Name: DNA序列识别利用高通量原酶分析的DNAPrimase (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 了解高通量DNA引物酶分析技术，利用蛋白质-DNA结合微阵列技术重新定义引物酶序列识别位点，并关联结合效率与RNA引物合成活性。该方法为研究酶功能提供了大规模数据支持。

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本研究由以色列科学基金会（资助号：1023/18）资助。

1. 芯片设计
注意：DNA 探针代表定制的 36 核苷酸序列，其包含位于两个可变侧翼区域之间的 T7 DNA 引物酶识别位点（GTC），后接一段固定的 24 核苷酸序列，该序列连接于玻璃载片上3。我们采用 4 × 180,000 微阵列格式，可在载片上随机分布地每个 DNA 序列点样六次重复。
<ol>
	<li>已知识别序列的引物酶DNA文库设计
	<ol>
		<li>确保每条序列由60个核苷酸组成。前24个核苷酸保持恒定（用于连接至玻片）。可变区域应具有如下通用结构：(N)16GTC(N)17；其中N代表任意所需的核苷酸。</li>
		<li>设计侧翼区域以解决特定科学问题（后续文本中提供了设计示例）。侧翼区域可被设计为包含特定特征，例如重复元件或特定对称性。 
		注：我们创建了八类不同的侧翼序列，每类由两种或三种特定核苷酸组成：T和G（第1组）；T和C（第2组）；C和A（第3组）；A和G（第4组）；G、C和T（第5组）；C、T和A（第6组）；G、A和T（第7组）；G、A和C（第8组）。每组设计了2,000条不同的序列。每组包含具有不同类型和不同数量序列重复的子组。</li>
		<li>包含一组阴性对照序列（缺乏特异性结合位点）4。此类序列的存在可用于验证实验中特异性结合的发生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>未知识别序列的引物酶DNA文库设计
	<ol>
		<li>若识别序列未知，可通过从目标生物（如细菌、真菌等）的基因组中选择序列（可包含或不包含前述特定特征）来构建DNA文库。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微阵列玻片设计
	<ol>
		<li>从商业供应商处购买定制玻片（例如4x180K，AMADID #78366）（详见材料表）。每条序列订购六个重复，每个重复应随机连接至玻片上的不同位点。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 引物酶DNA结合实验
注意：在光生物调节治疗（PBM）前一天（或至少提前2小时）配制封闭液[磷酸盐缓冲液（PBS）中含2% w/v脱脂奶粉]，并在磁力搅拌器上搅拌。使用前，用0.45 µM滤膜过滤该溶液。为检测引物酶与DNA链的结合，需按以下顺序执行多个步骤。
<ol>
	<li>封闭步骤
	<ol>
		<li>将微阵列玻片放入科卜林罐中，用含0.01% v/v Triton X-100的PBS预润湿（在实验室旋转仪上125 rpm振荡5分钟）。</li>
		<li>用去离子水和乙醇短暂清洗垫片玻片（也称盖玻片），然后用压缩空气吹干。</li>
		<li>将钢制杂交室（PBM室）的底座部分与垫片玻片组装，垫片玻片面朝上（商品标签面朝上）。有关组装的更多细节，请参见材料表。</li>
		<li>将封闭液（含2% w/v脱脂奶粉的PBS）用移液器加入每个反应室中。</li>
		<li>从科卜林罐中取出微阵列玻片，用细纸巾擦干非DNA面（DNA应位于与公司标签相同的一面）及边缘。缓慢将微阵列玻片放置于垫片玻片上，避免产生气泡（公司标签面朝下）。立即组装并拧紧钢制杂交室装置，在室温（RT）下孵育1小时。</li>
		<li>在一个染色缸（“PBS”缸）中加入800 mL新鲜PBS。在第二个染色缸（“WASH”缸）中加入800 mL新配制的含0.5% v/v Tween-20的PBS。</li>
		<li>拧开PBM室，小心取下微阵列玻片-盖玻片“三明治”结构，注意不要破坏密封。在“WASH”缸中将镊子插入玻片与盖玻片之间，在水下拆解该结构。</li>
		<li>在水中轻轻晃动微阵列玻片，迅速转移至科卜林罐中。</li>
		<li>用含0.1% v/v Tween-20的PBS洗涤一次（在实验室旋转仪上125 rpm振荡5分钟）。</li>
		<li>用含0.01% v/v Triton X-100的PBS洗涤一次（在实验室旋转仪上125 rpm振荡2分钟）。</li>
		<li>迅速将玻片转移至盛有PBS的科卜林罐中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白结合
	<ol>
		<li>按照前述方法（步骤2.1.2–2.1.3）组装PBM室。</li>
		<li>将蛋白结合混合液（含5 µM T7 DNA引物酶、30 mM Tris-HCl pH 7.5、6.5 mM MgCl2、30 mM K-谷氨酸盐、6 mM二硫苏糖醇（DTT）、65 μM核糖核苷三磷酸（rNTP）、2% w/v脱脂奶粉、100 ng/μL牛血清白蛋白（BSA）、50 ng/μL鲑鱼精DNA以及0.02% v/v Triton X-100（TX-100））用移液器加入垫片玻片的每个反应室中（避免接触橡胶边缘，且不得引入气泡）。</li>
		<li>将微阵列玻片短暂浸入PBS缸中进行冲洗，以去除玻片表面多余的去垢剂。用细纸巾擦拭玻片的非DNA面。</li>
		<li>缓慢将微阵列玻片（面朝下）放置于垫片玻片上，注意防止液体从一个反应室泄漏至另一反应室。立即组装并拧紧PBM室装置，避免产生气泡。若出现气泡，可通过轻敲钢制杂交室于硬质表面的方式去除。</li>
		<li>在室温（RT）下孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光抗体结合
	<ol>
		<li>拧开PBM室，小心取下微阵列玻片-盖玻片“三明治”结构，注意不要破坏密封。在“WASH”缸中用镊子于水下拆解该结构。在水中晃动玻片，迅速转移至盛有PBS的科卜林罐中。</li>
		<li>按照前述方法（步骤2.1.2–2.1.3）将PBM室与垫片玻片重新组装。</li>
		<li>将Alexa 488标记的抗His抗体（10 ng/μL，溶于结合缓冲液）加入垫片玻片的反应室中。</li>
		<li>如前法将玻片短暂浸入PBS缸中进行冲洗，然后缓慢从PBS中取出，擦干非DNA面，并将其面朝下放置于垫片玻片上。</li>
		<li>在避光条件下室温（RT）孵育30分钟（因荧光探针对光敏感，需避光以减少光漂白）。</li>
		<li>按前述方法拆解PBM室与盖玻片，于“WASH”缸中水下移除盖玻片。</li>
