Name: 使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解膜内消化技术用于蛋白质相互作用研究的高效质谱样品制备方法。该技术无需聚丙烯酰胺凝胶电泳即可分析粗免疫沉淀物，显著提升蛋白质组学研究的通量与便捷性。

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本研究部分由日本科学促进会KAKENHI资助项目17K09869（资助AM）、日本科学促进会KAKENHI资助项目15K09418（资助TM）、金原一郎医学科学基金会研究基金以及铃木纪念基金会研究基金（以上均资助TM）支持。

1. 免疫沉淀
注意：我们采用了非十二烷基硫酸钠（SDS）裂解缓冲液和柠檬酸洗脱，具体方法如下文所述。然而，也可使用实验室自建的其他免疫沉淀技术来制备LC-MS/MS样品。
<ol>
	<li>用编码表位标签单独或融合蛋白的载体转染培养的细胞。为获得代表性数据，使用阳离子脂质体将 J774 细胞（1 × 106）转染编码绿色荧光蛋白（GFP）单独或 GFP 融合 Capn6（calpain-6 基因）的载体。</li>
	<li>将抗体偶联至磁珠。
	<ol>
		<li>为此，取抗 GFP 抗体（2 μL/反应）与磁珠（25 μL/反应）在 1.5 mL 离心管中加入 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液（24.5 mM 柠檬酸，51.7 mM 磷酸氢二钠；pH 5.0）混合。</li>
		<li>在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。然后用含 0.1% 聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤 IgG 偶联磁珠三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的裂解缓冲液裂解转染后的细胞。为获得代表性数据，在转染后 24 小时，于 1.5 mL 离心管中将转染细胞在冰上裂解 30 分钟，裂解液为 400 µL（含 50 mM Tris-HCl；pH 7.5，120 mM NaCl，0.5% 聚氧乙烯辛基苯基醚），并添加 40 μmol/L 苯甲基磺酰氟、50 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、50 μg/mL 抑肽酶、200 μmol/L 原钒酸钠和 1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）。</li>
	<li>将裂解液在 15,000 × g 离心 5 分钟以澄清，并收集上清液。</li>
	<li>预清除裂解液。在 1.5 mL 离心管中加入未标记的磁珠（25 μL/反应）。用 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤去除缓冲液后，将细胞裂解液加至磁珠上。使用旋转仪在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 30 分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上 5 分钟以实现磁分离，并收集细胞裂解液。建议使用制造商指定的磁力架。</li>
	<li>使目标蛋白与偶联磁珠结合。将免疫球蛋白 G（IgG）偶联磁珠置于磁力架上 5 分钟进行磁分离，弃去柠檬酸磷酸盐缓冲液，然后将细胞裂解液加入分离后的磁珠中。</li>
	<li>在室温下以 50 rpm 转速旋转混合物 1 小时。</li>
	<li>将目标蛋白与游离的非目标蛋白分离。用含 0.1% 聚氧乙烯（20）山梨醇单月桂酸酯的 500 µL 柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤后，加入 30 µL 柠檬酸缓冲液（pH 2–3），在室温下孵育 5 分钟以洗脱目标蛋白。 
	注：如果免疫沉淀回收率不足，使用其他表位标签（如 FLAG 或 HIS）可能提高效率。如果洗脱效率不足，使用其他洗脱液（如基于 SDS 的溶液）可能提高效率。</li>
</ol>
2. 蛋白质的膜上消化
注意：必须使用无蛋白的材料和设备，以避免外源性蛋白质污染。此外，建议操作人员佩戴外科口罩和手套，以防止人体蛋白质污染。
<ol>
	<li>使用手术剪将PVDF膜裁剪成3 mm × 3 mm的小片，手术剪在使用前需用甲醇擦拭并立即干燥。</li>
	<li>在洁净的铝箔上的PVDF膜小片上加入2–5 µL乙醇。</li>
	<li>在乙醇完全干燥前，将洗脱液（每份2–5 µL，每个样品4–6片）加至亲水性PVDF膜上，然后空气干燥至膜表面呈哑光状。干燥后的膜可于4 °C保存。</li>
	<li>将所有膜转移至1.5 mL塑料离心管中，加入20–30 µL乙醇使膜恢复亲水性，随后用移液器吸除乙醇。</li>
	<li>在膜完全干燥前，加入200 µL含二硫苏糖醇（DTT）的反应溶液（80 mM NH4HCO3、10 mM DTT和20%乙腈），于56 °C孵育1小时。</li>
	<li>将反应溶液更换为300 µL碘乙酰胺溶液（80 mM NH4HCO3、55 mM碘乙酰胺和20%乙腈），避光室温孵育45分钟。</li>
	<li>用1 mL蒸馏水涡旋振荡洗涤膜两次，再用1 mL 2%乙腈涡旋振荡洗涤一次，每次振荡时间超过&#62;10秒。</li>
	<li>将冻干的质谱级胰蛋白酶（材料表）直接溶解于反应溶液（含70%乙腈的30 mM NH4HCO3）中。向膜中加入含1 μg胰蛋白酶（材料表）的反应溶液100 µL（含70%乙腈的30 mM NH4HCO3），于37 °C过夜孵育。</li>
	<li>用移液器将含有胰蛋白酶消化产物的反应溶液转移至洁净的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>向膜中加入100 µL洗涤液（70%乙腈/1%三氟乙酸），于60 °C孵育2小时。收集洗涤液并与反应溶液混合。再向膜中加入100 μL洗涤液，超声处理10分钟，随后收集洗涤液并与反应溶液混合。</li>
	<li>用实验室封口膜覆盖离心管，并用针扎几个小孔。使用真空浓缩仪将溶液干燥。</li>
	<li>将残余物溶解于10 µL 0.2%甲酸中。离心（12,000 × g，室温3分钟）后，将上清液转移至样品管中。 
	注意：洗涤步骤是本部分的关键。在膜上蛋白质消化过程中，还原和烷基化后，使用蒸馏水对固定有蛋白质的膜进行洗涤，随后用2%乙腈洗涤，每次振荡超过10秒，对于去除试剂至关重要。</li>
</ol>
3. 液相色谱-电喷雾电离（ESI）-串联质谱分析
<ol>
	<li>启动与纳米液相色谱（nano-LC HPLC）系统（材料表）联用的电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）仪器（材料表），连接预柱（材料表）和分析柱（材料表）。</li>
	<li>在分析前，使用溶于0.2%甲酸中的牛血清白蛋白胰蛋白酶消化产物对质谱仪进行校准，以提供标准肽段。</li>
	<li>采用正离子模式对样品进行分析，质荷比（m/z）范围为400–1,250；随后在80分钟内以300 nL/min的流速，使用2%–80%乙腈和0.2%甲酸的线性梯度，采集最多10张二级质谱（MS/MS）图谱（每张100 ms），质荷比范围为100–1,600 m/z。</li>
	<li>使用蛋白质鉴定软件（材料表）分析输出数据，以鉴定候选相互作用蛋白。为实现候选蛋白的可靠鉴定，需至少检测到一个高保真度的肽段碎片（&#62; 95%保真度）。</li>
	<li>从候选蛋白列表中剔除在表达GFP的裂解液（仅转染表达GFP标签的空载体）中同样被沉淀的蛋白。 
	注意：如果数据库分析中鉴定出的蛋白质数量较少，可调整MS/MS采集条件（例如将每张图谱的采集时间从100 ms改为50 ms），以增加鉴定出的蛋白数量。</li>
</ol>

