用于量化Vibrio Fischeri分离物之间竞争交互的联合孵化测定
2019年7月22日
细菌编码各种机制,参与细菌间竞争。在这里,我们提出了一个基于培养的协议,用于描述细菌分离物之间的竞争相互作用,以及它们如何影响混合种群的空间结构。
我们的协议提供了一种简单而稳健的方法，用于识别和描述不同菌株的 Vibrio 菲舍尔细菌之间的竞争机制。此方法使用稳定的质粒编码不同的抗生素耐药基因和荧光蛋白，允许差异选择和视觉识别每个细菌菌株在混合培养。首先，使用无菌牙签从一粒大米大小的阿加板中刮出细胞。
将细胞重新淹没在含有1毫升LBS汤的1.5毫升微离心管中。要分解细胞团，请将它们压入管的一侧，然后大力上下移液器。关闭管和涡流一到两秒钟，如果细胞团仍然可见，重复，直到样品在视觉上均匀。
对所有样品重复这些制备步骤，从细胞刮擦到涡旋。测量并记录所有样品的光学密度为 600 纳米。为了获得准确的 OD 测量，使用 LBS 汤将样品稀释多达 10 倍。
然后将每个样品规范化为所需的 OD 600。要将参考应变和竞争对手应变以一比一的比例混合，将每株100微升的亚光升加到OD 1.0中，加入一个标有1.5毫升的离心管和涡流，一至两秒钟。作为控件，将参考应变与本身的差分标记版本和涡流混合。
实现正确的起始比至关重要，因为它可以显著改变实验的结果。为了确保成功，此步骤可能需要对给定细菌物种进行优化。在每个生物复制重复此步骤后，应有四个生物复制，以不同标记参考菌株作为对子，四个生物复制与差分标记参考菌株和竞争对手菌株。
为了制作孵化后用于荧光显微镜的培养点，在含有LBS agar的培养板上加入10个每个控制和实验混合物的10微升。斑点在长凳上完全干燥后，在24摄氏度下孵育板24小时。为了在实验结束时，将培养点用于量化每个菌株的聚落形成单位，将每个对照装置和实验混合物的10微升添加到24个井板中，每孔含有1毫升LBS汞。
斑点完全干燥后，在24摄氏度下孵育板5小时。要连续稀释起始开库混合物，请旋转 96 井板 90 度，以便有 8 列和 12 行。用应变 ID、复制编号和以 t 零开始的时间标记每行。
给LBS加糖板贴上标签，并辅以适当的抗生素，以发现稀释系列，同时确保确定每个抗生素板选择的菌株。使用多通道移液器，将 180 微升 LBS 汤添加到每条井中，使第一柱为未稀释的硬币分配混合物留空。使用 200 微升单通道移液器，将 100 微升的硬币孵化混合物从管转移到第一柱的第一个井，然后丢弃尖端，对所有开投混合物重复。
使用多通道移液器，将 20 微升从第一列转移到第二列，然后上下调液器进行混合。丢弃提示，重复每列，同时与每次稀释的上下移液数保持一致。最后，每行将包含初始混合物的 10 倍串行稀释。
使用多通道移液器，配备八个吸头，在稀释系列中从每一井吸出五微升，并点到卡纳霉素补充的 LBS 加糖板上，该板可选择参考应变。重复此步骤，为竞争对手选择在氯霉素补充板上发现应变。斑点完全干燥后，将板放在24摄氏度的培养箱中。
在硬币孵化点和24个井板在24摄氏度下孵育5小时后，在每孔中加入1毫升LBS汤。通过上下移液，直到所有细胞被重新注入，与细胞在所有复制中重新注入的活力保持一致。一旦每个开库点重新暂停，准备一个96井板的连续稀释和LBS加糖板与适当的抗生素，以发现稀释的方式与以前一样。
要完成 24 孔板中 t 最终测量的串行稀释，请执行用于连续稀释起始氧化铝的步骤，并像之前一样在 LBS 加糖板上点点每次稀释。继续成像培养板上的硬币点，并进行数据分析，如手稿中所述。在实验治疗中，参考菌株和竞争对手菌株在实验的开始和结束时与控制治疗一致的比例为0.5。
Log RCI 值在统计上与控制处理的零没有差异，或者当参考应变与竞争对手菌株一一孵育时。这些数据表明，参考菌株与竞争对手菌株之间没有竞争。相比之下，当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时，参考应变从开始时的0.5比例降至实验结束时小于0.01的比例。
此外，当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时，日志RCI值明显大于零。总之，这些数据表明，在存在竞争对手菌株的情况下，参考菌株的比例下降，这表明菌株之间的竞争。当参考菌株与竞争对手菌株1一孵育时，两种菌株的C双在5小时内增加，且没有明显不同，表明没有竞争发生。
此外，观察到大约 3200% 的恢复，与控件在统计学上没有差异。然而，当参考应变与竞争对手应变2一起孵育时，参考应变CU在五小时内明显低于控制中的2个CFO应变。此外，观察到大约4%的恢复率明显低于控制。
总之，这些数据表明，应变2出竞争参考株通过杀死其细胞。此过程中最重要的步骤是实现正确的起始比率，因为它可以显著影响结果。
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概述
本文介绍了一种基于培养的协议，用于表征细菌分离株之间的竞争性相互作用，特别是鱿鱼荧光弧菌。该方法允许研究人员探索这些相互作用如何影响混合细菌种群的空间结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细菌间竞争
- 细胞培养技术
背景
- 细菌利用各种机制进行竞争。
- 理解这些机制可以提供微生物生态学的见解。
- 表征相互作用可以帮助研究种群动态。
- 荧光蛋白和抗生素抗性基因用于鉴别。
研究目的
- 识别细菌菌株之间的竞争机制。
- 评估这些相互作用对种群结构的影响。
- 为微生物学研究人员提供可靠的协议。
使用的方法
- 使用编码抗生素抗性和荧光蛋白的稳定质粒。
- 从琼脂平板上刮取细胞并在肉汤中重新悬浮。
- 涡旋混合和移液以获得均匀的细胞悬液。
- 在混合培养物中视觉鉴别菌株。
主要结果
- 该协议有效地区分细菌菌株。
- 可以在混合培养环境中表征竞争性相互作用。
- 种群的空间结构受这些相互作用的影响。
- 结果可以为进一步研究细菌生态学提供信息。
结论
- 所呈现的方法简单且可靠，用于研究细菌竞争。
- 它增强了对细菌间动态的理解。
- 未来的研究可以基于这些发现探索生态学影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
This coincubation assay enables biopharma R&D teams to quantitatively assess competitive interactions between bacterial strains, supporting target validation in antimicrobial discovery. By distinguishing bactericidal versus bacteriostatic outcomes and contact-dependent versus diffusible mechanisms, the method provides mechanistic de-risking early in lead identification. The assay’s compatibility with fluorescent tagging and antibiotic selection allows integration into high-throughput screening workflows for prioritizing compounds that modulate interbacterial competition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying strain-specific competitive outcomes in co-culture.
