Name: 石墨烯支持的微井液体细胞制备,用于原位透射电子显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学习石墨烯支持微井液体细胞制备技术，用于原位透射电子显微镜观察金纳米晶体。该方法结合石墨烯与硅技术，实现纳米尺度动态过程的高分辨实时成像，并支持生长与刻蚀动力学的定量分析。

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感谢Tilo Schmutzler制备HAuCl4溶液。同时感谢R. Christian Martens对文稿的校对。本研究得到了德国研究基金会（DFG）通过研究培训组GRK 1896“原位电子、X射线和扫描探针显微技术”以及卓越集群EXC 315/2 EAM“先进材料工程”提供的经费支持，特此致谢。

1. 基于微孔的液体电池模板的制备
<ol>
	<li>从一片厚度为 175 µm、单晶、硼掺杂（1 – 30）Ωcm、直径 100 mm 的 (100) 硅片上去除有机残留物和天然氧化层。先使用 H2O2 和 TMAH 进行氧化处理，随后在 1 – 5% 的 HF 溶液中浸洗。</li>
	<li>在 800 °C 的干燥氧气气氛中对硅片进行热氧化，生长出厚度为 11 nm 的氧化层（图 2a）。使用 3% 的二氯乙烯（DCE）以结合金属污染物。</li>
	<li>通过低压化学气相沉积（LPCVD）沉积一层化学计量比的 Si3N4 层。Si3N4 层的厚度决定微孔深度。根据计划的实验选择合适的数值（例如 500 nm）（图 2b）。</li>
	<li>通过光刻和反应离子刻蚀（RIE）对正面进行图形化，以定义微孔的横向几何结构（图 2c）。合适的尺寸示例为半径 2.5 µm 的圆形结构，排列成六方阵列。应谨慎选择微孔间距（例如 5 µm），以避免结构不稳定。</li>
	<li>再通过 LPCVD 沉积 20 nm 厚的化学计量比 Si3N4 层，形成液体池的底部膜（图 2d）。遵循上述步骤所述的工艺（见步骤 1.3）。</li>
	<li>进行第二次光刻/RIE 工艺，对背面进行图形化，以定义液体池框架及其透射电镜（TEM）窗口的几何尺寸（图 2e）（框架直径：3 mm）。</li>
	<li>在 60 °C 的 20% KOH 溶液中进行体微加工，去除预定义区域的硅，形成自支撑的 Si3N4 膜（图 2f）。</li>
	<li>在最后的清洗步骤中，使用 10% 的 HCl 溶液和去离子水（DI）去除残留的金属离子。</li>
</ol>
2. 将石墨烯转移至透射电镜载网
<ol>
	<li>润湿放置市售少层（6–8层）CVD石墨烯（PMMA转移膜）的基底。将带有PMMA涂层的石墨烯浸入盛有去离子水的培养皿中（图3a）。 
	注：石墨烯的层数可通过可行的技术手段确定32,33。</li>
	<li>将石墨烯层转移至滤纸上，并裁剪成适合覆盖所有已制备微孔的尺寸（例如4 mm²）（图3b）。</li>
	<li>将裁剪后的石墨烯片重新浸入培养皿中（图3c）。</li>
	<li>使用带有微孔碳支撑膜的透射电镜（TEM）载网从去离子水中捞取石墨烯片。操作时，小心地将载网浸入水中，捕获漂浮在水面上的石墨烯。使用抗毛细作用镊子夹持载网（图3d,e）。 
	注：在整个操作过程中，需确保石墨烯-PMMA堆叠结构中的石墨烯面始终朝上。否则，后续去除PMMA时会导致石墨烯层被剥离。</li>
	<li>让石墨烯片自然干燥数小时。</li>
	<li>将样品在丙酮溶液中浸泡30分钟以去除PMMA保护层，随后依次在乙醇和去离子水中进行清洗，中间无需干燥样品。建议使用平底容器（例如培养皿），以便后续简化样品转移操作。</li>
	<li>最后在常温条件下干燥样品30分钟。</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>准备将样品掺入GSMLC。为此，将196.915 mg的HAuCl4·3H2O晶体溶解于0.5 L去离子水中，配制成1 mM的储备溶液。</li>
	<li>从储备溶液中取所需量的样品。此处使用0.5 µL。可使用注射器或Eppendorf移液器完成。</li>
</ol>
4. GSMLC 加载
<ol>