<ol><li>Thommen, M., Holtkamp, W., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-translational+protein+folding%3A+progress+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-translational protein folding: progress and methods.</a> Current Opinion in Structural Biology. 42, 83-89 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+protein+catabolism+in+atherosclerotic+vascular+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective protein catabolism in atherosclerotic vascular inflammation.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 79(2017).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+calpain+proteolytic+systems+underlies+degenerative+vascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Atherosclerosis+and+Thrombosis%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of calpain proteolytic systems underlies degenerative vascular disorders.</a> Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 25 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Steckelberg, A. L., Boehm, V., Gromadzka, A. M., Gehring, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CWC22+connects+pre-mRNA+splicing+and+exon+junction+complex+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CWC22 connects pre-mRNA splicing and exon junction complex assembly.</a> Cell Reports. 2 (3), 454-461 (2012).</li>
<li>Turriziani, B., von Kriegsheim, A., Pennington, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection via mass spectrometry-based proteomics.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 919, 383-396 (2016).</li>
<li>Obama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+modified+apolipoprotein+B-100+structures+formed+in+oxidized+low-density+lipoprotein+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of modified apolipoprotein B-100 structures formed in oxidized low-density lipoprotein using LC-MS/MS.</a> Proteomics. 7 (13), 2132-2141 (2007).</li>
<li>Matsudaira, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+from+picomole+quantities+of+proteins+electroblotted+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 262 (21), 10035-10038 (1987).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+N-terminal+sequencing+of+proteins+by+MALDI+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for N-terminal sequencing of proteins by MALDI mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 77 (2), 645-651 (2005).</li>
<li>Iwamatsu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-carboxymethylation+of+proteins+transferred+onto+polyvinylidene+difluoride+membranes+followed+by+in+situ+protease+digestion+and+amino+acid+microsequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">S-carboxymethylation of proteins transferred onto polyvinylidene difluoride membranes followed by in situ protease digestion and amino acid microsequencing.</a> Electrophoresis. 13 (3), 142-147 (1992).</li>
<li>Strader, M. B., Tabb, D. L., Hervey, W. J., Pan, C., Hurst, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+specific+trypsin+digestion+of+microgram+to+nanogram+quantities+of+proteins+in+organic-aqueous+solvent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient and specific trypsin digestion of microgram to nanogram quantities of proteins in organic-aqueous solvent systems.</a> Analytical Chemistry. 78 (1), 125-134 (2006).</li>
<li>Miyazaki, T., Miyazaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+calpain+proteolytic+systems+in+macrophage+cholesterol+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of calpain proteolytic systems in macrophage cholesterol handling.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (16), 3011-3021 (2017).</li>
<li>Miyazaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6+confers+atherogenicity+to+macrophages+by+dysregulating+pre-mRNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Calpain-6 confers atherogenicity to macrophages by dysregulating pre-mRNA splicing.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3417-3432 (2016).</li>
<li>Tonami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calpain-6%2C+a+microtubule-stabilizing+protein%2C+regulates+Rac1+activity+and+cell+motility+through+interaction+with+GEF-H1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Calpain-6, a microtubule-stabilizing protein, regulates Rac1 activity and cell motility through interaction with GEF-H1.</a> Journal of Cell Science. 124 (Pt 8), 1214-1223 (2011).</li>
<li>Rodnina, M. V., Wintermeyer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+elongation%2C+co-translational+folding+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein elongation, co-translational folding and targeting.</a> Journal of Molecular Biology. 428 (10 Pt B), 2165-2185 (2016).</li>
<li>Bunai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+acrylamide+gel+separated+proteins+immobilized+on+polyvinylidene+difluoride+membranes+following+proteolytic+digestion+in+the+presence+of+80%25+acetonitrile%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of acrylamide gel separated proteins immobilized on polyvinylidene difluoride membranes following proteolytic digestion in the presence of 80% acetonitrile.</a> Proteomics. 3 (9), 1738-1749 (2003).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们此前已描述了一种利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）结合膜上消化技术，对氧化型低密度脂蛋白中载脂蛋白B-100的氧化修饰进行分析的方法6。在本研究中，我们将该技术与免疫沉淀法相结合，鉴定出多种与钙蛋白酶-6（calpain-6）相关的蛋白质。这一新技术为筛选候选相互作用蛋白提供了一种便捷的方法。钙蛋白酶-6是钙蛋白酶蛋白水解家族中一种无蛋白水解活性的成员11，据报道称可通过蛋白质-蛋白质相互作用调节细胞功能12,13。我们此前曾利用不同的质谱配置，通过膜上消化技术鉴定了其他与钙蛋白酶-6相互作用的蛋白质12。因此，我们建议测试多种质谱条件，以最大化鉴定出的候选蛋白数量。出于相同原因，评估免疫沉淀条件（如表位标签类型、去垢剂和洗脱溶液的选择）对于获得最佳实验结果至关重要。
在本研究中，我们在钙蛋白酶-6和GFP相关...

