Name: 缺血再灌注损伤中转移性肝肿瘤的模样 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 s
Description: 了解利用C57BL/6小鼠建立结直肠癌肝转移模型并诱导肝脏缺血再灌注损伤的实验方法。该技术有助于研究手术应激对肿瘤生长和转移灶形成的影响机制。

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作者感谢 Sara Minemyer 和 Alexander Comerci 对语言的修改。

所有动物实验方案均经机构动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南。用于任何外科手术的器械均已彻底灭菌。
1. 初始准备
<ol>
	<li>在将癌细胞注入小鼠脾脏之前，对实验过程中使用的所有器械进行高压灭菌和消毒。</li>
	<li>对加热垫、外科手套、纱布、剪刀、小夹钳、血管扩张器、手术镊和持针器进行消毒和/或高压灭菌。</li>
	<li>准备术后镇痛药物（每千克体重0.1 mg的丁丙诺啡），在脾切除术后给予，并在之后每12小时给药一次，持续2天。</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>使用支原体ELISA检测试剂盒，确保癌细胞无支原体污染。</li>
	<li>在4 °C条件下配制500 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），用于培养小鼠结直肠癌细胞（MC38）。培养基中应添加10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、15 mM HEPES和200 mM L-谷氨酰胺。</li>
	<li>将癌细胞培养于无DNA酶和RNA酶的培养瓶（75 cm2）中。将细胞培养物置于含5% CO2的加湿细胞/组织培养箱中孵育，温度维持在37 °C。</li>
	<li>当增殖细胞达到90–100%融合度时，吸除旧培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，然后加入1×胰蛋白酶（0.25%）处理，使细胞从培养瓶上脱落。</li>
	<li>将细胞收集至15 mL锥形管中，在700 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，通过重复离心，用1× PBS洗涤两次。</li>
	<li>采用台盼蓝染色液（0.4%）染色，进一步确认细胞活力。</li>
	<li>将细胞重悬于1× PBS中，调整浓度至1 × 106 个细胞/100 µL。充分吹打混匀，避免形成团块。注射前将癌细胞置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 注射肿瘤细胞
<ol>
	<li>使用1 mL 25 G（0.5 mm × 16 mm）针头，通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg），对8–12周龄雄性（C57BL6）小鼠进行麻醉。</li>
	<li>使用电推剪剃除小鼠腹部皮肤的毛发，以避免术后感染。</li>
	<li>将小鼠置于磁性固定牵开系统上。通过轻捏脚趾或尾巴确认小鼠已完全处于麻醉状态。</li>
	<li>向眼睛滴加生理盐水，防止手术过程中角膜干燥。</li>
	<li>用7.5%聚维酮碘溶液擦拭已剃毛的腹壁，以在手术切口前对皮肤进行消毒。</li>
	<li>先用有齿镊提起皮肤，借助手术剪做正中切口；然后提起腹肌和腹膜，制作一条长约3 cm的正中切口（从中腹部至剑突），以暴露腹腔内容物。注意切口不应超过剑突，以防大出血。</li>
	<li>将止血钳置于切口两侧及剑突下方。通过向下牵拉并固定尾巴以扩展腹腔。使用6英寸无菌棉签轻轻分离胰腺脂肪组织，暴露脾脏。</li>
	<li>在向脾脏注射前，涡旋振荡癌细胞悬液，避免细胞团块形成。</li>
	<li>使用0.5 mL 28 G（0.36 mm × 13 mm）胰岛素注射器进行注射，避免产生气泡。</li>
	<li>缓慢而小心地将100 µL细胞悬液注射至脾脏尖端。注射后用棉签轻压穿刺点，防止液体反流至腹腔。成功注射可通过观察肝脏在注射过程中颜色的变化来判断。</li>
	<li>用1×PBS润湿无菌纱布，覆盖于暴露的手术区域。</li>
	<li>将小鼠转移至加热垫上保温15分钟，以促进癌细胞在体内的循环分布。</li>
	<li>如需继续进行手术性缺血-再灌注损伤操作，请参照步骤5.3–5.10。&#160; 
	注意：该操作旨在研究缺血-再灌注（I/R）诱导对转移灶形成的影响。</li>
</ol>
4.&#160;脾切除术
<ol>
