成年小鼠数字截肢和再生:研究哺乳动物暴发体形成和内膜性细胞化的简单模型

P3截肢是研究哺乳动物表观再生的临床前模型，也是识别关键细胞群和控制内源性再生机制的有力工具。P3模型允许识别早期和晚期的细胞群，研究再生期间的再血管化，以及研究无复杂骨稳定装置要求的膜内渗透。与我展示这个程序的将是奥萨马·库雷希、阿莉莎·法尔克和凯瑟琳·齐梅尔，技术员，以及来自我们实验室的研究助理教授雷吉娜·布鲁内尔。

在确认8至12周大的CD-1小鼠对手趾捏没有反应后，在动物的眼睛上涂抹软膏，将鼠标置于10X解剖显微镜下。使用手术波维酮碘和70%乙醇消毒每个后肢的数字，并使用微切口修剪头发远离手术现场。局部涂抹一个微升局部局部的布皮瓦卡因麻醉手术场地，并轻轻涂抹一只后爪以暴露中位数字表面。

然后拿着手术刀与脂肪垫平行的角度，使用无菌数字10手术刀截肢数字2和4的终端法兰克的端角。将局部的 bupivacaine 再涂抹一个微升，将鼠标返回到干净的笼子，使伤口愈合，无需伤口敷料和监控，直到完全卧位。为了确保P3截肢成功，在截肢过程中将手术刀与脂肪垫平行，并进行微CT扫描以确认正确的截肢长度。

在适当的实验终点，使用手术刀切断数字中途通过中间法兰克斯骨在大约第二腹脂肪垫缩进。将组织转移到含有10毫升新鲜缓冲锌的20毫升闪烁小瓶中，固定24至48小时。并使用微原子获取每个数字的四到五微米厚的部分，将切片放入 38 至 41 摄氏度的水浴中，并辅以组织胶粘剂溶液。

然后捕获胶粘剂幻灯片上的切片，将幻灯片放在 37 摄氏度的幻灯片加热器上晾干。当幻灯片脱去仿光后，将样品浸入适当抗原检索溶液的染色罐中，将幻灯片加热至 95 摄氏度 25 分钟，确保不发生沸腾。在孵化结束时，让罐子达到室温，将滑梯平放在一个一英寸深的塑料幻灯片盒中，底部铺有湿润的纸巾。

在每个样品中加入100微升预预热蛋白酶K。用一小块副膜盖住每张幻灯片，以确保部分不会变干。在 37 摄氏度下 12 分钟后，小心地取出石蜡膜，轻轻将幻灯片排在纸巾上，以去除多余的阻塞溶液。

接下来，在每张幻灯片上加入100至200微升的原抗体溶液。将场地返回到覆盖着石蜡膜的加湿室，在摄氏四度下进行过夜孵化。第二天早上，在TRIS缓冲盐水加TWEEN或TBST中清洗幻灯片后，用适当的二次抗体溶液为幻灯片贴上标签，在室温下进行45分钟的孵育，防止光线。

在孵育结束时，在TBST中清洗幻灯片，让它们干燥。然后使用 100 微升防褪色安装介质，小心地将盖玻片放在干燥的幻灯片上，并在室温下平整，防止光线，使安装介质干燥。对于连续体内微计算断层扫描或微CT安装带管的微CT成像器，使氧气能够流入和流出微CT动物室，确保流出的氧气配有活性炭过滤器，以捕获异氟。

将 Voxelsize 设置为 10.5 微米，在 55 峰值千伏和 145 微安，每 180 度投影 1，000 个，连续旋转，集成时间为 200 毫秒，每次扫描最多 213 片。当扫描仪准备就绪时，轻轻地将麻醉小鼠放在微型CT动物室中，后肢数字排列在扁平的、紧密的关联腹侧向上，左爪在左侧，右侧位于扫描平台的右侧。然后应用手术胶带轻轻地将数字固定到位。

在开始扫描之前，将眼科软膏涂抹在动物的眼睛上。扫描后，将动物返回到干净的笼子，并监控直至完全恢复，并允许长达几个小时的微CT图像重建。为了分析重建的3D骨骼图像，使用微CT提供的软件，将图像文件转换为一系列DICOM文件。

转换所有文件后，使用 Web 浏览器中的批处理文件下载器在单个文件夹中下载 DICOM 系列。将 BoneJ 插件加载到 ImageJ 插件文件夹中。将 DICOM 文件系列文件夹拖到 ImageJ 栏以打开文件。

将打开一个显示所有灰色值的 16 位图像堆栈。要仅显示骨骼，请单击"图像调整"和"阈值"。将上阈值栏滑到最右侧，并调整较低的阈值栏，直到只有骨骼高亮为红色。

在最大信号强度为32，767时，较低的阈值约为10，000至13，000。单击"应用"，并在新对话框中单击"黑色背景"。接下来，单击"确定"。将生成显示黑白值的八位图像。

与白色对应骨骼。在 P3 骨骼周围绘制一个矩形以选择它并复制堆栈。要生成 3D 图像，请单击插件和 3D 查看器，并使用徒手选择工具对要删除的骨骼进行圈出。

然后右键单击并选择"填充选择"以从图像中裁剪任何不必要的骨骼。要量化 3D 渲染的骨骼体积，请打开 BoneJ 插件并选择"体积分数"。将显示一个结果窗口，骨骼体积以毫米为单位显示。

要量化 3D 渲染的骨骼长度，请使用 ImageJ 多点工具。要捕获 3D 渲染的图像，请单击"查看"并拍摄快照。然后将图像另存为 TIF 或 JPEG 文件。

在这些图像中，成年小鼠再生P3数字的部分被免疫与抗体，以可视化在截肢后的第6天至7天、第9天和10天的米内骨再生和爆炸性形成。在这里，显示了截肢前扫描的数字的代表性微CT渲染，以及再生过程中不同时间点的尺寸测量，用于识别长度测量的地标。鼠标数字模型是一个强大的系统，用于分析一个支持再生的伤口环境，在深部截肢时触发爆炸形成。

相反，数字的近位截肢是研究再生失败的模型系统，也是测试增强再生策略的站点。