	<li>用丙酮和乙醇冲洗制备好的液体池模板。</li>
	<li>应用常温 O2/无内容/2 (20%/80%) 等离子处理5分钟，以增强膜的润湿性。</li>
	<li>在模板或石墨烯层上滴加0.5 µL样品溶液。操作过程应流畅，以尽量减少因蒸发引起的浓度变化。</li>
	<li>将透射电镜载网放置到微图案化的Si上3N4 将石墨烯面向模板的一层与模板贴合。将带有石墨烯的透射电镜载网轻轻压到模板上，注意不要破坏底部的Si3N4 膜</li>
	<li>用纸巾吸去多余溶液，以加速细胞干燥，从而减少浓度变化（图4a。大约 2 – 3 分钟后，石墨烯-Si3N4 范德华相互作用足以密封液体池（图4b）或者，不移除多余溶液，让细胞完全干燥。后者在细胞处理中的成功率更高，但使用此方法时，样本溶液因蒸发导致的浓度变化会更加显著。 
	注意：可通过边缘区域的对比度变化来验证干燥过程是否成功（比较 图4a，b).</li>
	<li>用镊子尖端在网格与GSMLC框架之间轻轻推动，小心地取出透射电镜网格。 
	注意：剧烈的动作可能会破坏底层膜。为减少剪切力造成的损伤，应从网格位置平行于较小窗口边缘处开始操作。</li>
	<li>通过光学显微镜检查 GSMLC 至少有一层膜仍保持完整图4c如果所有膜结构都被破坏，液相透射电子显微镜（LCTEM）将无法实现。</li>
</ol>
5. 透射电子显微镜成像与视频分析
<ol>
	<li>使用标准透射电子显微镜（TEM）载网，在样品制备完成后立即将其装载到（S）TEM中。 
	注意：与GLCs19类似，GSMLCs可能随时间推移而干燥。因此，应尽量缩短装载与成像之间的时间间隔。</li>
	<li>根据样品和显微镜类型，采用合适的成像技术对样品进行成像。此处使用加速电压为300 kV的（S）TEM设备。采用低电子剂量以最小化电子束引起的伪影，并使用短曝光时间以避免运动导致的图像模糊34。对于长时间实验，应遮挡电子束以减少辐射损伤。 
	注意：由于具有更高的时间分辨率，TEM在动力学分析中优于STEM34&#160;，且离子还原效应更小35。然而，由于STEM在较厚样品中具有更高的空间分辨率，因此在研究较厚液层和高原子序数（high-Z）元素时更推荐使用STEM34,35。</li>
	<li>图像分割方法
	<ol>
		<li>使用合适的图像处理平台提取感兴趣特征。对于颗粒追踪与分析，可使用开源的ImageJ发行版FIJI36。</li>
		<li>利用分析颗粒（Analyze Particles）功能获取每一帧中每个颗粒的精确信息（投影面积、质心）。 
		注意：该功能需要二值化图像。</li>
		<li>借助插件TrackMate37连接各帧之间的颗粒。默认情况下，TrackMate会搜索暗背景上的亮颗粒，因此在启动TrackMate前需对图像进行反相处理（如使用明场TEM成像时）。</li>
		<li>结合TrackMate和分析颗粒（Analyze Particles）的结果，使用基于Python的开源科学计算生态系统SciPy38,39编写适当脚本进行整合分析。</li>
		<li>使用FIJI提取更复杂结构（如枝晶）的精确轮廓。此处也可应用“分析颗粒”功能（见图6a插图）。 
		注意：手动分析感兴趣特征可能是可行的。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

与市面上可购买的液体池相比，定制的GSMLC具有可设计为适配 readily available TEM holders 的优势，且无需使用昂贵的专用液体池TEM holder。
本文展示的 GSMLC 结构结合了 SiLC 和 GLC 的特点，可能带来独特的优势。一方面，SiLC 可实现对细胞位置和形状的精确定位，但需要相对较厚的 Si3N4 膜以减少鼓胀效应，而这最终会降低可达到的分辨率。另一方面，GLC 具有由石墨烯构成的极薄膜壁，但存在 pockets 尺寸和位置随机的缺陷。通过 GSMLC 将这两种膜结构相结合，可以规避由细胞边界引起的分辨率限制35&#160;。由于微孔结构直接加工在 Si3N4 层中，实际的 Si3N4 膜可以比 SiLC 中的更小，从而简化了高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）分析，这一点已在 GSMLC 中得到证实6。