	<li>进行脾切除术时，使用手持电凝设备。用光滑镊子小心提起脾脏，并电凝脾脏血管以避免大量出血。在电凝部位横断血管，移除脾脏。</li>
	<li>手术完成后，立即以双层缝合方式关闭切口，先缝合肌肉层，再缝合皮肤。腹壁和皮肤均使用4-0聚丙烯缝线。</li>
	<li>在另一只动物上重复手术前，需通过喷洒70%异丙醇或将其浸入玻璃珠灭菌器中，对所有器械进行消毒。</li>
	<li>将小鼠放回原笼，并观察其是否有痛苦或术后疼痛的迹象。</li>
	<li>为预防术后疼痛，每12小时注射一次术后镇痛药（丁丙诺啡 0.1 mg/kg），持续2天。</li>
</ol>
5. 缺血再灌注损伤
<ol>
	<li>在首次开腹手术后第5天，使用1 mL 25 G（0.5 mm × 16 mm）针头，通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（12 mg/kg）以进行麻醉。随后执行步骤3.3–3.4。</li>
	<li>用7.5%聚维酮碘溶液擦拭小鼠剃毛后的腹部皮肤以消毒，并按上述第3.6步所述进行腹正中切口开腹手术。</li>
	<li>使用两个湿润的棉签，轻轻将肠管移开腹腔以暴露相关结构，包括门静脉。解剖肝门区域，清除周围组织。</li>
	<li>将肝中叶和左外叶向上抬起，使其紧贴膈肌。在手术显微镜下使用弹簧剪解剖肝门区域，分离方叶与左外叶，以清晰暴露门管三联结构。</li>
	<li>在中叶与右外侧叶之间放置一小块湿润的棉拭子，以创造足够的空间用于夹闭。使用血管扩张钳，小心地将10 cm长的4.0聚丙烯缝合线穿过并提起肝门三联结构。利用带锁扣的显微血管夹钳夹闭装置，在肝门三联结构（肝动脉、门静脉和胆管）位于左叶和中叶侧的位置，夹闭所有结构。</li>
	<li>如果肺叶未出现明显苍白，应通过移除并重新施加夹钳进行调整。 
	注意：如果即使重新调整夹子后肝脏仍未立即出现苍白，应仔细考虑是否继续进行缺血/再灌注操作。</li>
	<li>移除置于中叶与右外侧叶之间的小棉签。轻柔地将肠管复位至腹腔内。用浸有1×PBS的湿纱布覆盖腹壁，并用塑料膜包裹，以尽量减少蒸发损失。</li>
	<li>将小鼠置于加热垫上，并施加夹具持续60分钟。</li>
	<li>在整个缺血期间，通过观察右侧中叶以及左侧中叶和侧叶的苍白变色来寻找缺血性损伤的证据。</li>
	<li>在60分钟结束后，通过移除夹子开始再灌注。 
	注意：可通过中叶和左外侧叶立即发生颜色变化来观察再灌注的证据。</li>
	<li>再灌注后立即使用双层缝合方式关闭切口，先缝合肌肉层，再缝合皮肤。使用4-0聚丙烯缝线，在持针器的辅助下缝合腹壁和皮肤。</li>
	<li>在对另一只动物重复该操作前，需通过将所有器械喷洒70%异丙醇或插入加热的玻璃珠灭菌器中，对其进行消毒。</li>
	<li>将小鼠放回原始笼具，观察其是否有痛苦和术后疼痛的迹象。</li>
	<li>术后每12小时注射一次镇痛剂（0.1 mg/kg 布托啡诺），持续2天，以避免术后疼痛。</li>
	<li>对于肝脏缺血/再灌注假手术小鼠，进行剖腹手术、肝门分离和腹部缝合。 
	注意： 手术应激在肝转移灶形成中作用的研究可通过两种不同的实验设计进行。上述方案（模型-1) 用于建立肝微转移病灶，并研究肝缺血/再灌注（I/R）对其生长的影响（图1A). 或者，可同时进行肝脏缺血-再灌注（I/R）和肿瘤细胞注射（Model-2) 以研究缺血/再灌注损伤对新转移灶形成的影响（图1B）。为此，按上述方法将癌细胞注入脾脏，使其循环15分钟。循环期结束后，进行60分钟的肝脏缺血/再灌注（I/R）或假手术。60分钟后施行脾脏侧部切除术，随后关闭腹腔切口。</li>
</ol>
6. 手术小鼠的评估
<ol>
	<li>手术过程中，通过进行眼睑和角膜反射测试，确保小鼠处于III期麻醉状态。一旦出现反射迹象，必须追加麻醉剂量。</li>
	<li>术后立即给予镇痛药物（布托啡诺 0.1 mg/kg），之后每12小时一次，持续2天，以避免术后疼痛。</li>
	<li>让小鼠有30–60分钟的麻醉恢复时间。持续监测小鼠状态，在完全恢复前不得无人看管。</li>
	<li>观察是否有痛苦迹象，如弓背、闭眼、行动迟缓以及不梳理毛发等。根据情况采取相应处理，直至小鼠恢复正常活动。</li>
	<li>术后应提供补充护理措施，包括补液、保温、用于赛拉嗪的逆转剂育亨宾、柔软的纸巾垫料（以防误吸），以促进恢复期的顺利进行。</li>
</ol>
7. 肝脏缺血再灌注损伤的评估
<ol>
	<li>夹闭后立即观察，确保中叶和左外叶出现苍白缺血表现，而尾状叶和方叶无此现象。</li>
	<li>通过检测血清丙氨酸转氨酶（sALT）、血清天冬氨酸转氨酶（sAST）和血清乳酸脱氢酶（sLDH）水平评估肝脏缺血损伤。可在再灌注开始后3–6小时经面静脉采血以获取血清。进行肝脏组织学检查，分析缺血叶内肿瘤区域所占百分比。</li>
</ol>