		<li>将玻片短暂浸入PBS缸中进行冲洗，用压缩空气吹干。避光保存于玻片盒中，待扫描时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微阵列玻片扫描
	<ol>
		<li>使用微阵列扫描仪（参见材料表），设置激发波长为495 nm，发射波长为519 nm，扫描芯片并采集中位荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 芯片数据分析
注意：所有数据处理均使用 MATLAB 中编写的自定义脚本完成。
<ol>
	<li>使用 Wilcoxon 秩和检验 p 值进行初始 PBM 数据处理，方法如前所述4。</li>
	<li>对每条 DNA 序列，采用其结合强度的中位数值进行后续分析。</li>
	<li>接着，利用单因素方差分析（one-way ANOVA）的 p 值，比较不同组 DNA 探针所获得的引物酶-DNA 结合强度之间差异的统计学显著性，具体分组依据如上文 DNA 文库设计部分所述3。</li>
</ol>
4. T7 DNA 引物酶催化的模板指导RNA合成
<ol>
	<li>变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
	<ol>
		<li>制备 100 mL 凝胶混合液：将 62.5 mL 的 40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（19:1）、42 g 尿素、1.1 g Tris 碱（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇）、0.55 g 硼酸和 0.4 mL 的 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液混合均匀。</li>
		<li>将混合液分装为每份 14 mL（足够制备一块 16.5 cm × 26 cm × 0.03 cm 的凝胶），避光保存于 4 °C，可保存长达 1 个月。</li>
		<li>制备一块变性聚丙烯酰胺凝胶时，向 14 mL 上述预混液中加入 4 µL TEMED 和 40 µL 10% w/v 过硫酸铵，混匀后灌胶，室温下聚合至少 2 小时。凝胶可在 4 °C 保存 1 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备 
	注意：所有试剂、反应混合液和样品均需置于冰上操作。
	<ol>
		<li>为进行 10 个反应，配制反应混合液：将 11 µL 5× 活性缓冲液（200 mM Tris-HCl，pH = 7.5；50 mM 二硫苏糖醇，250 mM 谷氨酸钾，50 mM MgCl2）、5.5 µL 2.5 mM 核苷三磷酸（NTPs）混合液和 5.5 µL 放射性标记的核糖核苷酸（如 ATP，[α-32P]，3000 Ci/mmol）混合。 
		注意：所有体积已增加 10%，以补偿可能的移液误差。放射性标记的核糖核苷酸应根据放射信号强度进行稀释（初始稀释通常为 1:10 或更高）。</li>
		<li>将 2 µL 反应混合液分装至 10 个 PCR 管中。</li>
		<li>向各 PCR 管中加入 1 µL 100 µM 的 DNA 模板，并短暂离心。</li>
		<li>加入 2 µL 16 µM 的 T7 DNA 引物酶，短暂离心，轻轻混匀后再离心一次。</li>
		<li>在室温下孵育反应体系 20 分钟。</li>
		<li>加入 5 µL 终止液（95% 甲酰胺，20 mM EDTA，0.05% w/v 二甲苯青和溴酚蓝）终止反应，混匀后短暂离心。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 RNA 产物并进行后续信号检测
	<ol>
		<li>在 1× TBE 缓冲液（90 mM Tris-硼酸，2 mM EDTA）中对凝胶预电泳 1 小时（10 mA，600 V）。</li>
		<li>每样最多上样 2 µL，在 1× TBE 缓冲液（90 mM Tris-硼酸，2 mM EDTA）中进行电泳（20 mA，1100 V）。</li>
		<li>在 80 °C 真空干燥 2 小时。</li>
		<li>根据放射信号强度，将磷屏成像板暴露于放射性凝胶数小时至过夜。</li>
		<li>使用磷屏成像仪（见材料表）记录信号（光激发发光）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+binding+microarrays+%28PBMs%29+for+rapid%2C+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li>
<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li>
<li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li>
<li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationaly+Academy+of+Sciences+of+the+Unitet+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationaly+Academy+of+Sciences+of+the+Unitet+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li>
<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAse+footprinting%3A+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li>
<li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+%28real+time+kinetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788(1991).</li>
<li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li>
<li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides%3A+analysis+of+yeast+GCN4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li>
<li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