不过需要指出的是，SiLC 本身也已实现 HRTEM 分析48。此外，由于各个样品腔的膜面积较小，可实现大视野观察，同时避免严重的窗口鼓胀。因此，如 Dukes 等人49 所示，与鼓胀相关的厚度增加35&#160;可在很大程度上被排除。这一点在 图7 中得到展示，图中显示了一个装载铝的 GSMLC 的代表性高角环形暗场（HAADF）扫描透射电子显微镜（STEM）图像。该图像是使用双束系统采集的。由于在此设置中获取的图像亮度与样品厚度直接相关，可以明显看出密封的微孔仅表现出轻微的负鼓胀。Kelly 等人24 已证明，图7 中可见的负鼓胀及部分微孔干燥现象与微孔直径有关。因此，减小微孔直径是进一步均一化液体厚度的可行方法。
由于GLC的平衡腔室形状，液体厚度也具有显著的位点依赖性35。SiLC采用源自两个不同硅晶圆的双膜设计。通过将顶部的Si3N4膜替换为石墨烯，液相腔的制备得以简化。这意味着可以避免在后续湿法刻蚀过程中两个键合硅晶圆之间可能发生的脱层问题，同时在腔体装载过程中也无需对准两个晶圆片。该细胞结构单侧的平坦表面使得能够进行互补的原位分析方法，例如对样品进行EDXS分析6，而在传统的SiLC结构中，由于陡峭硅边缘的遮挡效应，此类分析受到限制50。
此前已有研究展示过在预图案化微孔的底部和顶部孔位均用石墨烯进行密封的方法24,25。使用两层石墨烯膜可能提高可实现的分辨率。然而，两次石墨烯转移会进一步增加制备过程的复杂性，尤其是该步骤已被证明是整个制备过程中最敏感的环节（见下文）。此外，如前所述的膜鼓包现象在使用双层石墨烯膜时预计会更加严重，因为石墨烯比Si3N4层更柔韧。在这些结构中，微孔是通过连续聚焦离子束（FIB）铣削构建的。尽管该方法已被证实可获得高质量的结果，但FIB铣削是一种复杂且昂贵的细胞制造技术。相比之下，采用当前半导体行业中已标准化的大规模并行单次图案化技术（如纳米压印光刻或光刻技术）具有显著优势，即快速、低成本且易于规模化生产。
需要注意的是，此处介绍的方法无法实现液体流动操作，而其他设计可以实现这一功能28。由于GSMLC与GLC的加载量和液体体积相当，因此可避免因膜破裂导致高真空环境受到污染19，从而无需进行繁琐的密封性检查。尽管SiLC和GLC的优点已在GSMLC中得到结合，但两种方法的缺点在GSMLC中仍然存在。该类芯片的制备需要用于硅技术的洁净室设施，而透射电子显微镜（TEM）实验室未必具备此类条件。此外，液体加载过程并不简单，需要专门的培训，类似于石墨烯芯片的操作。然而，市售系统同样存在这一问题。在此过程中，最敏感的制备步骤是在石墨烯转移后移除TEM载网，因为过快的动作或抖动很可能破坏Si3N4层。不过，多余的膜窗设计提高了至少保留一个完整膜区域的可能性。因此，经过训练的实验人员所获得的产率（可正常工作的GSMLC芯片数量）为四分之三6，高于基于石墨烯的芯片（四分之一至二分之一）19。
与GLC类似，GSMLC中的液体封装基于范德华相互作用18。因此，界面污染可能会降低GSMLC制备的成功率19。此外，根据待封装液相的哈梅克常数（Hamaker constant），在加样过程中的润湿特性（从而影响可实现的产率）可能有所不同51&#160;，因此制备过程可能变得复杂。我们的经验表明，例如当存在两亲性物质时，便可能出现这种情况。
GSMLC 结构能够灵活配置孔深，从而适应各种实验先决条件。此外，该结构适用于在 ±75 ° 的大倾转角度范围内进行电子断层扫描研究，这也使得in situ电子断层扫描52成为可能。因此，利用 GSMLC 也可实现对液体中样品的in situ和post mortem断层扫描。

现代材料科学、化学和细胞生物学需要深入理解亚微米尺度下的动态过程和效应。尽管受激发射损耗荧光显微技术等先进光学显微技术具有强大能力1，但要直接成像以获取详细的形态信息，仍需依赖电子显微技术。特别是原位（扫描）透射电子显微镜（in situ (S)TEM），通过将液体封装在专用的真空密封样品腔中，已成功揭示了诸多关于过程动态的宝贵信息2。已有多种实验利用(S)TEM揭示了传统显微技术无法观测到的众多现象，包括对纳米结构形成动力学和热力学的定量研究3,4,5,6、生物样本成像7,8,9,10、与能量存储相关的机制研究11,12，以及对腐蚀过程动力学13或纳米气泡物理特性14,15,16的系统性研究。
