Name: 大鼠中位神经再生评价的功能与生理方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 学习大鼠中位神经损伤模型建立与修复技术，通过抓握测试、针刺测试等行为学方法及电生理测量评估功能恢复。该方案为周围神经再生研究提供可靠的非侵入性评价手段。

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Diogo Casal 收到了由葡萄牙卡洛斯·古尔本基安基金会、尚帕利莫德基金会、卫生部以及科学技术基金会共同资助的“先进医学教育项目”的资助。作者非常感谢 Filipe Franco 先生为图1提供的示意图。作者感谢 Alberto Severino 先生在视频拍摄与编辑过程中提供的技术支持。最后，作者感谢 Sara Marques 女士在动物获取与饲养相关的各项后勤事务中所提供的帮助。

所有涉及动物受试者的实验程序均经葡萄牙里斯本新诺瓦大学医学院机构动物护理与使用委员会及伦理委员会批准（08/2012/CEFCM）。
1. 正中神经手术
注意：手术过程中应遵循无菌操作技术。使用个人防护装备（PPE），并穿戴无菌手术衣17。手术前对所有必需的手术器械进行高压灭菌（参见材料表）。
<ol>
	<li>使用12周龄的Wistar大鼠。术前7天给予自由进食和饮水，并保持12小时光照-12小时黑暗循环。麻醉前称量大鼠体重，以确定所需麻醉剂的剂量。</li>
	<li>用氯胺酮（40–80 mg/kg 体重）和赛拉嗪（5–10 mg/kg 体重）混合物对大鼠进行腹腔注射麻醉。通过夹捏足趾无反应以及在整个操作过程中观察呼吸频率来判断麻醉深度。18,19若观察到呼吸频率超过110次/分钟或对脚趾夹捏出现运动反应，则应给予额外镇痛处理18,20.</li>
	<li>皮下注射1 mg/kg美洛昔康以提供预先镇痛20,21.</li>
	<li>为避免手术过程中发生角膜擦伤，应在双眼涂抹眼用凝胶。</li>
	<li>使用脱毛膏去除右侧内侧区域的毛发。脱毛完成后，用温热的生理盐水清洗以去除残留的脱毛膏17.</li>
	<li>将大鼠仰卧位放置于加热垫上。在手术区域涂抹含碘或氯己定的外科擦洗剂，作用至少15秒后用乙醇擦拭。重复此操作3次。确保擦洗剂与皮肤接触时间在手术开始前累计不少于2分钟。 
	注意：请联系您所在研究单位的感染控制部门，获取预防手术部位感染的替代方案19.</li>
	<li>覆盖手术区域17. 
	注意：所有操作均须在严格的无菌条件下进行19.</li>
	<li>用15号手术刀片切开右臂内侧和胸部区域的皮肤至深筋膜层。使用电灼器仔细灼闭任何出血的血管。</li>
	<li>使用电热烧灼器或钝头剪刀小心切开呈白色鞘状覆盖肌肉的臂筋膜，注意避免损伤臂内侧的血管和神经结构。</li>
	<li>在胸大肌末端附着处下方钝性打开剪刀，以分离胸大肌与深部的腋动脉、腋静脉以及臂丛终末分支。</li>
	<li>用电刀切开胸大肌止点。暴露并切断胸小肌。</li>
	<li>从腋部开始至肘部，钝性分离正中神经与肱血管及尺神经。这有助于暴露臂丛的不同终末分支，即正中神经、尺神经、桡神经、腋神经和肌皮神经。图2).</li>
	<li>按照下述方法将不同实验组分开。
	<ol>
		<li>创建 假手术 仅通过解剖运动神经元进行分组。</li>
		<li>创建 压榨 通过使用5号显微外科镊子或类似器械，在手臂中段对运动神经施加15秒的压迫进行分组22,23.</li>
		<li>创建 切除 使用显微手术剪在手臂部位的运动神经（MN）中央区域切除一段10 mm长的神经节段。用8/0尼龙缝线结扎神经近端残端，以阻止轴突再生。</li>
		<li>创建 移植物 使用后一步骤中所述的10 mm长的运动神经节段，并将其旋转180°。采用间断的10/0尼龙缝线将切断的运动神经近端和远端断端与神经移植物缝合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用间断的5/0尼龙缝线缝合皮肤伤口10,24.</li>
	<li>术后镇痛给予7 mL樱桃味对乙酰氨基酚与43 mL自来水混合液25 以获得50 mL塑料水瓶中浓度为4.48 mg/mL的溶液，供大鼠自由饮用3天25.</li>
