使研究人员能够通过便捷且高灵敏度的分析手段探索新的蛋白质-蛋白质相互作用。