在过去的十年中，实现该目标主要有两种方法 原位 液相透射电子显微镜（LCTEM）技术已建立。在第一种方法中，液体被封装在两片硅片之间的空腔内3N4 通过硅工艺技术制备的膜17而第二种情况下，会在两层石墨烯或氧化石墨烯片层之间形成微小的液体 pockets10,18硅基液体池（SiLCs）和石墨烯基液体池（GLCs）的操作方法均已得到验证19,20,21尽管这两种方法都已取得了显著改进22,23,24,25，它们仍然缺乏对各自优势的结合。通常情况下，在将样品封装于通常结构不明确的石墨烯袋中时，存在一种权衡：尽管液体体积小有利于实现高分辨率成像18，以及明确的细胞体积，从而形成更厚的膜和液体层，提供更接近大体积液体中自然状态的环境26 以牺牲分辨率为代价2此外，某些实验依赖于液体流动26,27 仅在SiLC架构中实现，并需要专用的透射电子显微镜（TEM）样品台28.
在此，我们介绍一种用于高性能的液体池制备与操作方法 原位 通过静态石墨烯支撑微孔液体池（GSMLC）进行液相透射电子显微镜（LCTEM）分析。GSMLC的示意图如下所示 图1. GSMLCs 已被证明能够实现 原位 高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）结果6 并且也适用于 原位 扫描电子显微镜29基于硅技术的框架使得能够从单个晶圆上大规模生产形状一致、液体层厚度可调且具有超薄膜的细胞。这些细胞表面覆盖的石墨烯膜还可减轻电子束引起的干扰8,30,31 由于电子束首先穿过顶部的石墨烯膜，细胞的平坦形貌使得可以进行其他互补的分析方法，例如能量色散X射线光谱（EDXS）。6 不会因液体池本身产生阴影效应，从而实现多种高质量 原位 液体池电子显微镜实验

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>VWR Chemicals</td><td>50488858</td><td>VLSI</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td>自行制备</td></tr><tr><td>Dumont 抗毛细作用镊子</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LH72.1</td><td>0203-N5AC-PO Dumoxel 合金</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>85651.360</td><td>VLSI</td></tr><tr><td>FIJI（即 ImageJ）</td><td>FIJI.sc</td><td>版本 1.51</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil 金载网，无定形碳透射电镜载网</td><td>Plano GmbH</td><td>S173-8</td><td>R 2/2 Au 300 目</td></tr><tr><td>HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 3 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 晶体</td><td>Alfa Aesar</td><td>36400.06</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>Project Jupyter</td><td>版本 5.7.2</td><td></td></tr><tr><td>Matplotlib 软件包</td><td>John Hunter、Darren Dale、Eric Firing、Michael Droettboom 及 Matplotlib 开发团队</td><td>版本 3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>NumPy 软件包</td><td>NumPy 开发者</td><td>版本 1.15.4</td><td></td></tr><tr><td>Pandas 软件包</td><td>AQR Capital Management, LLC、Lambda Foundry, Inc. 