</ol>
2. 饲养与物理治疗
<ol>
	<li>在手术前2–4周，让大鼠接触物理治疗设备，以确保其能更顺利、快速地适应运动环境。按照下述详细步骤进行训练。</li>
	<li>每天一次，将每只大鼠放入单独的物理治疗球内，随后将球置于障碍物较少的房间中，让大鼠自由行走并探索房间，持续半小时。</li>
	<li>将大鼠单独饲养在配备有跑轮的独立笼子中，以促进其运动锻炼。</li>
	<li>将4–5只动物组成一组，饲养于个性化的笼具中。通过添加梯子、绳索、跑轮及其他环境丰富化元件对笼具进行个性化设置。</li>
	<li>术后次日，将单只大鼠重新放回个性化笼具中。</li>
	<li>术后3天恢复物理治疗训练。</li>
</ol>
3. 功能测试
<ol>
	<li>在开始进行功能测试前一周，让大鼠熟悉将用作正向强化的食品奖励。在每次测试成功完成后，无论手术前后，均提供该奖励。在为期3周的初始训练期结束后，于手术后1周恢复所有测试。</li>
	<li>在傍晚进行测试，此时大鼠自然活动性更高。手术后1周恢复测试。</li>
	<li>进行抓握测试：将大鼠置于网格上，提起其尾巴，使其前肢抓住网格11,26。若大鼠能用双侧前肢抓住网格，则记为“阳性”；若大鼠无法用受伤侧前肢抓住网格，则记为“阴性”。 
	注：抓握测试阳性表明运动神经（MN）的功能成分正常工作16,27。</li>
	<li>进行针刺测试28,29。
	<ol>
		<li>制作一个带有4 mm × 4 mm方形网格图案的塑料平台，并用长21 cm的金属框架支撑该网格。</li>
		<li>将大鼠置于平台上，并用一个15.5 cm × 15.5 cm × 11 cm的透明塑料盒覆盖网格。等待数分钟，直至其正常活动（如探索行为和主要理毛行为）减少。</li>
		<li>当大鼠静止并以四足站立时，开始测试。</li>
		<li>借助镜子，将麻醉计（例如4号Von Frey纤维，弯曲力为25 g）穿过网格，刺入前肢掌面运动神经（MN）支配的皮肤区域（图1）。在每侧前肢交替重复评估5次，每次评估后等待数秒。</li>
		<li>检查Von Frey纤维是否弯曲30以确保正确评估。按以下标准评分回缩反应：“0”表示无回缩反应；“1”表示大鼠缓慢移开足部；“2”表示大鼠迅速对刺激产生反应并移开足部或舔舐足部。 
		注：若观察到行走或咬住纤维的行为，应重复刺激，因这些反应被视为模糊反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>训练阶段 
	注：建议在手术前3周内，每天傍晚在低光照环境下对大鼠进行训练。特别推荐对绳索攀爬、梯子横档和行走轨迹测试进行训练。可按前述顺序依次进行：先绳索攀爬测试，再梯子横档测试，最后行走轨迹测试。每次新测试前，允许同一只动物休息数分钟。
	<ol>
		<li>第一周，将大鼠放置在梯子/绳索/走廊的最后三分之一处，靠近箱子入口。通过轻触或轻拉其尾尖，引导动物向箱口移动。一旦大鼠进入箱子，给予食物奖励，并允许其休息数秒后再重复测试。每天重复5次，持续5天。</li>
		<li>第二周，将动物放置在梯子/绳索/走廊的中间三分之一处。重复步骤3.5.1的操作。</li>
		<li>第三周，将大鼠放置在梯子/绳索/走廊底部，即箱口的对侧。重复步骤3.5.1的操作，但仅在动物正确完成测试时才给予奖励。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行梯子横档测试。 
	注：该测试用于评估前肢力量、步态、放置能力和协调性31。
	<ol>
		<li>将大鼠置于梯子底部（120 cm × 9 cm × 2 cm，共18级横档，每级厚1.5 cm，间距4 cm），并轻触其尾部。确保梯子倾斜10˚，并通向一个深色木箱（31.5 cm × 35 cm × 35 cm）上尺寸为13.20 cm × 11 cm的开口。</li>
		<li>当大鼠开始攀爬梯子时启动计时器，当其鼻尖穿过箱口时停止计时。</li>
		<li>记录时间，并重复测试3次，每次间隔至少1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绳索攀爬 
