Name: 用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 了解Vibrio fischeri细菌菌株间竞争机制的联合孵化测定方法。该方案利用荧光蛋白和抗生素抗性基因进行菌株区分，帮助研究人员表征细菌竞争相互作用及其对种群空间结构的影响。

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我们感谢审稿人提供的有益反馈。A.N.S. 的研究得到了戈登与贝蒂·摩尔基金会通过向生命科学研究基金会提供的资助 GBMF 255.03 的支持。

<ol><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+competition%3A+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).</li>
<li>Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winnowing%3A+establishing+the+squid-Vibrio+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis.</a> Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).</li>
<li>Dörr, N. C. D., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+VI+secretion+system+facilitates+niche+domination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).</li>
<li>Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+system+displays+antimicrobial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).</li>
<li>Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+parahaemolyticus+type+VI+secretion+system+1+is+activated+in+marine+conditions+to+target+bacteria%2C+and+is+differentially+regulated+from+system+2%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2.</a> PloS One. 8 (4), e61086(2013).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Typhimurium+utilizes+a+T6SS-mediated+antibacterial+weapon+to+establish+in+the+host+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068(2010).</li>
<li>Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+pathways+for+self-recognition+in+Proteus+mirabilis+are+linked+by+type+VI-dependent+export%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export.</a> MBio. 4 (4), (2013).</li>
<li>García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+killing+by+Caulobacter+crescentus+via+cell+surface-associated%2C+glycine+zipper+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins.</a> Elife. 6, 24869(2017).</li>
<li>Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+interfaces+of+bacterial+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted interfaces of bacterial competition.</a> Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).</li>
<li>Cornforth, D. M., Foster, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+art+of+bacterial+war%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the art of bacterial war.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).</li>
<li>Shank, E. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+microbial+interspecies+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New developments in microbial interspecies signaling.</a> Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).</li>
<li>Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteroidales+secreted+antimicrobial+proteins+target+surface+molecules+necessary+for+gut+colonization+and+mediate+competition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo.</a> MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).</li>
<li>Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sibling+rivalry+in+Myxococcus+xanthus+is+mediated+by+kin+recognition+and+a+polyploid+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage.</a> Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).</li>
<li>Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+CDI+systems+multicolored%2C+facultative%2C+helping+greenbeards%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?</a> Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+growth+inhibition+%28CDI%29+and+CdiB%2FCdiA+two-partner+secretion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins.</a> Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).</li>
<li>Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim%2C+load%2C+fire%3A+the+type+VI+secretion+system%2C+a+bacterial+nanoweapon%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon.</a> Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).</li>
<li>Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rules+of+engagement%3A+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).</li>
<li>Speare, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+symbionts+use+a+type+VI+secretion+system+to+eliminate+competitors+in+their+natural+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).</li>
<li>Shank, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+coculture+to+detect+chemically+mediated+interspecies+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interactions+among+marine+bacteria+impede+the+proliferation+of+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).</li>
<li>Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+rfp-and+pES213-derived+tools+for+analyzing+symbiotic+Vibrio+fischeri+reveal+patterns+of+infection+and+lux+expression+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).</li>
<li>Sana, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+strain+PAO1+is+regulated+by+quorum+sensing+and+Fur+and+modulates+internalization+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).</li>
<li>Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+modulate+the+mucin-activated+type+VI+secretion+system+of+pandemic+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS%22%5BJournal%5D)">Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae.</a> PLoS. 9 (8), e0004031(2015).</li>
<li>Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+regulation+of+the+two+hcp+alleles+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains.</a> PloS One. 4 (8), e6734(2009).</li>
<li>Ishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathoadaptive+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+O1+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains.</a> Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).</li>
<li>Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+transformation+of+Vibrio+fischeri+requires+tfoX+and+tfoY%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY.</a> Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).</li>
<li>Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitin+induces+natural+competence+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae.</a> Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).</li>
<li>Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system+of+Vibrio+cholerae+fosters+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer.</a> Science. 347 (6217), 63-67 (2015).</li>
<li>Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Vibrio+cholerae+to+low-temperature+shift%3A+CpsV+regulates+type+VI+secretion%2C+biofilm+formation%2C+and+association+with+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+conditional+regulation+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+fluvialis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis.</a> Frontiers in microbiology. 8, 528(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述共孵育实验为发现细菌间的竞争提供了一种强有力的方法。该方法已成功用于鉴定V. fischeri分离株之间的种内竞争，并表征其竞争机制19。尽管本实验流程最初是为海洋细菌V. fischeri优化设计的，但其可轻松修改以适用于其他细菌种类，包括临床和环境分离株。需要注意的是，细菌的竞争机制通常受到条件依赖性调控5,6,23,24,25,26,27,28，因此培养条件的微小差异（例如振荡培养与静置培养、温度等）以及培养基类型（...