和 PyData 开发团队</td><td>版本 0.23.4</td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python 软件基金会</td><td>版本 3.7</td><td></td></tr><tr><td>SciPy 软件包</td><td>SciPy 开发者</td><td>版本 1.1.0</td><td></td></tr><tr><td>Seaborn 软件包</td><td>Michael Waskom</td><td>版本 0.9.0</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>Siegert Wafer GmbH</td><td></td><td>薄型单晶硅（100）晶向，厚度 175 ± 5 &amp;micro;m，直径 4&quot;，p 型，硼掺杂（1–30 欧姆·厘米），双面抛光</td></tr><tr><td>单倾透射电镜样品杆</td><td>Philips</td><td></td><td>确保样品适配</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Philips</td><td>CM 30 (S)TEM</td><td>300 kV</td></tr><tr><td>Trivial Transfer 石墨烯</td><td>ACS Material</td><td>TTG60011</td><td>覆盖 PMMA，6–8 层</td></tr></tbody></table>

用于制备石墨烯支撑的微孔液体池 原位 透射电子显微镜技术

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

用于石墨烯支撑微孔液体池（GSMLCs）的制备与加工 原位 透射电子显微镜的逐步操作方案被详细呈现。GSMLCs的多功能性在一个关于从HAuCl中金纳米结构的刻蚀与生长动力学研究中得到验证。4 前驱体溶液。GSMLCs 结合了传统硅基和石墨烯基液体池的优势，既能提供可重复的凹坑深度，又便于液体池的制备以及对被测样品的操作。GSMLCs 在单个硅基底上制备，与基于双晶圆的液体池设计相比，显著降低了制造工艺的复杂性。该方法无需键合或对准等工艺步骤。此外，通过简单调节氮化硅层的厚度，即可按具体实验需求定制封闭的液体体积，从而显著减少电子显微镜真空环境下窗口的鼓胀现象。最后，本文展示了仅使用开源软件对液体池实验中单颗粒追踪和枝晶形成进行前沿定量分析的方法。

细胞加载后，在光学显微镜下观察到孔中出现不同明暗区域，表明石墨烯成功转移。例如，图3c右侧的膜即显示此现象。如前所述，必须小心移除TEM载网，以避免破坏薄的Si3N4层。若膜发生破裂，则在光学显微镜下可清晰看到透亮且弯曲的残留物，如图3c左侧两个膜所示。由于所用GSMLC设计具有多个观察区域，只要至少有一个膜保持完整，该细胞即可继续使用。破裂的膜可用于透射电镜（TEM）的光路校准，同时避免使样品暴露于电子束下。
在电子显微镜观察过程中，可以验证样品溶液是否成功封装。图5展示了补充视频1中的单帧显微图像，其中对GSMLC中一组纳米颗粒的溶解过程及枝晶结构的生长进行了统计评估。除了图像因漂移引起的整体移动外，还可观察到微小的、独立的垂直方向上的颗粒运动，表明溶液中存在颗粒。此外，颗粒溶解现象的普遍存在证明了湿化学反应的发生，而若无成功封装液体，该反应是不可能实现的。其他表明液体被成功封装的典型特征还包括电子束诱导产生的气泡形成19或颗粒运动。仅在石墨烯封装的液体池中观察到Au颗粒，并不能确凿证明存在液体环境，因为这些颗粒也可能源于石墨烯诱导HAuCl440的还原反应。此外，也可通过电子能量损失谱（EELS）对封装液体中的氧峰进行定量分析，以验证液体环境的存在41。