尽管蛋白质在生物体中发挥着组成性作用，但它们在细胞内环境中持续地被合成、加工和降解。此外，细胞内蛋白质经常在物理和生化层面相互作用，从而影响一个或两个蛋白质的功能1,2,3。例如，剪接体相关蛋白同源物CWC22与真核翻译起始因子4A3（eIF4A3）的直接结合，对于外显子连接复合物的组装至关重要4。与此一致的是，缺乏与CWC22亲和力的eIF4A3突变体无法促进由外显子连接复合物驱动的mRNA剪接4。因此，研究蛋白质相互作用对于精确理解生理调控机制以及细胞功能至关重要。
质谱技术（MS）的最新进展已应用于蛋白质-蛋白质相互作用的全面分析。例如，通过共沉淀内源性蛋白质或外源引入的带标签蛋白质及其相互作用蛋白，随后进行质谱分析，能够鉴定出新的蛋白质相互作用5。然而，MS/MS分析的一个主要瓶颈是蛋白质样品经胰蛋白酶消化后的回收率较低。在对细胞裂解液进行蛋白质组学分析时，通常采用凝胶内消化或膜上消化技术来制备MS/MS样品。我们此前曾比较了凝胶内消化与膜上消化两种方法6，结果表明后者具有更高的序列覆盖度。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜可能特别适用于此目的，因其具有良好的机械强度，并能耐受高浓度的有机溶剂7,8，从而允许在含80%乙腈的条件下对固定化蛋白质进行酶解9。此外，蛋白质在膜上的固定可能诱导其构象变化，从而提高胰蛋白酶消化效率10。因此，本文描述了一种结合免疫沉淀、采用膜上消化技术进行LC/MS/MS分析蛋白质相互作用的方法。这一简单方法使得即使在非专业实验室中也能便捷地分析蛋白质-蛋白质相互作用。