PBM 方法已广泛用于研究转录因子的结合特性，也可应用于与 DNA 亲和力较低的 DNA 加工酶（如 DNA 引物酶）。然而，需要对实验步骤进行某些修改。微阵列实验包含多个步骤：DNA 文库的设计、芯片的制备、靶蛋白的结合、荧光标记以及扫描。洗涤步骤需温和进行，因为使用含去污剂溶液的长时间洗涤会导致蛋白因结合较弱或瞬时性而从 DNA 模板上解离。其他关键步骤包括结合条件（如缓冲液组成、辅因子）和孵育时间，这些参数需针对每种特定酶进行优化。
微阵列实验获得的结果需要通过生化实验进行验证。生化实验还能揭示DNA加工酶的一些有趣特性，例如DNA结合亲和力与酶活性/持续性之间的相关性。高通量引物分析（HTPP）使我们能够观察DNA结合对T7 DNA引物酶功能特性的影响。例如，已有研究发现，如果引物酶对DNA模板具有更高的结合亲和力，则其催化的RNA引物长度更长（持续性增强）。
总体而言，本文介绍的方法快速、可靠，能够以假设驱动的方式，在单次实验中同时检测数万个不同DNA序列的结合特性。向反应体系中添加其他蛋白质或金属辅因子，可快速、高...