- Operational Value: Uses dual fluorescent and antibiotic markers for unambiguous discrimination of competing populations without genetic manipulation of native traits.
- Predictive Value: Distinguishes killing from growth inhibition, informing mechanism-of-action classification for antimicrobial candidates.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative CFU recovery and spatial imaging data suitable for automation in multi-well formats.
- Reproducibility: Standardized starting ratios and serial dilution protocols ensure consistent quantification across biological replicates.
- Scalability: Compatible with 24-well and 96-well plate formats for dose-response or strain-panel screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports evaluation of antimicrobial candidates in pathogen-competitor co-culture models that mimic niche environments.
- Translational Continuity: Links in vitro competition outcomes to predictive confidence in in vivo efficacy by identifying strains with competitive dominance.
- Risk Mitigation: Identifies false positives where apparent activity stems from competitive exclusion rather than direct antimicrobial action.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, informing lead identification by validating whether observed antimicrobial effects result from direct compound action or altered competitive fitness.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring shifts in strain proportions under competitive pressure, de-risking mechanism-based hypotheses.
- Screening: Outputs CFU counts and fluorescence ratios as quantitative endpoints for hit confirmation and structure-activity relationship studies.
- Analytics: Log RCI calculations provide normalized, statistically comparable metrics for cross-condition benchmarking.
- Translational Research: Enables assessment of whether lead compounds shift competitive balance in favor of desired microbiota, supporting microbiome-modulating therapeutic strategies.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based tagging system allows reuse across multiple bacterial species with minimal reoptimization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in antimicrobial screening by distinguishing direct inhibition from competitive exclusion.
- Operational Value: Employs widely accessible tools (fluorescence microscopy, plate readers, standard antibiotics) minimizing specialized equipment needs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating target-mediated effects in ecologically relevant contexts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of leads that demonstrate specific competitive modulation over broad cytotoxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, fluorescence microscopy, and CFU quantification techniques.
- Dependent on availability of fluorescent protein and antibiotic resistance plasmids compatible with target strains.
- Necessitates optimization of starting OD ratios for each strain pair to ensure accurate competitive fitness measurements.
- Adaptation to new species may require validation of plasmid stability and antibiotic selection efficacy.
- Practical limitation: Assay duration (5–24 hours) may not capture slow-acting or biofilm-mediated competitive mechanisms.