<ol><li>Riihimäki, M., Hemminki, A., Sundquist, J., Hemminki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+metastasis+in+colon+and+rectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patterns of metastasis in colon and rectal cancer.</a> Scientific Reports. 6 (1), 29765(2016).</li>
<li>Oki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+treatment+for+colorectal+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+gastroenterological+surgery%22%5BJournal%5D)">Recent advances in treatment for colorectal liver metastasis.</a> Annals of gastroenterological surgery. 2 (3), 167-175 (2018).</li>
<li>Wolpin, B. M., Mayer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+treatment+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Systemic treatment of colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 134 (5), 1296-1310 (2008).</li>
<li>van Golen, R. F., Reiniers, M. J., Olthof, P. B., van Gulik, T. M., Heger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation+in+hepatic+ischemia%2Freperfusion+injury%3A+present+concepts+and+potential+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation in hepatic ischemia/reperfusion injury: present concepts and potential therapeutics.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28 (3), 394-400 (2013).</li>
<li>Demicheli, R., Retsky, M. W., Hrushesky, W. J. M., Baum, M., Gukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+surgery+on+tumor+growth%3A+a+century+of+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">The effects of surgery on tumor growth: a century of investigations.</a> Annals of Oncology. 19 (11), 1821-1828 (2008).</li>
<li>Tohme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Extracellular+Traps+Promote+the+Development+and+Progression+of+Liver+Metastases+after+Surgical+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress.</a> Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (10), 484(2007).</li>
<li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Current Protocols in Cell Biology. 19 (19.2), (2001).</li>
<li>Thalheimer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model%3A+A+practical+animal+model+for+hepatic+metastases+and+tumor+cell+dissemination+in+human+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model: A practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer.</a> BMC Cancer. 9 (1), 29(2009).</li>
<li>Frampas, E., Maurel, C., Thedrez, P., Le Saëc, P. R. emaud-, Faivre-Chauvet, A., Barbet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraportal+injection+model+for+liver+metastasis%3A+Advantages+of+associated+bioluminescence+to+assess+tumor+growth+and+influences+on+tumor+uptake+of+radiolabeled+anti-carcinoembryonic+antigen+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+Communications%22%5BJournal%5D)">The intraportal injection model for liver metastasis: Advantages of associated bioluminescence to assess tumor growth and influences on tumor uptake of radiolabeled anti-carcinoembryonic antigen antibody.</a> Nuclear Medicine Communications. 32 (2), 147-154 (2011).</li>
<li>Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Portal+Vein+Injection+Model+to+Study+Liver+Metastasis+of+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Limani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+portal+vein+injection+for+the+design+of+syngeneic+models+of+liver+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 310 (9), G682-G688 (2016).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在相关利益冲突。