本文描述了一种基于培养的方法，用于确定两种细菌分离株是否具有竞争性相互作用的能力。在研究混合种群时，评估细菌分离株之间相互作用的程度至关重要，特别是判断这些分离株是否通过干扰机制直接竞争。干扰竞争是指一个种群直接抑制另一个竞争种群的生长或将其杀死的相互作用1。明确这类相互作用非常重要，因为它们可能对微生物群落的结构和功能产生深远影响2,3。
已在来自各种环境（包括与宿主相关和自由生活的细菌）的细菌基因组中广泛发现微生物竞争的机制4,5,6,7,8,9。已有多种竞争策略被描述10,11，包括可扩散机制，如杀菌性化学物质1,12和分泌的抗菌肽13，以及依赖接触的机制，后者需要细胞间直接接触，将抑制性效应分子传递至靶细胞9,14,15,16,17,18。
尽管基于培养的共培养方法在微生物学中被广泛使用5,8,19，但本文详细阐述了如何利用该检测方法来表征竞争机制，并提供了将该实验方案适应用于其他细菌种类的建议。此外，本方法还描述了多种数据分析和结果展示的方法，以回答有关竞争相互作用性质的不同科学问题。尽管此处描述的技术此前已被用于鉴定共分离的Vibrio fischeri共生菌株之间种内竞争背后的种间杀伤机制19，但该方法同样适用于多种细菌种类，包括环境分离株和人类病原菌，并可用于评估依赖于细胞接触和可扩散因子的竞争机制。实验方案中的步骤可能需要针对其他细菌种类进行优化。鉴于越来越多的模式系统正在将其研究范围从同基因型生物扩展到包含不同基因型的研究10,16,20,21，本方法将为致力于探究竞争如何影响多菌株或多物种系统的科研人员提供重要资源。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 多通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;L 多通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 &amp;mu;L 多通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 单通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L 单通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 单通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000 &amp;mu;L 单通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Fisher</td><td>07-200-84</td><td>带盖无菌</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>带盖无菌</td></tr><tr><td>计算器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>储备液（20 mg/mL，溶于乙醇）；培养基中终浓度（2 &amp;mu;g/mL LBS）</td></tr><tr><td>带相机和成像软件的荧光解剖显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher</td><td>08-880</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>储备液（100 mg/mL，溶于水，过滤除菌）；培养基中终浓度（1 &amp;mu;g/mL LBS）</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜（FS MCE，25MM，NS）</td><td>Fisher</td><td>SA1J788H5</td><td>0.22 &amp;mu;m 硝酸纤维素膜（每包 100 片）</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>带盖无菌</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>半微量比色皿</td><td>VWR</td><td>97000-586</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 0.1–10 &amp;mu;L 起始系统</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3500</td><td>10 个架子</td></tr><tr><td>TipOne 200 &amp;mu;L 起始系统</td><td>USA Scientific</td><td>1111-500</td><td>10 个架子</td></tr><tr><td>TipOne 1000 &amp;mu;L 起始系统</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2520</td><td>10 个架子</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LBS 培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris 缓冲液（pH ~7.5）</td><td></td><td></td><td>50 mL 1 M 储备缓冲液（62 mL 盐酸，938 mL 去离子水，121 g Trizma Base）</td></tr><tr><td>琼脂（技术级）</td><td>Fisher</td><td>DF0812-17-9</td><td>15 g（仅用于制板）</td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td>950 mL</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>20 g</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>BP97265</td><td>10 g</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher</td><td>BP9727-2</td><td>5 g</td></tr></tbody></table>

