利用高通量引物酶谱分析技术研究DNA引物酶对DNA序列的识别

本方案描述了从引物酶（一种可短暂结合特定DNA序列并催化合成RNA引物的酶）的蛋白质-DNA结合微阵列中收集大量数据的方法。本视频将介绍微阵列技术如何帮助重新定义引物酶的序列识别位点，以及高通量方法如何补充经典生物化学研究。该技术结合了两种方法：引物酶DNA结合微阵列和引物酶活性检测。

微阵列提供了大量关于引物酶与DNA序列结合的数据，而生化实验则提供了DNA引物酶合成RNA引物的信息。所检测的酶活性依赖于微阵列实验的结果，且该方法本身通量较低。本研究探讨了结合效率、DNA序列选择与酶活性之间的关联。

利用微阵列技术鉴定序列决定因素，可基于微阵列的海量数据得出准确结论。该方法迄今已被用于描述转录因子的DNA结合序列。转录因子是能够紧密且稳定结合DNA的蛋白质。

本实验步骤由Stefan Ilic示范。开始此操作前，将微阵列玻片放入含有0.01% Triton-X 100的考林瓶中进行预润湿，并在实验室旋转仪上以125 rpm转速旋转5分钟。

将封闭液用移液器加入塑料盒中。然后从考普林罐中取出微阵列玻片。使用细纸巾擦拭玻片的非DNA面及边缘。

将微阵列缓慢放入塑料盒中，在室温下缓慢振荡孵育1小时。随后用含0.01% Tween-20的PBS缓冲液洗涤玻片一次。

在实验室旋转仪上以125 rpm转速孵育5分钟。移除Tween-20，并在实验室旋转仪上以125 rpm转速用含0.01% Triton-X 100的PBS冲洗载玻片一次，持续2分钟。随后迅速将载玻片转移至盛有PBS的考普林瓶中。

首先，按照文本方案中的说明组装 PMB 室。将载玻片放入指定位置。使用镊子将其向下并向左推入。

将硅胶垫圈置于上方，确保其与PBM室的下部良好对齐。然后关闭腔室，并沿对角线方向拧紧螺丝。用移液器将蛋白质结合混合物加入垫圈的每个孔中。

然后，在室温下孵育30分钟。首先，用移液器将含0.05%吐温-20的PBS加入PBM反应室，短暂洗涤载玻片。使用真空吸液器小心地从反应室的孔中吸除溶液，注意不要触碰DNA点样区域。

重复此步骤，用 PBS 短暂清洗玻片。小心使用真空装置从反应室的孔中吸除溶液，注意不要触碰 DNA 斑点。接着，向 PBM 反应室的每个孔中加入 Alexa 488 标记的抗 His 抗体。

室温避光孵育30分钟。随后，在PBM反应槽内向每个孔中加入数滴含0.05% Tween-20的PBS溶液，轻轻洗涤载玻片。使用真空吸液器小心吸除反应槽各孔中的溶液，注意避免触碰DNA点样区域。

拆卸 PBM 腔室并取出载玻片。用含 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液将载玻片冲洗两次，每次冲洗持续三分钟。随后用 PBS 溶液冲洗载玻片两次，每次冲洗持续三分钟。

用双蒸水冲洗一次，每次三分钟。用压缩空气吹干载玻片，并将载玻片存放在避光的载玻片盒中，直至准备扫描。

准备就绪后，使用微阵列扫描仪对芯片进行扫描，激发波长为495纳米，发射波长为19纳米，并采集中位荧光强度。本研究采用pi通量引物酶谱分析技术来绘制引物酶结合位点图谱，包括那些使用传统工具难以甚至无法观测到的位点。

重要的是，pi通量引物酶分析技术使得研究者能够重新审视传统上对引物酶结合位点的理解。特别是，pi通量引物酶分析揭示了除已知的5'GTC3'识别序列之外的结合特异性，从而导致T7 DNA引物酶功能活性的改变。即，已鉴定出两组不同的序列。

强结合的DNA序列在其侧翼含有TG，而弱结合的DNA序列在其侧翼含有AG。未检测到引物酶与序列中缺少5'GTC3'的DNA模板发生结合。引物酶的DNA识别位点具有特定特征，例如富含TG的侧翼序列，可使引物酶对DNA的结合能力提高达10倍。

令人惊讶的是，它们还能增加新合成 RNA 的长度。重要的是，高通量引物酶分析使我们能够观察并量化引物长度的变异性，以及其与 DNA 模板序列之间的关系。进行该操作时，洗涤步骤应轻柔进行。

此外，缓冲液应包含能够使引物酶结合到DNA上的组分。同时，通过生物化学方法确定无效结合事件的阈值。因此，仅对微阵列进行分析是不充分的。

表面等离子共振和凝胶迁移实验等方法可用于测定引物酶与特定DNA序列结合的亲和力。本实验室采用机器学习预测模型，以识别能够产生可被DNA聚合酶有效延伸的引物的引物酶序列决定因素。在大数据时代，运用统计方法分析大规模数据集的技术将有助于更精确地表征特定DNA序列，并将序列识别与引物酶的活性关联起来。

任何使用辐射的人员都应充分了解与电离辐射使用相关的法规和危害，应接受培训，并应使用安全设备进行操作。