HTPP 利用 DNA 结合微阵列技术结合生化分析（图 1），可统计学识别影响 DNA 引物酶酶活性的 DNA 模板特定特征。因此，HTPP 提供了一个技术平台，有助于推动该领域的知识飞跃。用于确定引物酶识别位点的经典工具无法获得大量数据，而 HTPP 能够实现这一目标。
PBM 是一种常规用于确定转录因子与 DNA 结合偏好的技术1,2；然而，该方法不适用于检测蛋白质与 DNA 之间弱结合或瞬时结合。与提供所有可能八碱基对序列中蛋白质平均结合特异性的通用 PBM 不同，HTPP 基于包含独特序列元件的单链 DNA 模板文库。这些 DNA 序列元件包括数万个较短（数十个碱基对）的基因组序列，以及通过计算设计、富含基因组中特定重复 DNA 序列元件的 DNA 序列，这些序列具有不同的平均 GC 含量。这种高通量方法能够以系统性、定量且基于假设的方式，确定对引物酶结合及其酶活性重要的序列相关特性3。特别是，针对该酶系统，已发现引物酶-DNA 结合偏好性（受特定三核苷酸结合位点侧翼 DNA 序列调控）与引物酶持续合成能力之间存在重要关联4。
即使对于已被广泛研究的T7 DNA引物酶，该新技术也被应用于重新审视我们对引物酶识别位点的理解5。具体而言，利用蛋白质-DNA结合微阵列（PBM）重新检验一些经典概念，例如T7 DNA引物酶的DNA识别位点（这些位点在近四十年前被确定6），从而前所未有地揭示了这些识别位点侧翼序列特征的相关信息3。人们原本预期T7 DNA引物酶三核苷酸识别位点（5'-GTC-3'）的侧翼序列是随机的。然而，我们发现富含TG的侧翼序列会增加T7 DNA引物酶合成较长RNA引物的可能性，表明其持续合成能力有所提高。
可用于体外研究蛋白质DNA结合特性的其他方法包括电泳迁移率变动分析（EMSA）7、DNase I 足迹法8、表面等离子共振（SPR）9以及西南印迹法10。然而，这些方法通量较低，仅适用于分析少量DNA序列。此外，其中一些技术（例如EMSA）的精确度和灵敏度较低。另一方面，体外筛选11是一种与PBM类似的技术，可用于鉴定大量结合序列。但在大多数体外筛选应用中，低亲和力序列通常会被排除，因此该方法不适合获取所有可用序列的比较性结合数据。通用PBM1,2主要用于表征原核生物和真核生物转录因子的结合特异性，以及可能影响这种相互作用的特定因素（例如某些配体、辅因子等）12。
HTPP 将 PBM 技术的应用扩展到 DNA 处理酶领域，通过结合前所未有的高通量统计能力与高精度，提供有关结合序列背景的信息。由于前述其他现有技术的技术局限性，目前尚未获得引发酶及相关酶（这些酶与 DNA 的结合较弱或具有瞬时性）的此类数据。

<table><tbody><tr><td>40% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（19:1）溶液</td><td>Merck</td><td>1006401000</td><td></td></tr><tr><td>95% 甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 标记的抗 His 抗体</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&amp;alpha;-32P] &amp;ndash; 3000 Ci/mmol</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG003H250UC</td><td></td></tr><tr><td>硼酸，颗粒状</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GE4425</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>柯普林染色缸（Coplin jar）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-25G</td><td></td></tr><tr><td>DNA 微阵列</td><td>Agilent</td><td></td><td>4x180K (AMADID #78366)&lt;br/&gt; https://www.agilent.com</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Acros Organics</td><td>AC118430010</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5100 磷光成像仪</td><td>FUJIFILM Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片染色架</td><td>Thermo Scientific</td><td>12869995</td><td>若使用多个载片</td></tr><tr><td>实验室旋转摇床（Lab rotator）</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880025</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63064-500G</td><td></td></tr><tr><td>微阵列杂交室（Microarray Hybridization Chamber）</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td></tr><tr><td>微阵列扫描仪（GenePix 4400A）</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸钾</td><td>Alfa Aesar</td><td>A172232</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷酸溶液混合物（rNTPs）</td><td>New England BioLabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精 DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626-1G</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70166-500G</td><td></td></tr><tr><td>染色皿（Staining dish）</td><td>Thermo Scientific</td><td>12657696</td><td></td></tr><tr><td>四甲基乙二胺（TEMED）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱（2-氨基-2-(羟甲基)-1,3-丙二醇）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362-500G</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（Triton X-100）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20（Tween-20）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯青</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21530</td><td></td></tr></tbody></table>