<table><tbody><tr><td>乙腈</td><td>Wako</td><td>014-00386</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Wako</td><td>030-05525</td><td></td></tr><tr><td>DiNA</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>纳米流高效液相色谱系统</td></tr><tr><td>DiNa AI</td><td>KYA Tech Co.</td><td></td><td>配备自动进样器的纳米流高效液相色谱系统</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads protein G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Wako</td><td>066-00461</td><td></td></tr><tr><td>HiQ Sil C18W-3</td><td>KYA Tech Co.</td><td>E03-100-100</td><td>0.10 mm内径 × 100 mm长度</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Wako</td><td>095-02151</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. 单克隆抗体 (JL-8)</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Wako</td><td>018-21742</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Sigma</td><td>N6507</td><td>聚氧乙烯辛基苯基醚 (n=9)</td></tr><tr><td>肽标准品</td><td>KYA Tech Co.</td><td>tBSA-04</td><td>牛血清白蛋白的胰蛋白酶消化产物</td></tr><tr><td>PP 小瓶</td><td>KYA Tech Co.</td><td>03100S</td><td>塑料样品管</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8465</td><td></td></tr><tr><td>ProteinPilot 软件</td><td>Sciex</td><td>5034057</td><td>用于蛋白质鉴定的软件</td></tr><tr><td>测序级修饰胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>胰蛋白酶</td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠二水合物</td><td>Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Wako</td><td>206-10731</td><td></td></tr><tr><td>捕获柱</td><td>KYA Tech Co.</td><td>A03-05-001</td><td>0.5 mm内径 × 1 mm长度</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600 系统</td><td>Sciex</td><td>4466015</td><td>混合型四极杆-飞行时间串联质谱仪</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Wako</td><td>207-06275</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Wako</td><td>160-21211</td><td></td></tr></tbody></table>

利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

许多细胞内蛋白质会根据其细胞内和细胞外环境发生物理相互作用。事实上，细胞功能在很大程度上依赖于细胞内蛋白质-蛋白质相互作用。因此，针对这些相互作用的研究对于深入理解生理过程至关重要。通过共沉淀相关蛋白质并结合质谱（MS）分析，能够鉴定出新的蛋白质相互作用。本研究详细介绍了免疫沉淀-液相色谱（LC）-MS/MS分析联合膜上消化技术这一新方法，用于蛋白质-蛋白质相互作用的分析。该技术适用于粗制免疫沉淀物，可提高蛋白质组学分析的通量。首先使用特异性抗体沉淀带有标签的重组蛋白，随后将免疫沉淀物转移至聚偏二氟乙烯膜片上并进行还原烷基化处理。经胰蛋白酶消化后，利用LC-MS/MS分析消化产生的蛋白质片段。应用该技术，我们成功鉴定出多个候选的相互作用蛋白质。因此，该方法在新型蛋白质-蛋白质相互作用的表征中具有良好的便捷性和实用性。