本文所述的动物模型基于两种主要方法。第一种方法是利用癌细胞在肝叶中定植和增殖的能力。第二种方法是研究肝缺血再灌注损伤对肿瘤生长和转移的影响。该模型可在免疫功能健全的小鼠体内特异性研究肝转移，且不出现其他继发性转移。该模型有助于探讨转移效率相关的问题，例如细胞存活、血管外渗及增殖等过程。
在第一种模型中，首先注射癌细胞，并允许形成微转移性疾病。随后，在5天后进行肝脏缺血-再灌注（I/R）。当研究手术对已形成的微转移性疾病的影响时，该模型具有重要意义。尽管过去十年中影像学技术已显著进步，但仍有可能存在影像学无法检测到的微转移病灶，在计划性肝切除术以达到治愈目的时可能被遗留下来。这些残留的微小病灶会受到伴随手术（特别是肝脏缺血-再灌注）所引起的炎症变化的影响，其生长呈指数级增加。另一方面，在第二种模型中，肝脏缺血-再灌注与肿瘤细胞注射同时进行。该模型侧重于研究肝脏缺血-再灌注对循环中癌细胞的影响以及新转移灶的形成过程。在肝手术过程中，对肿瘤的操作会导致肿瘤细胞进入血液循环。尽管大多数循环中的肿瘤细胞可被机体免疫监视系统清除，但仍有一部分细胞能够成功建立转移灶。第二种模型正是为了研究这一现...

肝脏是转移性疾病最常见的发生部位之一1。死亡几乎总是归因于肿瘤在肝脏内生长所引起的并发症。对于肝内转移性实体瘤患者，手术仍是控制疾病和实现潜在治愈的关键干预手段。然而，绝大多数患者最终会出现疾病复发，且主要发生在肝脏2,3。在肝切除手术过程中，术中出血较为常见，常需输血以及采用不同的止血技术，包括血管阻断方法。然而，这些措施会导致肝脏组织发生缺血/再灌注（I/R）损伤。I/R对肝细胞功能的不利影响已有充分报道。肝脏I/R损伤在血流恢复期间通过炎症通路触发炎症级联反应4。肝脏I/R损伤不仅可导致肝功能衰竭，现有证据还表明，I/R损伤会促进肿瘤细胞黏附，并增加转移灶形成以及已有微转移病灶生长的风险5。我们此前曾报道，手术应激可诱导免疫细胞活化，这不仅有助于原发肿瘤的生长，还可通过捕获循环中的癌细胞促进转移的发生6。
本文详细描述了一种建立肝转移小鼠肿瘤模型的技术。在该模型中，我们还介绍了一种诱导肝脏缺血再灌注损伤的方法，该损伤可作为临床上肝切除术期间手术应激的替代模型。通过结合肿瘤细胞注射与肝脏缺血/再灌注（I/R）的方法，能够成功模拟结直肠癌肝转移（CRLM）患者在原发肿瘤切除术后疾病进展的过程。

<table><tbody><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Lonza</td><td>900-108</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Fisher scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Fisher scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023701</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Hyclone</td><td>sh30042.02</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶 75 cm²</td><td>5 Cells Star</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯锥形管</td><td>BioExcell</td><td>41021037</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液</td><td>Giibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Fisherbrand</td><td>1376152</td><td></td></tr><tr><td>电凝器</td><td>Bovie</td><td>AA01</td><td></td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>Finescience tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>带锁微血管夹施加器</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18056-14</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-15021-15</td><td></td></tr><tr><td>血管扩张器</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-00276-13</td><td></td></tr><tr><td>磁性固定牵引系统</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-18200020</td><td></td></tr><tr><td>微型阿德森镊</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-11019-12</td><td></td></tr><tr><td>微型阿德森镊</td><td>Fine science toosl</td><td>FST-11018-12</td><td></td></tr><tr><td>4-0 聚丙烯缝合线</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8826</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Fisher scientific</td><td>1443915</td><td></td></tr><tr><td>动物毛发剪</td><td>Oster</td><td>559A</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Medline</td><td>MDS093945</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 25G 注射器</td><td>BD safety Glide</td><td>305903</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml 胰岛素注射器</td><td>BD insulin Syringes</td><td>32946</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica</td><td>LR92240</td><td></td></tr><tr><td>支原体ELISA检测试剂盒</td><td>Roche</td><td>11663925910</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Putney</td><td>#056344</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>NADA</td><td>#139-236</td><td></td></tr><tr><td>ALT试纸条</td><td>Heska</td><td>15809554</td><td></td></tr><tr><td>AST试纸条</td><td>Heska</td><td>15809542</td><td></td></tr><tr><td>LDH试纸条</td><td>Heska</td><td>15809607</td><td></td></tr></tbody></table>

缺血再灌注损伤背景下小鼠转移性肝肿瘤模型

Murine Model of Metastatic Liver Tumors in the Setting of Ischemia Reperfusion Injury