利用高通量引物酶谱分析技术研究dna引物酶对dna序列的识别

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA引发酶合成短RNA引物，以启动DNA聚合酶在DNA复制过程中对滞后链上冈崎片段的DNA合成。原核生物DnaG样引发酶与DNA的结合发生在特定的三核苷酸识别序列处，这是冈崎片段形成的关键步骤。传统用于确定DNA引发酶DNA识别序列的生物化学工具所提供的信息十分有限。通过采用高通量微阵列结合的结合实验及后续一系列生物化学分析表明：1）特定的结合环境（识别位点侧翼序列）会影响DNA引发酶与其模板DNA的结合强度；2）引发酶与DNA结合越强，产生的RNA引物越长，表明该酶具有更高的持续合成能力。该方法结合了PBM与引发酶活性检测，被称为高通量引发酶谱型分析（HTPP），能够在前所未有的时间效率和可扩展性下实现对DNA引发酶特异性序列识别的表征。&#160;

这一用于绘制引物酶结合位点的技术进步，使得研究人员能够获得利用传统工具难以甚至无法观察到的DNA结合特性。更重要的是，HTPP技术促使人们重新审视对引物酶结合位点的传统认知。具体而言，HTPP揭示了除已知的5'-GTC-3'识别序列之外的结合特异性，从而导致T7 DNA引物酶功能活性的变化。即，研究鉴定了两类序列：一类是侧翼含有T/G的强结合DNA序列，另一类是侧翼含有A/G的弱结合序列（所有强结合模板中的胸腺嘧啶均被腺嘌呤取代）。未检测到引物酶与序列中缺乏5'-GTC-3'的DNA模板发生结合。 
含有特定特征（如富含T/G的侧翼序列）的引物酶DNA识别位点可使引物酶与DNA的结合能力提高达10倍，并且出人意料地还增加了新合成RNA引物的长度（最多达3倍）（见先前发表文章中的图23）。重要的是，高通量引物分析技术（HTPP）使我们能够观察并量化...

蛋白质结合微阵列（PBM）实验结合生化分析，可关联DNA引物酶（一种在模板DNA上合成RNA引物的酶）的结合特性与催化特性。该方法被称为高通量引物酶分析（HTPP），可用于揭示多种酶的DNA结合模式。