为了深入了解颗粒生长与溶解动力学，必须对每个颗粒进行单独研究，而非分析平均参数的演变过程42。此外，必须排除那些仅被相机部分捕获的位于图像边缘的颗粒，因为这些颗粒因漂移效应引起的位置变化可能被误判为生长或溶解过程。刻蚀现象被认为是由电子束诱导辐射分解产生的氧化性物质所引起的43。为了获得足够的统计结果，需要采用计算性的单颗粒追踪方法。通过估算单个颗粒等效半径随时间变化的增长指数 α，可以获得有关基础反应动力学的信息。为此，即使并非所有颗粒均为完全球形，仍可根据颗粒投影面积引入等效半径的概念6,44。 图5b 展示了在 图5a 中标出的六个代表性颗粒的等效半径随时间的追踪结果。图5c 显示了基于本研究中73个溶解颗粒的 α 值分布情况。仅将那些异速生长模型对半径减小的解释程度至少达到50%（校正后的决定系数）的颗粒纳入分析。
此外，在 图6a 所示的同一微孔中，约42秒后迅速出现枝晶结构。枝晶形成是液体池中另一种典型且已有充分文献记录的过程45,46。为了量化枝晶生长过程，对结构轮廓（见 图6a 插图）进行了分析。尖端半径和速度随时间的演化（见 图6b,c）揭示了预期的双曲线关系47（图6d）。枝晶生长是由前述颗粒刻蚀引起的金离子局部过饱和所致。在 图5a 中可以清楚地观察到，颗粒仍在溶解，同时过饱和体系正向枝晶生长弛豫。这可能是由于GSMLC中液体的高黏度导致金离子和氧化性物质的局部浓度分布不均，此前已有相关报道6。然而，对该现象的详细讨论超出了本研究的范围。
<img alt="带有氮化硅薄膜和石墨烯的微孔示意图；用于样品液体分析的截面图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：石墨烯支撑微孔液体池（GSMLC）示意图：石墨烯支撑微孔液体池的结构示意图。转载自 https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.8b03388 6。进一步的许可申请应提交至美国化学会（ACS）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="硅纳米加工工艺示意图；步骤 a-f 显示二氧化硅/氮化硅层的图形化过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：GSMLC-框架的制备。 GSMLC-框架的制备过程以示意图形式简要展示。(a) 硅片清洗后的氧化处理。(b) 低压化学气相沉积（LPCVD）沉积 Si3N4。(c) 通过光刻和反应离子刻蚀（RIE）对正面 Si3N4 进行图形化，以定义细胞腔室体积。(d) 沉积 Si3N4 形成底部细胞窗口。(e) 背面光刻和反应离子刻蚀（RIE）。(f) 使用 KOH 进行体微加工，形成含有微孔的自支撑 Si3N4 膜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="石墨烯转移过程；包括滤纸、石墨烯/PMMA、透射电镜载网、抗毛细力镊子。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：将带有PMMA保护层的少层CVD石墨烯转移至透射电镜载网。图示为将PMMA上的少层CVD石墨烯转移至带孔碳膜透射电镜载网上表面的过程。（a） 将PMMA上的少层CVD石墨烯浸入盛有去离子水的培养皿中。（b） 将转移至滤纸上的石墨烯/PMMA堆叠层切割成适合覆盖GSMLC框架的尺寸。（c） 将切割后的石墨烯/PMMA小片重新浸入液体中。（d） 将石墨烯/PMMA层转移至带孔碳膜透射电镜载网上。（e） 成功转移后的石墨烯/PMMA堆叠结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="通过显微成像分析石墨烯膜的耐久性；密封与破损样品的对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：顶部透射电镜（TEM）载网的移除。 利用光学显微镜记录加载后石墨烯密封微腔阵列（GSMLC）的干燥过程。(a) 加载完成后，将涂覆石墨烯的TEM载网直接放置在GSMLC上方。石墨烯层呈现为青色矩形，覆盖全部三个观察区域，其大致轮廓由黑色矩形标示。(b) 约两分钟后，通过湿润区域（深色，可与(a)对比）与已贴附区域（青色）之间的对比变化，可观察到几乎完全贴附的膜。