肝脏缺血再灌注（I/R）损伤是一种常见的临床难题，仍是一种不可避免的病理生理过程，已被证实可导致多组织和器官损伤。尽管近年来在治疗手段上有所进展，但总体发病率仍不理想，尤其是在伴有基础实质异常的患者中。在癌症侵袭性生长和转移的背景下，手术相关的I/R被认为可能是调控肿瘤复发的促进因素。本文旨在描述一种具有临床相关性的肝I/R及结直肠癌肝转移小鼠模型。通过该方法，我们希望协助其他研究者建立并完善此模型，用于常规科研工作，以更深入地理解肝I/R在促进肝转移中的作用。

所有野生型（C57BL6）小鼠（n = 20）均采用上述方案建立肝转移模型。所有注射小鼠，无论是否伴有缺血再灌注损伤，均存活至预定处死时间点。示意图图1A展示了注射肿瘤细胞后肝脏的结构，其中门脉三联结构（肝动脉、门静脉和胆管）被夹闭，从而导致肝脏中叶和左外侧叶发生部分（70%）缺血损伤。在缺血再灌注损伤后2-3周内，可观察到肝转移灶数量增加。注射MC38癌细胞的小鼠被随机分为假手术组和缺血/再灌注（I/R）组。如图1B所示，第一组小鼠在注射肿瘤细胞后15分钟接受脾切除术，并在注射后第5天实施肝脏缺血再灌注手术。该模型允许循环中的癌细胞（CCs）在器官内定植。图2A显示，手术应激显著增加了肝脏内已存在微转移灶的数量。第二组小鼠（图1C）在注射肿瘤细胞后15分钟即接受手术诱导的缺血再灌注处理，并在夹闭60分钟后移除微血管夹以启动再灌注。手术应激的同步作用（图2B<...

我们详细描述了一种具有临床相关性的结直肠癌肝转移（CRLM）肿瘤模型，以及肝脏缺血再灌注（I/R）对肿瘤生长和转移的影响。该模型有助于更好地理解手术促进肝转移性生长的潜在机制。

肝脏缺血再灌注（I/R）损伤是一种常见的临床难题，仍是一种不可避免的病理生理过程，已被证实可诱导……

实验和临床证据表明，肝脏缺血再灌注可促进循环肿瘤细胞形成转移灶，并加速肝内微转移病灶的生长。该可重复的小鼠模型可用于相关研究，以同时探讨转移灶的建立以及肝脏内已存在肿瘤的生长情况。肝脏手术、出血和感染性休克均与肝脏缺血再灌注相关，并可能影响转移性疾病的进展。这些技术可用于研究这一现象，旨在临床环境中更好地诊断和预防缺血再灌注对肿瘤生长的不利影响。在确认麻醉后的8至12周龄雄性C57 black 6小鼠对脚趾夹捏无反应后，使用聚维酮碘溶液擦拭消毒暴露的腹壁皮肤，并用有齿镊提起皮肤。使用手术刀在皮肤上做一条正中切口，提起腹肌和腹膜，以便制作一个3厘米长的正中切口，从而暴露腹腔内容物。在切口两侧及剑突下方放置止血钳后，向下牵拉并用胶带固定尾部以伸展腹部，使用六英寸无菌棉签将脾脏从胰腺脂肪组织中分离并暴露出来。接着，涡旋振荡目标癌细胞悬液以分散任何细胞团块，并将细胞加载至配备28号针头的0.5毫升胰岛素注射器中。缓慢而小心地向脾脏尖端注射100 µL细胞，同时将棉签置于针刺部位旁侧，以吸收可能进入腹腔的肿瘤溢出物，并在注射过程中施加轻柔压力以稳定脾脏。成功的注射将通过肝脏颜色的变化来判断。当所有细胞输送完成后，在手术区域覆盖一块浸有PBS的无菌纱布，并将小鼠置于加热垫上15分钟，以使癌细胞在体内循环。为诱导缺血再灌注损伤，使用两个湿润的棉签轻轻将肠道从腹腔移开，暴露门静脉，并将小鼠置于解剖显微镜下。 将中叶和左外侧肝叶向上提起，紧贴膈肌。将一小块湿润的棉签置于中叶与右外侧肝叶之间，以创造足够的空间用于夹闭；小心地将血管扩张钳从门三联结构后方穿过，并用该钳夹住一段10厘米长的4-0聚丙烯缝线，从门三联结构后方穿过并将其提起。使用带锁扣的微型齿状钳夹持器，将微型血管夹夹在左叶和肝脏中叶上，以阻断门三联结构中的所有组织。当观察到肠管变白后，移除4-0聚丙烯缝线和小棉签，并小心地将肠管还纳至腹腔内。用一块新的PBS浸湿的纱布覆盖腹壁，并在纱布上覆盖一层塑料薄膜以减少蒸发损失。随后将小鼠放回加热垫上，持续60分钟。在缺血期间，观察右侧内侧叶、左侧内侧叶及外侧叶出现的苍白变色，以确认缺血损伤的迹象。在损伤期结束时，移除血管夹。进行脾切除术时，用光滑镊子轻轻提起脾脏，并使用手持电凝设备凝固脾脏血管，以避免大量出血。在烧灼部位横断血管，切除脾脏，并立即使用4-0聚丙烯缝线以双层缝合方式关闭肌肉和皮肤切口。随后将小鼠放回其原有饲养笼中，密切监测直至完全恢复。手术应激显著增加肝脏内已存在微转移灶的数量。与非缺血再灌注小鼠相比，这种差异即使在缺血再灌注后两周仍可观察到。肝脏缺血再灌注和肿瘤细胞注射可能受到室温和细胞活力的影响，因此需注意控制这些变量。该技术有助于研究手术应激和肝损伤对转移性疾病生长的影响。这将帮助研究人员更好地理解手术诱导的肿瘤生长现象。