共培养实验用于量化vibrio fischeri分离株之间的竞争相互作用

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

本文描述了一种基于培养的共孵育实验方法，用于检测和表征两种细菌群体之间的竞争性相互作用。该方法利用稳定的质粒，使每个细菌群体分别携带不同的抗生素抗性标记和荧光蛋白，从而实现对两个群体的选择性筛选和可视化区分。本文详细介绍了竞争性Vibrio fischeri菌株的制备与共孵育过程、荧光显微镜成像以及定量数据分析。该方法操作简便、结果快速，可用于判断一个细菌群体是否杀死或抑制另一群体的生长，并可确定竞争作用是通过可扩散分子介导，还是需要细胞间的直接接触。由于每个细菌群体表达不同的荧光蛋白，该实验能够在混合菌落中实现竞争群体的空间分辨。尽管本文所述方法使用共生细菌V. fischeri并在针对该物种优化的条件下进行，但该实验方案可适用于大多数可培养的细菌分离株。

为了评估细菌种群之间的竞争性相互作用，针对V. fischeri建立并优化了一种共培养实验方案。该方法利用编码抗生素抗性基因和荧光蛋白的稳定质粒，从而实现对不同菌株的选择性筛选和可视化区分。通过分析共培养实验所获得的数据，可以确定相互作用的竞争结果及其作用机制。例如，以下实验使用了V. fischeri分离株进行。共培养的菌株携带两种稳定质粒之一：pVSV102（表达卡那霉素抗性及GFP+）或pVSV208（表达氯霉素抗性及DsRed+）。在示例数据中，菌株以1:1的比例混合，并在LBS琼脂平板上共培养5小时。作为对照处理，将标记不同的参考菌株彼此之间进行共培养。实验处理则将携带pVSV102的参考菌株分别与竞争菌株1或竞争菌株2（携带pVSV208）进行共培养。各菌株的培养物按上述方法制备并进行共培养，如图1和图2所示。
<p class="jove_content" fo:keep-together.wit...

