线粒体与内质网的光与体电子显微镜关联成像

这种体积电子显微镜技术用于需要观察三维结构的生物学研究。该技术提供样品杆、视野调节功能以及图像重拍前的样品存储功能。Fx2 Asan 设计了可催化去稳定化反应的路径步骤，以增强目标结构的电子检测信号，可用于定位特定的研究目标。

这些颗粒结合了相关光镜和三维电子显微镜技术，用于研究膜性细胞器与宿主细胞之间的相互作用。转染后16至24小时，用250微升30至37摄氏度的固定液轻轻洗涤培养物。迅速将洗涤液更换为1.5毫升新鲜固定液，并将培养物置于冰上固定30分钟。

孵育结束后，用一毫升冰冷的0.1摩尔卡考基late缓冲液洗涤细胞，每次洗涤10分钟，共洗涤三次。最后一次洗涤后，向培养皿中加入一毫升冰冷的0至4摄氏度的20毫摩尔甘氨酸溶液，在冰上孵育10分钟，随后用一毫升新鲜冰冷的0.1摩尔卡考基late缓冲液洗涤，每次5分钟，共洗涤三次。接着，用500微升 freshly prepared DAB溶液对细胞进行标记。

将细胞置于冰上孵育约5至45分钟。在倒置光学显微镜下观察到浅棕色染色时，用1毫升新鲜冰冷的0.1摩尔卡考基拉te缓冲液清洗细胞三次，每次清洗10分钟。然后，使用相差倒置显微镜在100倍或更高放大倍数下观察DAB染色，并标记玻璃底部感兴趣区域所在的位置。

用于透射电子显微镜块状样品制备时，首先在4°C条件下，用1毫升2%的还原四氧化锇固定细胞1小时。固定结束后，用新鲜蒸馏水清洗细胞，每次加入1毫升蒸馏水，每次清洗5分钟，共清洗三次。随后，用1毫升过滤后的TCH溶液处理细胞20分钟。

孵育结束后，用蒸馏水将细胞洗涤三次（方法如前所述），然后在2%还原的四氧化锇中固定30分钟。第二次固定结束后，用蒸馏水将细胞洗涤三次，并在避光条件下于4摄氏度用1毫升1%醋酸铀水溶液覆盖培养物过夜。次日早晨，用蒸馏水将细胞洗涤三次，然后在60摄氏度烘箱中用1毫升预热至60摄氏度的Walton铅天冬氨酸染色液染色30分钟。

孵育结束后，用蒸馏水洗涤细胞三次。然后将培养物在一系列20分钟的2毫升乙醇等分试样中依次孵育。最后一次暴露于100%乙醇后，在室温下用1毫升乙醇与低黏度包埋混合介质按3:1比例配制的溶液孵育细胞30分钟。

孵育结束后，将培养基更换为1毫升乙醇与低黏度包埋液混合液（体积比1:1），在室温下继续孵育30分钟。接着，将培养基更换为1毫升乙醇与低黏度包埋液混合液（体积比1:3），在室温下再孵育30分钟。随后，将培养基更换为1毫升100%低黏度包埋液，4℃过夜，然后将样品包埋于100%低黏度包埋液混合物中，在60 °C下孵育24小时。

进行透射电子显微镜分析时，次日使用超薄切片机获取厚度为90纳米的切片，并在200千伏电压下通过透射电子显微镜观察载网。在开始样品制备前，将镀有氧化铟锡的玻璃盖玻片置于异丙醇中轻轻振荡清洗30至60秒。振荡结束后，倒去多余酒精，并将盖玻片置于无尘环境中。

当盖玻片干燥后，使用等离子体镀膜仪对盖玻片进行辉光放电处理1分钟。然后将盖玻片插入载物台支架中，并将支架放入刀槽内。若需制备扫描电子显微镜样品，应将包埋好的样品块插入超薄切片机的样品支架中。

将样品台放入修块块中。使用剃须刀片切去目标位置周围多余的树脂，使块面呈梯形或矩形。前端边缘与后端边缘应严格相互平行。

获取大量连续切片并不容易。然而，你必须确保前端边缘和后端边缘完全平行。接下来，将样品 holder 插入超薄切片机的臂中。

将金刚石刀放入刀架中，并用过滤的蒸馏水填充刀槽。然后，小心推动刀架手柄以调整载样管的位置，使盖玻片的边缘靠近刀刃。获取样品后，停止切片过程，缓慢打开管夹紧螺钉并排空刀槽中的水。

当条带收集过程完成后，使用夹持装置的手柄取下基质并干燥条带。利用表达目的蛋白的基因标记质粒，可在对标记蛋白染色后鉴定转染的目标细胞。随后可采用相关光电子显微镜进一步观察标记的细胞培养物。

例如，SCO1-APEX2 产生的深色染色仅出现在线粒体膜间隙中，而不会出现在线粒体基质区域。共转染 SCO1-APEX2 和 HRP-KDEL 质粒的细胞，在线粒体膜间隙和内质网中均表现出高度密集的电子信号。然而，仅转染 SCO1-APEX2 的细胞中未观察到内质网染色。

通过扫描电子显微镜进行连续成像时，首先使用背散射电子探测器在大范围内创建整个阵列图像的概览。接着，将目标区域置于第一部分，并将其传播至所有其他部分。最后，对包含五个目标细胞的目标区域以5纳米的成像像素进行成像。

放大观察可揭示详细的亚细胞结构，如高尔基体、线粒体和内质网。连续成像清晰地显示，内质网与线粒体之间的接触发生在不同的z平面。您应充分掌握如何利用相关光镜与电镜技术定位特定目标结构，以研究特定身份修饰所产生的效应。

这些染色技术结合容积电子显微镜可用于大规模电镜研究，尤其用于探究神经病毒中的细胞相互作用。请注意，戊二醛、enteterocide 和 TCH 均具有高毒性，因此在使用这些试剂时务必穿戴防护服，并在通风橱中操作。