共培养实验用于量化Vibrio fischeri分离株之间的竞争相互作用

本实验方案提供了一种简单而稳健的方法，用于鉴定和表征费氏弧菌（Vibrio fischeri）不同菌株之间的竞争机制。该方法利用携带不同抗生素抗性基因和荧光蛋白编码序列的稳定质粒，可在混合培养物中对每种细菌菌株进行差异化筛选和可视化区分。实验开始时，使用无菌牙签刮取琼脂平板上约一粒米大小的菌体细胞。

将细胞重悬于含有1毫升LBS肉汤的1.5毫升微量离心管中。为分散细胞团块，将其轻轻压至管壁一侧，然后剧烈吹打混匀。盖紧管盖，涡旋震荡1至2秒；若仍可见细胞团块，可重复操作，直至样品在视觉上均匀一致。

对所有样品重复从刮取细胞到涡旋的这些制备步骤。测量并记录所有样品在600纳米处的光密度。为获得准确的OD值，使用LBS肉汤将样品稀释至多10倍。

然后将每个样品调整至所需的 OD 600。为将参考菌株与竞争菌株按 1:1 比例混合，取各 100 微升已调整至 OD 1.0 的菌株，加入已标记的 1.5 毫升离心管中，涡旋混匀 1 至 2 秒。作为对照，将参考菌株与其带有不同标签的版本混合，同样进行涡旋处理。

获得正确的起始比例至关重要，因为该比例会显著影响实验结果。为确保成功，此步骤可能需要针对特定细菌种类进行优化。对每个生物学重复样本重复此步骤后，应包含四个带有不同标签标记的参照菌株作为对照组的生物学重复样本，以及四个同时带有不同标签标记的参照菌株和竞争菌株的生物学重复样本。

为了在孵育后用于荧光显微镜观察，将每种对照和实验混合物各10微升点样到含有LBS琼脂的培养皿上。待样点在台面上完全干燥后，于24摄氏度培养24小时。为了在实验结束时用于定量各菌株的菌落形成单位，将每种对照和实验混合物各10微升加入到24孔板中，每孔含有1毫升LBS琼脂。

待斑点完全干燥后，将培养板在24摄氏度下孵育5小时。为对起始共孵育混合物进行连续稀释，将96孔板旋转90度，使其形成8列12行的布局。每行均标记菌株编号、重复编号以及起始时间（t零时）。

标记添加了适当抗生素的LBS琼脂平板，用于点样稀释系列，同时确保明确标识每块抗生素平板所筛选的菌株。使用多通道移液器，向每列孔中加入180微升LBS肉汤，第一列留空，用于未稀释的共孵育混合物。使用200微升单通道移液器，将100微升共孵育混合物从离心管转移至第一列的第一个孔中，然后丢弃吸头，并对所有共孵育混合物重复此操作。

使用多通道移液器，将 20 微升液体从第一列转移至第二列，并反复吸打混匀。弃去移液器吸头，随后对每一列重复此操作，确保每次稀释时吸打次数保持一致。最终，每行将含有初始混合物的 10 倍倍比连续稀释液。

使用装有八个吸头的多通道移液器，从稀释系列的每个孔中吸取五微升样品，并点样于添加卡那霉素的LBS琼脂平板上，以筛选参考菌株。重复此步骤，将样品点样于添加氯霉素的平板上，以筛选竞争菌株。待点样液完全干燥后，将平板置于24摄氏度培养箱中培养。

在共孵育点和24孔板于24摄氏度下孵育5小时后，向每个孔中加入1毫升LBS肉汤。通过上下吹打重悬细胞，直至所有细胞完全重悬，且各重复组间吹打力度需保持一致。待每个共孵育点均重悬后，准备一块96孔板用于梯度稀释，并准备好含有适当抗生素的LBS琼脂平板，以用于点样稀释液，操作方式与之前相同。

为了在24孔板中完成最终测量的系列稀释，请按照起始接种物系列稀释所用的步骤操作，并像之前一样将各稀释液点样于LBS琼脂平板上。随后按照论文中所述方法对共孵育点样区域的培养皿进行成像并进行数据分析。在实验处理组中，参照菌株与竞争菌株一在整个实验开始和结束时的比例均为0.5，与对照处理组一致。

对照处理组以及参考菌株与竞争菌株一共同孵育时，其Log RCI值与零相比均无统计学差异。这些数据表明，参考菌株与竞争菌株一之间不存在竞争作用。相比之下，当参考菌株与竞争菌株二共同孵育时，参考菌株的比例从实验开始时的0.5下降至实验结束时低于0.01的比例。

此外，当参考菌株与竞争菌株二共同孵育时，log RCI 值显著大于零。综合这些数据表明，参考菌株在竞争菌株二存在下的比例下降，提示两种菌株之间存在竞争关系。当参考菌株与竞争菌株一共同孵育时，两种菌株的菌落形成单位（CFUs）在五小时过程中均有所增加，且差异不显著，提示两者之间未发生竞争。

此外，观察到约3200%的回收率，与对照组相比无统计学差异。然而，当参考菌株与竞争菌株二共同孵育时，在5小时时参考菌株的菌落形成单位（CFU）显著低于对照组中菌株二的CFU。同时，观察到约4%的回收率，显著低于对照组。

总体而言，这些数据表明，第二菌株通过杀死参考菌株的细胞而表现出竞争优势。该实验步骤中最关键的环节是达到正确的起始比例，因为起始比例会显著影响实验结果。