使用微米级X射线计算机断层扫描结合磷钨酸染色技术可视化人纤维肌性组织

我们采用磷钨酸增强的显微CT技术，以提高在无创研究人眼轮匝肌支持韧带时的软组织对比度，该结构是眼眶区域内的精细解剖构造。本方案已优化，旨在辅助研究人员对人软组织进行无创性研究，操作简便且成本合理。获取样本时，首先使用彩色铅笔在皮肤上标出取材所需的切割区域。

确认标记线向内延伸至内侧眶缘，向外延伸至外侧眶缘，向上至下眼睑上缘，向下至眶缘线下方一厘米处。接下来，使用刀片沿标记线切开面部组织，确保切口足够深，使刀尖能够触及骨面。所获取的样本必须包含皮肤、皮下组织、肌肉、脂肪和骨膜。

采集后，立即将样本置于10%福尔马林中，在室温下固定5至7天。固定结束后，将样本切成三个厚度为5至7毫米的片状。使用针和黑色缝线缝合每个样本的上外侧，以便在后续时间点确定样本的方向。

将样品依次置于浓度递增的乙醇溶液中脱水，每个浓度处理一天，最后将样品保存在70%乙醇溶液中直至染色。在计划进行微型计算机断层扫描前一周，将2.1克PTA加入210毫升70%乙醇溶液中，并将该溶液置于摇床，以每分钟55至60转的速度振荡。为每个切片样品准备三个70毫升的塑料容器。

当染料完全溶解于酒精溶液后，用该溶液填充容器。将一个样本放入每个装有1%PTA的容器中，并在55至60转/分钟的条件下振荡样品5至7天。染色完成后，将样本置于新鲜的70%乙醇中保存一周，以备扫描使用。

进行显微CT扫描时，用Parafilm包裹样品以防止干燥，并将样品放置于扫描仪托盘上。将扫描仪的源电压设为70千伏，源电流设为114微安，铝滤膜设为0.5毫米，图像像素尺寸设为20平方微米，像素设为2,240 × 2,240，曝光时间为500毫秒，旋转步进设为0.3度。然后启动扫描。

扫描完成后，打开重建软件，选择“Actions”（操作）并点击“Open Dataset”（打开数据集）以载入扫描文件。选择“Settings”（设置）选项卡，将环状伪影减少值设为7，并启用束硬化校正。开始重建时，点击“Start”（开始）。

最终数据将存储在指定文件夹中。重建完成后，打开文件重设大小软件，选择源数据集以加载重建后的文件。在目标数据集选项卡中选择 jpg 格式，选择“1/2 重设大小”选项，并将质量选项设为“无插值”。然后在图像压缩选项卡中将滑块调整至 100，开始转换。

进行三维重建时，打开三维体积渲染软件，选择“操作”和“加载体积数据”。为调整亮度和对比度，需在“传递函数编辑器”选项卡的直方图中修改形状传递函数。接着选择“选项”和“光照”，并启用“阴影”和“表面光照”图标，以获得逼真的建模效果。

单击并拖动，或右键单击并拖动以移动和旋转三维图像，找到最佳视角；滚动鼠标滚轮可放大或缩小。按住 Shift 键并拖动可滑动查看位置，以显示对应的断层图像。打开灯光图标，并调节照明指示条，找到最佳观察照明效果，然后关闭灯光图标并关闭照明选项卡。

在“选项”标签页中，选择“显示”和“裁剪框”，以隐藏最终图像的框线。然后选择“操作”和“保存图像”来存储图像。通过如上所述的PTA处理结合显微CT技术，实现了ORL的精细重建，从而能够观察到从真皮层斜向延伸至骨膜的韧带状纤维肌性结构。

在冠状面中，纤维的数量和复杂性向外侧逐渐增加。在水平面中，可见复杂的网状结构，呈树枝状分布。在矢状面中，视辐射纤维的厚度向下方逐渐变薄。

总体而言，这种多方向观察证明，ORL 由连续板构成的多层网状结构组成，其纤维的数量和厚度随位置不同而有所变化。当染色时间相对于样本体积不足时，最终图像可能在样本中心区域出现空白孔洞。除 PTA 外，还可使用其他试剂，不同试剂具有不同的优点或染色特性及应用价值。

因此，根据您的实验优化染色区域是有用的。