(c) 显示移除TEM载网后的GSMLC，可见两个破损的膜（左侧和中间），以及一个成功加载并密封微孔的膜（右侧）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒生长、时间序列显微图像及粒径分布图、统计图表分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：纳米颗粒半径的代表性发展过程。共追踪了 183 个独立颗粒的半径演变。(a) 摘自补充视频 1的图像序列。其中六个代表性颗粒被高亮显示。彩色圆圈对应所获得的等效半径。(b) 颗粒半径的对数图。(c) 73 个颗粒的直方图，其中使用自动化程序确定了负异速生长指数 α。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示平均尖端半径和速度数据分析的纳米结构延时显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig6.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：枝晶动态：对五个枝晶分支的尖端半径进行分析。 误差棒表示相应的标准偏差。(a) 来自补充视频1的图像序列，显示约42秒后出现的枝晶。右图插图展示了枝晶轮廓的演化过程，其中粉色轮廓对应42.09秒，红色对应42.7秒，紫色对应43.3秒。(b) （平均）尖端半径随时间的变化。(c) 平均尖端速度随时间的变化曲线。(d) 平均尖端半径与平均尖端速度的对数关系图，显示出双曲线依赖关系（橙色曲线）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="用于材料分析的多孔纳米结构显微图像；比例尺 3 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59751/59751fig7.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 7"> 
图 7：载有样品的 GSMLC 的扫描电镜图像：在低加速电压（29 kV）下，通过扫描电子显微镜以 HAADF STEM 模式获取的载有样品的 GSMLC 的代表性 SEM 图像。 除明显的 5 µm 宽微孔阵列外，还可观察到两个部分重叠的圆形多孔碳网格（直径 2 µm），这些网格源于上述石墨烯转移过程。第一个碳网格来自一次失败的石墨烯转移。可以清楚地看到，膜的衬度在微孔区域基本保持恒定，但在接近微孔中心时略有变暗，表明存在微弱的负向鼓胀。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/59751fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充视频 1：原位 视频展示了液体池明场透射电子显微镜研究中金纳米颗粒刻蚀过程及随后因周围样品溶液过饱和而形成枝晶结构的代表性结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59751/Supplementary_Video_1.avi">请点击此处下载该文件。</a>

用于制备石墨烯支撑的微孔液体池的方案 原位 氯金酸中金纳米晶体的电子显微镜观察4 介绍了前驱体溶液的制备。此外，还提供了一种分析流程，用于量化观测到的刻蚀与生长动力学过程。

石墨烯支撑的微孔液体池（GSMLCs）用于原位电子显微镜观察的制备与 fabrication 方法以逐步操作方案形式呈现。

液体池电子显微技术是一种强大的方法，可用于在高分辨率下研究液体环境中C2的纳米特征，并提供纳米尺度动态过程的独特实时观察。基于石墨烯支撑的微孔液体池结合了石墨烯和基于硅技术的液体池结构的双重优势，能够实现与EDX能谱等分析方法的现场联用与关联分析。该技术使我们能够在材料于液体中发生过程的同时直接对其进行追踪。这种原位观测正是我们研究培训小组的核心内容。该研究由德国研究基金会资助，涉及电子、X射线和扫描探针的原位显微技术。演示该实验步骤的是本实验室的工作人员、化学硕士罗伯特·布兰舍德（Robert Branscheid）。首先，将石墨烯转移至透射电镜载网。