细菌编码了多种参与种间竞争的机制。本文介绍一种基于培养的方法，用于表征细菌分离株之间的竞争相互作用，以及这些相互作用如何影响混合种群的空间结构。

共培养实验用于量化Vibrio fischeri分离株之间的竞争相互作用

本文描述了一种基于培养的共孵育实验方法，用于检测和表征两种细菌群体之间的竞争相互作用。

本实验方案提供了一种简单而稳健的方法，用于鉴定和表征费氏弧菌（Vibrio fischeri）不同菌株之间的竞争机制。该方法利用携带不同抗生素抗性基因和荧光蛋白编码序列的稳定质粒，可在混合培养物中对每种细菌菌株进行差异化筛选和可视化区分。实验开始时，使用无菌牙签刮取琼脂平板上约一粒米大小的菌体细胞。将细胞重悬于含有1毫升LBS肉汤的1.5毫升微量离心管中。为分散细胞团块，将其轻轻压至管壁一侧，然后剧烈吹打混匀。盖紧管盖，涡旋震荡1至2秒；若仍可见细胞团块，可重复操作，直至样品在视觉上均匀一致。对所有样品重复从刮取细胞到涡旋的这些制备步骤。测量并记录所有样品在600纳米处的光密度。为获得准确的OD值，使用LBS肉汤将样品稀释至多10倍。然后将每个样品调整至所需的 OD 600。为将参考菌株与竞争菌株按 1:1 比例混合，取各 100 微升已调整至 OD 1.0 的菌株，加入已标记的 1.5 毫升离心管中，涡旋混匀 1 至 2 秒。作为对照，将参考菌株与其带有不同标签的版本混合，同样进行涡旋处理。获得正确的起始比例至关重要，因为该比例会显著影响实验结果。为确保成功，此步骤可能需要针对特定细菌种类进行优化。对每个生物学重复样本重复此步骤后，应包含四个带有不同标签标记的参照菌株作为对照组的生物学重复样本，以及四个同时带有不同标签标记的参照菌株和竞争菌株的生物学重复样本。为了在孵育后用于荧光显微镜观察，将每种对照和实验混合物各10微升点样到含有LBS琼脂的培养皿上。待样点在台面上完全干燥后，于24摄氏度培养24小时。为了在实验结束时用于定量各菌株的菌落形成单位，将每种对照和实验混合物各10微升加入到24孔板中，每孔含有1毫升LBS琼脂。待斑点完全干燥后，将培养板在24摄氏度下孵育5小时。为对起始共孵育混合物进行连续稀释，将96孔板旋转90度，使其形成8列12行的布局。每行均标记菌株编号、重复编号以及起始时间（t零时）。标记添加了适当抗生素的LBS琼脂平板，用于点样稀释系列，同时确保明确标识每块抗生素平板所筛选的菌株。使用多通道移液器，向每列孔中加入180微升LBS肉汤，第一列留空，用于未稀释的共孵育混合物。使用200微升单通道移液器，将100微升共孵育混合物从离心管转移至第一列的第一个孔中，然后丢弃吸头，并对所有共孵育混合物重复此操作。使用多通道移液器，将 20 微升液体从第一列转移至第二列，并反复吸打混匀。弃去移液器吸头，随后对每一列重复此操作，确保每次稀释时吸打次数保持一致。最终，每行将含有初始混合物的 10 倍倍比连续稀释液。使用装有八个吸头的多通道移液器，从稀释系列的每个孔中吸取五微升样品，并点样于添加卡那霉素的LBS琼脂平板上，以筛选参考菌株。重复此步骤，将样品点样于添加氯霉素的平板上，以筛选竞争菌株。待点样液完全干燥后，将平板置于24摄氏度培养箱中培养。在共孵育点和24孔板于24摄氏度下孵育5小时后，向每个孔中加入1毫升LBS肉汤。通过上下吹打重悬细胞，直至所有细胞完全重悬，且各重复组间吹打力度需保持一致。待每个共孵育点均重悬后，准备一块96孔板用于梯度稀释，并准备好含有适当抗生素的LBS琼脂平板，以用于点样稀释液，操作方式与之前相同。为了在24孔板中完成最终测量的系列稀释，请按照起始接种物系列稀释所用的步骤操作，并像之前一样将各稀释液点样于LBS琼脂平板上。随后按照论文中所述方法对共孵育点样区域的培养皿进行成像并进行数据分析。在实验处理组中，参照菌株与竞争菌株一在整个实验开始和结束时的比例均为0.5，与对照处理组一致。对照处理组以及参考菌株与竞争菌株一共同孵育时，其Log RCI值与零相比均无统计学差异。这些数据表明，参考菌株与竞争菌株一之间不存在竞争作用。相比之下，当参考菌株与竞争菌株二共同孵育时，参考菌株的比例从实验开始时的0.5下降至实验结束时低于0.01的比例。此外，当参考菌株与竞争菌株二共同孵育时，log RCI 值显著大于零。综合这些数据表明，参考菌株在竞争菌株二存在下的比例下降，提示两种菌株之间存在竞争关系。当参考菌株与竞争菌株一共同孵育时，两种菌株的菌落形成单位（CFUs）在五小时过程中均有所增加，且差异不显著，提示两者之间未发生竞争。此外，观察到约3200%的回收率，与对照组相比无统计学差异。然而，当参考菌株与竞争菌株二共同孵育时，在5小时时参考菌株的菌落形成单位（CFU）显著低于对照组中菌株二的CFU。同时，观察到约4%的回收率，显著低于对照组。总体而言，这些数据表明，第二菌株通过杀死参考菌株的细胞而表现出竞争优势。该实验步骤中最关键的环节是达到正确的起始比例，因为起始比例会显著影响实验结果。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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