DNA序列识别利用高通量原酶分析的DNAPrimase
October 8th, 2019
蛋白质结合微阵列（PBM）实验与生化测定相结合，将DNA原蛋白酶的结合和催化特性联系起来，DNA原蛋白酶是一种在模板DNA上合成RNA引体的酶。该方法被指定为高通量原发性酶分析（HTPP），可用于揭示各种酶的DNA结合模式。
该协议描述了从蛋白质-DNA结合微阵列中收集的海量数据，用于原始酶，这种酶暂时与特定的DNA序列结合，进而催化RNA底源的形成。本视频将介绍微阵列技术如何帮助重新定义原始序列识别站点，以及高吞吐量方法如何与经典生物化学称赞。该技术结合了两种方法:原始DNA结合微阵列和原始活性测定。
微阵列提供与DNA序列结合的大量原始数据，其中生化测定通过DNA原始提供RNA底源形成的信息。测试的酶活性取决于微阵列实验的洞察力及其较低的吞吐量。探讨结合效率、DNA序列选择与酶活性之间的联系。
使用微阵列识别序列确定性，使我们能够根据微阵列的海量数据得出准确的结论。到目前为止，这种方法已经用于描述转录因子的DNA结合序列。转录因子是与DNA紧密结合的静态蛋白质。
演示程序将是斯特凡·伊利奇。要开始此过程，请将微阵列幻灯片放入包含 0.01% Triton-X 100 的科普林罐中，以预先湿润。在实验室旋转器上旋转，增加 125 rpm，持续 5 分钟。
将阻塞溶液移入塑料盒中。然后从科普林罐中取下微阵列幻灯片。使用精细擦拭来驱动幻灯片的非 DNA 侧和边缘。
慢慢地将微阵列放入塑料盒中。在室温下孵育一小时，缓慢摇晃。在此之后，用 PBS 中的 0.01% Tween-20 洗一次幻灯片。
在实验室旋转器上，转速为 125 rpm，持续 5 分钟。取出 Tween-20，在实验室转速为 125 rpm 的实验室旋转器上用 0.01% Triton-X 100 在 PBS 中冲洗一次幻灯片，持续两分钟。然后快速将幻灯片转移到包含 PBS 的科普林罐中。
首先，按文本协议中概述的组装 PMB 腔室。将幻灯片放入指定空间。用钳子推下去，然后向左推。
将硅垫片放在顶部，确保其与 PBM 腔室的下部对齐。然后关闭腔室，对角线拧紧螺钉。将蛋白质结合的混合物移入垫片的每个井中。
然后，在室温下孵育30分钟。首先，将 PBS 中的移液器 0.05%Tween-20 放入 PBM 腔室，以短暂清洗幻灯片。使用真空吸气器，从腔室的孔中去除溶液，小心不要接触DNA斑点。
重复一遍，用 PBS 短暂清洗幻灯片。并使用真空从腔室的孔中去除溶液，同时小心不要接触DNA斑点。接下来，在PBM腔室的每个孔中加入Alexa 488结合的抗他抗体。
在室温下在黑暗中孵育30分钟。在此之后，通过在每个井中加入 PBS 中的几滴 0.05%Tween-20 来短暂清洗 PBM 腔室内的幻灯片。并使用真空吸气器从腔室的孔中去除溶液，小心不要接触DNA斑点。
拆解 PBM 腔室并拆下幻灯片。在 PBS 中 0.05%Tween-20 中冲洗幻灯片两次，每次冲洗持续三分钟。然后，在 PBS 中冲洗幻灯片两次，每次冲洗持续三分钟。
一次双蒸馏水三分钟。用压缩空气擦干滑梯。将它们存放在黑暗的幻灯片框中，直到准备扫描。
准备就绪后，使用微阵列扫描仪扫描芯片，其激发为 495 纳米，发射为 19 纳米。并收集中位荧光强度。本研究 pi 吞吐量原始分析用于映射原始绑定站点，包括那些使用经典工具（如果不是不可能）难以观察的站点。
重要的是，pi 吞吐量原始分析能够重新访问对原始绑定站点的传统理解。特别是 pi 吞吐量原始分析除了显示已知的 5'GTC3'识别序列外，还揭示了结合特性，这会导致 T7 DNA 原始源的功能活动发生变化。也就是说，标识两组序列。
在齿面中含有TG的强结合DNA序列和在齿面中含有AG的弱结合DNA序列。未检测到序列中缺少 5'GTC3'的 DNA 模板的原始结合。原始DNA识别位点包含特定特征，如TG丰富的侧翼，增加原始DNA结合高达10倍。
令人惊讶的是，它们也会增加新形成的RNA的长度。重要的是，高通量原始分析使我们能够观察和量化底转长度相对于DNA模板序列的变异性。执行此过程时，清洗步骤应很微妙。
缓冲区应包含记录DNA原始成分的组件。此外，徒劳结合事件的阈值也是生化决定的。因此，对微阵列的分析是不够的。
表面等离子体共振和凝胶移位测定等方法可以确定原始基因的结合亲和力，以选择DNA序列。我的实验室实现了机器学习预测模型，以检测原始序列决定因素，产生可由DNA聚合酶扩展的生产性底转器。在大数据时代，对大数据进行分析的统计方法的实现，必将有助于更好地描述特定的DNA序列，并将序列识别与原始序列的活动联系起来。
任何从事辐射工作的人应全面了解与使用电离辐射有关的法规和危害。应接受培训，并应与安全设备一起工作。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本协议描述了一种高通量方法，用于利用蛋白质-DNA结合微阵列分析DNA引物酶的结合和催化特性。该技术结合了微阵列技术与生化分析，以提供关于引物酶序列识别和RNA引物形成的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 分子生物学
- 遗传学
背景
- DNA引物酶在模板DNA上合成RNA引物。
- 了解引物酶的结合模式对于阐明其功能至关重要。
- 高通量方法可以增强传统的生化方法。
- 微阵列技术允许对蛋白质-DNA相互作用进行大规模数据收集。
研究目的
- 重新定义引物酶序列识别位点。
- 将结合效率与酶活性联系起来。
- 利用高通量分析进行全面分析。
使用的方法
- 蛋白质-DNA结合微阵列实验。
- 测量RNA引物形成的生化分析。
- 高通量引物酶分析（HTPP）方法。
- 数据分析以相关结合模式和酶活性。
主要结果
- 识别引物酶结合的特定DNA序列。
- 结合效率与RNA引物合成之间的相关性。
- 大规模数据收集增强了对引物酶功能的理解。
- 洞察DNA序列选择与酶活性之间的关系。
结论
- 高通量方法为酶行为提供了宝贵的见解。
- 将结合数据与催化活性联系起来对于理解引物酶至关重要。
- 这种方法可以应用于其他酶进行类似的分析。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
High-throughput primase profiling (HTPP) enables scalable characterization of DNA sequence recognition by primase, linking binding specificity to functional output in RNA primer synthesis. This approach supports target validation in nucleic acid enzymology by providing quantitative, reproducible data on enzyme-DNA interactions that inform mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by correlating binding strength with enzymatic processivity, aiding portfolio triage for replication-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by defining primase recognition sequences and flanking context effects on binding strength.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative correlation of binding efficiency with RNA primer length and enzyme processivity.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying sequence determinants that yield productive primers extendable by DNA polymerase.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by mapping primase binding sites across thousands of DNA sequences.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through microarray-based binding data and concurrent activity measurements.