操作时，先润湿支撑六到八层CVD石墨烯的PMMA膜上的组织，注意不要将水直接滴加到PMMA膜上。将涂有PMMA的石墨烯完全浸入盛有去离子水的培养皿中，然后用滤纸捞起石墨烯层。在整个操作过程中，注意确保石墨烯-PMMA复合结构的石墨烯面始终朝上。将石墨烯层裁剪成足够大的片状，以覆盖所有已制备的微孔。然后，将切割好的样品重新浸入培养皿中。接着，使用一对抗毛细管镊子夹取一个表面带有孔状碳支持膜的透射电镜载网。小心地将载网浸入水中，捕获漂浮在水面上的石墨烯。让薄膜干燥数小时。随后，将样品放入丙酮溶液中浸泡30分钟，以去除PMMA保护层。丙酮处理后，立即将样品浸入乙醇和去离子水中，样品在不同溶液之间转移时不得进行干燥。使用平底容器以便于后续取出样品。完成后，将样品从去离子水中取出，并在常温条件下干燥 30 分钟。按照文本方案中的步骤制备带有微图案化微孔的液体池模板。用丙酮冲洗制备好的液体池模板，随后用乙醇冲洗。然后，在常温下使用20%氧气、80%氮气的等离子体处理五分钟，以提高膜的润湿性。将0.5 µL的样品溶液滴加到模板或石墨烯层上。确保操作过程顺畅，以尽量减少因蒸发导致的浓度变化。接着，将透射电镜（TEM）载网放置在微图案化的氮化硅层上，使石墨烯面向模板。小心地将带有石墨烯的TEM载网压在模板上，注意不要破坏底部的氮化硅膜。用纸巾去除多余的溶液，以加速细胞干燥并减少浓度变化。大约两到三分钟后，观察到对比度发生变化，此时石墨烯与氮化硅之间的范德华相互作用已将液体池密封。随后，将样品置于光学显微镜下观察。使用一对镊子，将镊尖插入TEM载网与石墨烯支撑的微孔液体池框架之间，小心地取出TEM载网。为减少剪切力造成的损伤，应从与较小窗口边缘平行的一侧开始操作。确保至少有一层石墨烯支撑的微孔液体池膜仍保持完整。使用标准透射电镜载物台，将样品装入载物台中。样品制备完成后，立即把载物台和样品装入扫描透射电子显微镜。根据样品和显微镜的特性，选择合适的成像条件对样品进行成像。使用低剂量以尽量减少预先产生的伪影，使用短曝光时间以避免运动引起的模糊。对于长时间实验，应阻断光束以减少辐射损伤。在获取图像后，使用合适的图像处理平台提取感兴趣特征。对于颗粒追踪与分析，使用开源的 ImageJ 发行版 Fiji。加载图像并将其转换为二值图像后，利用“分析颗粒”功能获取每帧图像中每个颗粒的投影面积及其质心的精确信息。将原始图像进行反相处理，使颗粒呈现为亮斑。然后，借助插件 TrackMate 将各帧之间的颗粒进行连接。默认情况下，TrackMate 会在暗背景上搜索亮颗粒。最后，整合 TrackMate 的结果，并利用基于 Python 的开源生态系统 SciPy，通过适当的脚本对颗粒进行分析。样品溶液的成功包埋可以在电子显微镜下进行验证。本视频展示了纳米颗粒集合体的溶解过程以及枝状结构的生长。为了深入了解颗粒的生长与溶解动力学，重要的是对每个颗粒进行单独研究，而非分析平均参数的发展变化。通过估算单个颗粒等效半径随时间变化的增长指数 α，可以获得有关基础反应动力学的信息。此处展示了基于 73 个溶解颗粒的 α 分布。仅考虑异速生长模型对半径减小的解释程度至少达到 50% 的颗粒。视频结束时，出现了枝晶结构。枝晶形成是液态电池中另一种典型且有充分文献记载的过程。为了量化枝晶的生长，需对结构轮廓进行分析。尖端半径和生长速度随时间的演变呈现出预期的双曲线关系。枝晶生长是由于前述颗粒蚀刻导致金离子局部过饱和所致。在视频的这一部分，可以清楚地观察到颗粒仍在溶解，同时过饱和体系逐渐弛豫并转变为枝晶生长。这可能是由于金离子和氧化性物质的局部浓度变化所致。液体加载和苏尔夫（suhrf）对目标样品具有高度依赖性，因为当使用不同的样品溶液时，石墨烯的粘附性以及所需的干燥时间可能会有所不同。基于石墨烯支撑的微孔液体池结构还允许结合其他原位表征方法，例如EDSX中的产率分析。此外，透射模式下的扫描电镜（SEM）及断层扫描实验也已成功实施。该技术发展后，便能够揭示金、银、kawsh-en及其他颗粒生长机制的原子级分辨率细节。研究结果与物理系同事所获得的等离子体共振测量数据高度一致，他们也参与了本研究培训小组的工作。尽管此处未显示，载具框架的制备过程涉及腐蚀性物质和有毒物质。操作时请务必小心，并采取必要的防护措施。

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