通过上述方法，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对免疫沉淀物进行分析（图1）。在排除外源性蛋白（来自其他物种的蛋白及IgG）后，在钙蛋白酶-6（calpain-6）相关免疫沉淀物中鉴定出17种蛋白（表1），在GFP相关免疫沉淀物中鉴定出15种蛋白（表2）。在钙蛋白酶-6和GFP相关蛋白中，有11种蛋白在两种免疫沉淀物中均被鉴定出（图2）。在排除这些共有蛋白及钙蛋白酶-6自身后，剩余5种候选的钙蛋白酶-6相关蛋白：补体C1q亚组分亚基C、角蛋白II型细胞骨架8、IgE结合蛋白、ADP/ATP转位酶1以及泛素。
<img alt="蛋白质纯化示意图；IgG偶联磁珠的工作流程及LC-MS/MS分析步骤。" class="xfigimg" src="/files/f...

本文介绍一种用于质谱分析样品制备的膜上消化技术方案。该技术有助于便捷地分析蛋白质-蛋白质相互作用。

许多细胞内蛋白质会根据其细胞内和细胞外环境发生物理相互作用。事实上，细胞功能……

研究蛋白质-蛋白质相互作用对于理解多个领域的生理过程至关重要。在本视频中，我们介绍一种膜上消化技术，该技术可使研究人员通过质谱法方便地对结合蛋白进行全面分析。该技术的主要优势在于，由于无需通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，因此可提高对粗制免疫沉淀物进行蛋白质组学分析的通量。开始将抗体与磁珠偶联，将抗GFP抗体与磁珠在500微升柠檬酸磷酸盐缓冲液中混合。室温下以50 RPM转速旋转混合物1小时。然后用含有1%吐温20的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤偶联后的磁珠3次。根据论文中的说明裂解转染后的细胞。刮取培养皿中的细胞，并将裂解液转移至1.5毫升离心管中。然后在15,000 × g离心5分钟以澄清裂解液，并收集上清液。通过用500微升柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤三次来制备未标记的磁珠。最后一次洗涤后，移除缓冲液，并向磁珠中加入细胞裂解液。在室温下以50 RPM转速旋转混合物30分钟。在磁力架上进行磁分离，并收集细胞裂解液。为使目标蛋白与免疫球蛋白偶联的磁珠结合，将磁珠置于磁力架上静置5分钟。弃去柠檬酸盐缓冲液，将细胞裂解液加入磁珠中。在50 RPM转速下旋转混合物一小时。为将目标蛋白与游离的非目标蛋白分离，用500微升含1%聚山梨酯20的柠檬酸磷酸盐缓冲液洗涤磁珠三次。最后一次洗涤后，加入30微升柠檬酸缓冲液，在室温下静置五分钟，以洗脱目标蛋白。为制备膜，使用手术剪刀将PVDF膜切成3毫米×3毫米的片状，手术剪刀需在使用前立即清洁。将膜片置于铝箔上，每片加入2至5微升乙醇。在膜完全干燥之前，每片再加入2至5微升蛋白洗脱液，并风干至膜表面呈哑光状。然后将膜转移至1.5毫升离心管中，在4摄氏度下保存。如需立即使用，加入2至30微升乙醇，使其变为亲水性。用移液器吸除乙醇，但在膜干燥之前，立即向每根离心管中完全加入200微升基于DTT的反应溶液，并在56摄氏度下孵育1小时。孵育后，将反应液替换为300微升碘乙酰胺溶液，避光孵育45分钟。然后用蒸馏水涡旋洗涤膜两次，每次至少10秒，再用2%乙腈涡旋洗涤一次，每次至少10秒。操作与透明质酸相关的乙腈时可能极为危险。进行膜上消化操作时，应始终佩戴口罩、护目镜和手套。根据实验方案说明配制胰蛋白酶，并向每张膜中加入100 µL胰蛋白酶反应液。于37 °C孵育过夜以进行消化。第二天，将反应溶液转移至一个洁净的1.5毫升离心管中，并向膜中加入100微升洗涤液。在60摄氏度孵育膜2小时，然后收集洗涤液并与反应溶液混合。再次向膜中加入100微升洗涤液，并超声处理10分钟。然后收集洗涤液，并将其与反应液混合。用一块实验室封口膜覆盖试管，并用针在膜上刺几个小孔。使用真空浓缩仪将溶液干燥，再将残留物溶解于10 µL的2%甲酸溶液中。将离心管在 12,000 × g 条件下离心 3 分钟，然后将上清液转移至样品管中。使用与纳米液相/高效液相色谱系统联用的质谱仪分析样品。通过该方案，在钙蛋白酶-6 相关的免疫沉淀物中鉴定出 17 种蛋白质，在 GFP 相关的免疫沉淀物中鉴定出 15 种蛋白质，其中有 11 种在两者中均被鉴定出。需要注意的是，要对候选蛋白质进行阳性鉴定，至少需要检测到一个高保真度的肽段片段。在绿色荧光蛋白（GFP）表达裂解液中发生沉淀的蛋白质，以及组蛋白、外源性蛋白和核糖体蛋白，均已从列表中剔除。在膜上蛋白质进行胰蛋白酶消化前，使用蒸馏水和2%乙腈清洗膜，是膜上消化实验流程中最关键的步骤。采用该方法后，可通过其他实验（如免疫共沉淀和蛋白质印迹分析）进一步验证目标蛋白的共沉淀。这种简单的方法使研究人员能够通过便捷且高灵敏度的分析，探索新的蛋白质-蛋白质相互作用。