- Scalability: Highlights screening readiness and platform reuse by combining PBM and primase activity assay in a scalable HTPP workflow.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance by linking primase sequence recognition to functional outcomes in Okazaki fragment formation.
- Preclinical Model Alignment: Describes continuity from discovery through preclinical validation by connecting DNA binding specificity to RNA primer synthesis activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Addresses mechanistic de-risking by using binding and activity data to inform go/no-go decisions in replication-targeted programs.
Pipeline & Workflow Integration
HTPP integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work by providing scalable, quantitative insights into primase-DNA interactions that inform enzymatic function.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking through massive data on primase binding to DNA sequences.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs by correlating microarray binding data with RNA primer formation measurements.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs that help teams compare binding strength across sequence variants and link to enzymatic activity.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating how sequence-specific binding influences functional primer synthesis in DNA replication.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique, enabling cross-project application in nucleic acid enzymology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in primase-DNA recognition.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding and activity measurements across diverse DNA sequences.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in replication-targeted drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative linking of binding efficiency to primer synthesis activity.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in protein-DNA interaction assays, microarray handling, and fluorescence detection.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microarray scanner, PBM chamber, and vacuum aspiration system.
- Cross-team standardization requirements for buffer composition, washing stringency, and fluorescence threshold setting.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for primases from different organisms or engineered variants.
- Practical limitations supported by source material: washing steps must be subtle to preserve binding signals, and buffers must contain components that maintain primase-DNA interaction during assay.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Primase DNA Binding Experiment: Blocking Procedure
2:44
Primase DNA Binding Experiment: Protein Binding
3:22
Primase DNA Binding Experiment: Fluorescent Antibody Attachment
5:15
Results: Analysis of High-Throughput Primase Profiling
6:42
Conclusion