	注：该测试用于评估抓握力量，其依赖于运动神经（MN）的恢复情况32。
	<ol>
		<li>将大鼠置于绳索底部，通过轻触其尾部促使其攀爬。动物开始攀爬时启动计时器，当其鼻尖穿过平台入口时停止计时。</li>
		<li>每次测试中，记录攀爬至平台所需时间以及受伤前肢在攀爬过程中打滑的次数。若动物在任务中未犹豫或未停止攀爬，则视为有效测试。任务正确完成后，给予大鼠零食奖励。</li>
		<li>记录时间，并重复测试3次，每次间隔至少1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>行走轨迹测试 
	注：该测试用于评估前肢运动功能的恢复33,34。
	<ol>
		<li>设置一个高度为16.5 cm、宽度为8.7 cm、长度为43 cm的封闭式步道装置。确保该步道通向一个黑色木箱（23 cm × 36 cm × 28 cm）侧壁上的矩形开口（8.8 cm × 8.2 cm）。配备一个可垂直滑动的门，以便快速关闭箱口，并设置一个可拆卸的顶盖以便取出大鼠33,34。</li>
		<li>在走廊地面铺设一张坐标纸。抓住大鼠尾巴，让其握住一支浸有亚甲蓝的画笔。将大鼠置于走廊入口，促使其走入箱内。从走廊地面取下坐标纸并重复测试，直至获得双侧前肢清晰的代表性足迹印迹。</li>
		<li>从获得的足迹中选择一组清晰连续的前肢足迹，以tiff或jpeg格式拍照，并使用开源软件FIJI35测量以下参数。 
		注：首先，利用坐标纸上的刻度校准每张图像（分析 | 设置比例尺）；其次，将每张图像转换为8位格式（图像 | 类型 | 8位）。随后，使用矩形选区工具选择足印，裁剪图像（图像 | 裁剪）。在每张图像中，通过设定阈值突出足印并去除背景（图像 | 调整 | 阈值）。
		<ol>
			<li>通过测量足印面积来计算站立因子。使用矩形选区工具选择足印，然后按Control + M。</li>
			<li>通过测量足印最长长度来计算足印长度因子（在步骤3.8.3.2–3.8.3.6中，使用直线选区工具选择两个最远点，然后按Control + M）。</li>
			<li>通过测量足印最宽处宽度来计算指间距因子。</li>
			<li>通过测量第二和第三指之间最宽距离来计算中间指间距因子。</li>
			<li>通过测量同一侧连续足印同源点之间的距离来计算步长。</li>
			<li>通过测量足印中心部分与运动方向之间的垂直距离来计算支撑基底宽度29,33,36。 
			注：最后两项测量应在两对具有代表性的连续双侧足印上进行33。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 生理学测量
<ol>
	<li>红外热成像（IRT）37,38,39。
	<ol>
		<li>使用热分辨率为 0.1 °C 的普通数字温湿度计，确保进行测量的房间温度维持在 18 °C–25 °C 之间。确保环境中无显著热源（例如计算机或冰箱）。</li>
		<li>将大鼠提前 2 小时带入评估室以适应环境。实验开始前，按照前述方法（步骤 1.3–1.6）或根据机构的方案对大鼠实施麻醉。在开始实验前，通过夹捏脚趾检查大鼠是否无反应。</li>
		<li>在图像采集前 15 分钟开启红外热成像相机，并在评估过程中保持开机状态。将相机的发射率参数设置为与大鼠皮肤相匹配（ε = 0.98）37,40,41。</li>
		<li>将大鼠仰卧置于清洁且稳定的聚乙烯海绵表面上。确保周围无反射性材料或其他可能引起伪影的干扰源。使用双面胶带小心固定前肢，使其处于旋后位。将数字体温计插入直肠内 2 cm，以在所有评估期间监测大鼠的核心体温。</li>
		<li>将热成像相机保持与大鼠体表呈 90° 角，距离为 30 cm。对准整个动物身体进行聚焦。采集三幅相隔 30 秒的红外热成像图像。</li>