evaluation-proteinprotein-interactions-using-an-on-membrane-digestion

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用膜内消化技术评估蛋白质与蛋白质相互作用

本视频展示了利用微图案化表面进行蛋白质-蛋白质相互作用实验及后续分析的方法。该方法能够在活细胞中检测蛋白质相互作用，兼具高通量能力与获取定量信息的优势。...

体内检测微图案化表面的蛋白质-蛋白质相互作用

测试蛋白质-蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本文介绍了一种 体外...

蛋白质膜覆盖实验：检测可溶性与不溶性蛋白质相互作用的实验方案 体外

串联亲和纯化是一种用于鉴定蛋白质结合伴侣的可靠方法。作为概念验证，该方法已应用于研究较为深入的翻译起始因子...

使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

本视频展示了在PVDF膜上进行共免疫沉淀蛋白复合物以分析蛋白质-蛋白质相互作用。复合物中的还原蛋白经胰蛋白酶处理，将各个蛋白切割成较小的肽段，随后从PVDF膜中提取剩余的肽段。来自复合物中两种蛋白的捕获肽段经干燥后，重悬于低浓度甲酸溶液中，用于后续分析。...

膜上蛋白质消化法用于制备共免疫沉淀蛋白质以进行相互作用研究

本文描述了一种用于鉴定膜蛋白在体（in...

膜蛋白-SPINE：一种用于鉴定膜蛋白蛋白质相互作用的生化工具 体内

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

我们以分选受体sortilin与葡萄糖转运蛋白GLUT4的第一个腔内环之间的结合为例，介绍了一种利用去垢剂敏感性检测膜蛋白间相互作用的实验方案。...

膜蛋白间去垢剂敏感性相互作用的检测

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。...

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

本文介绍了一种利用化学探针和质谱技术从原代细胞和组织中捕获并鉴定疾病特异性蛋白质-蛋白质相互作用的实验方案。通过专用的基于网络的分析平台对获得的相互作用数据集进行分析，以揭示与疾病相关的动态网络功能障碍及通路改变。...

绘制疾病中功能失调的蛋白质-蛋白质相互作用图谱

了解膜内消化技术用于蛋白质相互作用研究的高效质谱样品制备方法。该技术无需聚丙烯酰胺凝胶电泳即可分析粗免疫沉淀物，显著提升蛋白质组学研究的通量与便捷性。

利用膜上消化技术评估蛋白质-蛋白质相互作用

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