利用高通量引物酶谱分析技术研究DNA引物酶对DNA序列的识别

DNA引物酶在DNA复制过程中合成短RNA引物，以启动DNA聚合酶在滞后链上合成冈崎片段的DNA合成。

本方案描述了从引物酶（一种可短暂结合特定DNA序列并催化合成RNA引物的酶）的蛋白质-DNA结合微阵列中收集大量数据的方法。本视频将介绍微阵列技术如何帮助重新定义引物酶的序列识别位点，以及高通量方法如何补充经典生物化学研究。该技术结合了两种方法：引物酶DNA结合微阵列和引物酶活性检测。微阵列提供了大量关于引物酶与DNA序列结合的数据，而生化实验则提供了DNA引物酶合成RNA引物的信息。所检测的酶活性依赖于微阵列实验的结果，且该方法本身通量较低。本研究探讨了结合效率、DNA序列选择与酶活性之间的关联。利用微阵列技术鉴定序列决定因素，可基于微阵列的海量数据得出准确结论。该方法迄今已被用于描述转录因子的DNA结合序列。转录因子是能够紧密且稳定结合DNA的蛋白质。本实验步骤由Stefan Ilic示范。开始此操作前，将微阵列玻片放入含有0.01% Triton-X 100的考林瓶中进行预润湿，并在实验室旋转仪上以125 rpm转速旋转5分钟。将封闭液用移液器加入塑料盒中。然后从考普林罐中取出微阵列玻片。使用细纸巾擦拭玻片的非DNA面及边缘。将微阵列缓慢放入塑料盒中，在室温下缓慢振荡孵育1小时。随后用含0.01% Tween-20的PBS缓冲液洗涤玻片一次。在实验室旋转仪上以125 rpm转速孵育5分钟。移除Tween-20，并在实验室旋转仪上以125 rpm转速用含0.01% Triton-X 100的PBS冲洗载玻片一次，持续2分钟。随后迅速将载玻片转移至盛有PBS的考普林瓶中。首先，按照文本方案中的说明组装 PMB 室。将载玻片放入指定位置。使用镊子将其向下并向左推入。将硅胶垫圈置于上方，确保其与PBM室的下部良好对齐。然后关闭腔室，并沿对角线方向拧紧螺丝。用移液器将蛋白质结合混合物加入垫圈的每个孔中。然后，在室温下孵育30分钟。首先，用移液器将含0.05%吐温-20的PBS加入PBM反应室，短暂洗涤载玻片。使用真空吸液器小心地从反应室的孔中吸除溶液，注意不要触碰DNA点样区域。重复此步骤，用 PBS 短暂清洗玻片。小心使用真空装置从反应室的孔中吸除溶液，注意不要触碰 DNA 斑点。接着，向 PBM 反应室的每个孔中加入 Alexa 488 标记的抗 His 抗体。室温避光孵育30分钟。随后，在PBM反应槽内向每个孔中加入数滴含0.05% Tween-20的PBS溶液，轻轻洗涤载玻片。使用真空吸液器小心吸除反应槽各孔中的溶液，注意避免触碰DNA点样区域。拆卸 PBM 腔室并取出载玻片。用含 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液将载玻片冲洗两次，每次冲洗持续三分钟。随后用 PBS 溶液冲洗载玻片两次，每次冲洗持续三分钟。用双蒸水冲洗一次，每次三分钟。用压缩空气吹干载玻片，并将载玻片存放在避光的载玻片盒中，直至准备扫描。准备就绪后，使用微阵列扫描仪对芯片进行扫描，激发波长为495纳米，发射波长为19纳米，并采集中位荧光强度。本研究采用pi通量引物酶谱分析技术来绘制引物酶结合位点图谱，包括那些使用传统工具难以甚至无法观测到的位点。重要的是，pi通量引物酶分析技术使得研究者能够重新审视传统上对引物酶结合位点的理解。特别是，pi通量引物酶分析揭示了除已知的5'GTC3'识别序列之外的结合特异性，从而导致T7 DNA引物酶功能活性的改变。即，已鉴定出两组不同的序列。强结合的DNA序列在其侧翼含有TG，而弱结合的DNA序列在其侧翼含有AG。未检测到引物酶与序列中缺少5'GTC3'的DNA模板发生结合。引物酶的DNA识别位点具有特定特征，例如富含TG的侧翼序列，可使引物酶对DNA的结合能力提高达10倍。令人惊讶的是，它们还能增加新合成 RNA 的长度。重要的是，高通量引物酶分析使我们能够观察并量化引物长度的变异性，以及其与 DNA 模板序列之间的关系。进行该操作时，洗涤步骤应轻柔进行。此外，缓冲液应包含能够使引物酶结合到DNA上的组分。同时，通过生物化学方法确定无效结合事件的阈值。因此，仅对微阵列进行分析是不充分的。表面等离子共振和凝胶迁移实验等方法可用于测定引物酶与特定DNA序列结合的亲和力。本实验室采用机器学习预测模型，以识别能够产生可被DNA聚合酶有效延伸的引物的引物酶序列决定因素。在大数据时代，运用统计方法分析大规模数据集的技术将有助于更精确地表征特定DNA序列，并将序列识别与引物酶的活性关联起来。任何使用辐射的人员都应充分了解与电离辐射使用相关的法规和危害，应接受培训，并应使用安全设备进行操作。

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