		<li>将采集的热图传输至计算机，并使用分析软件进行处理。在神经支配区域（MN）的足底区域（例如第一掌骨足垫中心）定义一个固定的矩形感兴趣区域（例如 9 x 11 像素），用于测定双侧前肢足底表面的温度（图 1）。使用免费的 FLIR Tools 软件，通过双击选中热图。在左侧工具栏中选择“添加方框测量工具”按钮，在双侧前肢足底区域绘制 9×11 像素的矩形。调整矩形时可确认其像素尺寸。对双侧前肢均执行此操作。在图像右侧查看最高温度、最低温度和平均温度。</li>
		<li>在先前绘制的感兴趣区域上右键点击并选择导出。导出该区域的平均温度、最高温度、最低温度以及温度矩阵至 .csv 文件。这些数据后续可通过数据分析软件进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电神经肌电图（ENMG）评估
	<ol>
		<li>设置电刺激器。使用一对一次性针灸针（0.25 mm × 25 mm），其间距为 25 mm，阻抗极低[&#60;1 Ω]，用胶带固定以制作刺激电极。将刺激器和电极连接至数据采集单元，以接收信号并将其转换为可由计算机软件处理的数字信号。</li>
		<li>在相同房间内进行评估，并始终在相同的受控环境条件下进行42,43,44。在开始数据采集前，夹捏前肢以确认大鼠已处于深度麻醉状态。 
		注：深度麻醉至关重要，可最大限度减少大鼠自发性随意或不随意运动带来的变异性43。</li>
		<li>按照步骤 1.8–1.13 所述，在手术显微镜下暴露双侧 MN。使用 15 号手术刀片沿前臂腹侧正中切口延长肱部切口。</li>
		<li>使用虹膜剪钝性分离前臂筋膜，暴露指浅屈肌的浅表部分。将接地针插入左侧后肢股四头肌，以连接信号接地插口。</li>
		<li>从右侧前肢开始，将记录电极插入前肢指浅屈肌肌腹，将刺激电极置于 MN 损伤部位近端。用生理盐水润湿这些电极。</li>
		<li>确保软件设置如下：通道输入端口 1（CH1）— 刺激器设置为 0–10 V；通道输入端口 2（CH2）— 肌电图（EMG）设置为 30–1,000 Hz。初始刺激幅度设为 10 mV，记录复合肌肉动作电位（CMAPs），采样率为 50 kHz，持续时间为 40,000 ms。以 10 mV 为步长逐步增加刺激幅度，直至达到 2,000 mV。对左侧前肢重复相同操作42,43,44。 
		注：信号被放大 1,000 倍，并使用 30–1,000 Hz 带通滤波器进行滤波。刺激输出设置为单脉冲，持续时间为 1 ms42,43,44。</li>
		<li>在记录设备软件中打开已记录的文件。 
		注：默认情况下，屏幕上方以红色显示两个窗口为刺激器脉冲，下方以蓝色显示记录的 ENMG 信号。滑动时间轴下方的水平滚动条可查看完整记录。面板右下角有两个主要工具：缩放工具和I 形光标工具。使用缩放工具可优化 CMAPs 的可视化效果并探索图形。为确保屏幕显示适配良好，缩放后可能需要调整显示。为此，请选择显示|自动缩放波形。I 形光标工具可用于选择图形中的特定区域并执行所需测量。图形上方有三个小窗口用于显示测量值。P-P显示所选区域的平均电压幅值（在刺激器记录和 ENMG 中均适用），而Delta-T显示该选择的时间间隔。</li>
		<li>使用软件插件“EMG 中 MUAP 和动作电位的无监督分类工具箱”45中的同名测量工具，测量复合肌肉动作电位（CMPAs，见表 1）的参数。</li>
		<li>对每只大鼠，确定一个最小刺激电压值，超过该值后 CMAPs 幅值不再进一步增加。从 0.05 mV 的刺激开始，依次以 0.05 mV 的增量逐步增加刺激电压。</li>
		<li>在此电压基础上增加 20% 的刺激强度，以获得超最大刺激值。</li>
		<li>在确定该值并施加相应刺激后，记录下一个 CMAPs 参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>屈曲力量评估
	<ol>
		<li>使用与步骤 4.2 相同的刺激器和刺激电极对 MN 进行电刺激。将输入通道 CH1 设置为刺激器（0–10 V），输出参数设置为持续 30 秒的刺激，脉冲持续时间为 1 ms，频率为 1 Hz。将分辨率为 d = 0.001 N 的测力计连接至计算机。 
		注：可通过计算机上已安装并与测力计连接的软件绘制力-时间曲线（N/s），实现实时数据可视化46。</li>