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癌症研究

缺血再灌注损伤中转移性肝肿瘤的模样

本文介绍了一种在小鼠中诱导原位生物发光肝肿瘤的方法，并通过活体全身发光成像对局限于肝脏的肿瘤生长进行后续分析。...

小鼠生物发光肝肿瘤模型

手术创伤会诱发炎症反应。已知细胞因子和内源性配体可调节缺血再灌注后的心肌梗死面积。本文介绍一种改良的闭胸小鼠缺血再灌注模型，通过悬挂重物的方式减少开胸手术的影响。...

一种小鼠闭胸式心肌缺血与再灌注模型

我们描述了中度和重度缺血-再灌注诱导的肾损伤小鼠模型，其中小鼠分别接受单侧肾蒂夹闭后同时或延迟对侧肾切除术。这些模型均能稳定地导致肾功能障碍和损伤后纤维化，但损伤严重程度和存活率取决于小鼠品系、年龄及手术器械。...

小鼠急性肾损伤的缺血-再灌注模型及损伤后纤维化

我们介绍一种外科手术方法，用于诱导实验性缺血/再灌注（I/R）损伤，以模拟小鼠模型中的心肌梗死（MI），该方法可更清晰地定位左前降支动脉（LAD）上的结扎位置，从而提高小鼠MI实验的可重复性。...

通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

通过半脾注射技术建立的肝转移瘤的临床前小鼠模型。...

一种肝转移的临床前小鼠模型

本文所述的肾脏缺血再灌注损伤小鼠模型包括右肾切除术以获取对照组织，以及夹闭左肾蒂以诱导缺血，从而导致急性肾损伤。该模型采用经腹正中切口，所有操作均通过单一手术切口完成。...

肾缺血再灌注损伤：一种小鼠损伤与再生模型

本文详细描述了小鼠肠道缺血-再灌注的实验操作步骤，该方法可产生可重复的损伤且不导致动物死亡，旨在促进该技术在研究领域内的标准化。此肠道缺血-再灌注损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞和分子机制。...

小鼠肠道缺血-再灌注损伤模型

通过门静脉注射将乳腺肿瘤细胞递送至小鼠肝脏的手术方法已建立。该模型可在完全免疫功能正常的宿主体内研究肝转移的晚期阶段，包括肿瘤细胞的外渗、定植、存活以及在肝脏内的转移性增殖。...

一种用于研究乳腺癌肝转移的门静脉注射模型

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。...

双血管阻断小鼠脑缺血-再灌注模型

该方案概述了一种可行、可靠且可重复的小鼠左肺门阻断方法，可用于研究小鼠模型中的肺缺血-再灌注损伤。...

小鼠左侧肺门阻断型肺缺血再灌注损伤模型

了解利用C57BL/6小鼠建立结直肠癌肝转移模型并诱导肝脏缺血再灌注损伤的实验方法。该技术有助于研究手术应激对肿瘤生长和转移灶形成的影响机制。

缺血再灌注损伤背景下小鼠转移性肝肿瘤模型

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