		<li>按照步骤 4.1.4 所述放置大鼠。将 5/0 丝线环穿过双侧前肢的第二骨间区。将线环连接至测力计挂钩，并使前肢与测力计对齐，避免缝线承受过度张力。</li>
		<li>用胶带固定对侧前肢，以避免其运动对测力计读数造成干扰。</li>
		<li>点击归零按钮，将测力计归零。</li>
		<li>调节刺激器电压旋钮，设置为 1.5 V 的超最大刺激幅度。</li>
		<li>在 PC 上打开 AFH-01 软件。打开“设备”选项卡，选择设备FH5。创建一个新文件（默认名称为“Measurements1”），并重命名该文件。</li>
		<li>将电极置于 MN 的近端部分，点击程序底部的播放按钮，记录 30 秒内测力计上的拉力。</li>
		<li>将获得的数值导入数据分析软件。计算每次评估中力量-时间曲线的最大值、平均值及曲线下面积（AUC）。</li>
		<li>对左侧前肢重复上述操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌肉重量
	<ol>
		<li>在全身麻醉下通过放血法处死大鼠47,48。</li>
		<li>使用 15 号手术刀片，从双侧前臂分离桡侧腕屈肌，从其起点至远端肌腱止点完整解剖取出该肌肉。</li>
		<li>使用精密天平称量肌肉重量9,49。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在大鼠中建立不同类型运动神经元损伤及修复的实验方案。此外，还阐述了如何通过多种无创行为学测试和生理学测量方法来评估该神经的功能恢复情况。
值得注意的是，本文所述的若干功能测试（特别是梯子行走测试和绳索测试）在很大程度上依赖于大鼠执行任务的意愿，其前提是能够获得食物奖励51,52,53。应当注意，某些大鼠品系在这一类测试中更易于训练，并能表现出更稳定的可重复性51,52,53。例如，Lewis 大鼠在训练阶段及后续测试中均表现较差51,52,53。
大鼠饲养环境应允许其充分自由活动，以符合其自然探索行为，同时使实验动物能够熟悉功能测试中存在的一些元素19。因此，本文展示了多种可提供更高活动自由度的饲养方式。大型笼具配备有丰富环境的装置，这些装置随后也将在功能测试中使用（例如绳索和梯子）。
可以说，这些丰富的环境元素，以及配备跑轮的笼具和个体训练空间，为外周神经系统手术后的动物提供了类似于人类患者术后所接受的物理治疗形式10。
值得注意的是，尽管一些作者主张钝性分离皮下组织和肌肉筋膜，或使用15号手术刀进行干净切割，但在分离这些结构时建议使用电热法，以尽量降低术后血肿的风险。
需要注意的是，已有多种测试方法被设计用于评估大鼠周围神经修复的不同方面，即轴突再生、靶器官再支配和功能恢复，其中一些方法超出了本研究的范围29,54,55,56。例如，运动学分析29,36,55和组织形态学评估29,36,57已被多位研究者广泛采用。此外，其中一些测试方法还存在多种变体，以最大限度地提高效率和/或可重复性54。例如，机械性痛觉测量（即对机械性疼痛刺激反应的评估）可通过特定的von Frey纤维丝进行定性评估（如本文所述），也可通过依次增强强度的von Frey纤维丝进行半定量评估，甚至可通过电子设备进行定量评估，后者通过施加逐渐增加的压力直至观察到回缩反应为止30,54。
同样，尽管一些研究者采用足迹分析来评估大鼠前肢神经修复情况，但另一些研究者认为，单个运动神经元损伤往往难以产生可重复的足印变化10,58,59。此外，有研究指出，这些足印变化可能与肌肉功能恢复程度并不成正比10,60。鉴于上述问题，部分研究者建议，足迹分析主要用于评估神经 crush 损伤后的前肢功能恢复，而非节段性神经重建后的恢复情况10,50,61。
抓握试验被广泛用于评估受运动神经元（MN）支配的肌肉的运动功能恢复情况16,27。为了确保该试验所获得数据的一致性和可重复性，建议采用Bertelli等人提出的成熟方法进行抓握试验16。然而，本方案的不同之处在于，通常不固定对侧爪子，以避免造成不必要的应激11,27。还应注意的是，其他研究者在固定未受伤爪子后，会使用测力计或秤对抓握试验进行定量评估27,56。然而，这种定量评估可能受到研究人员施加于大鼠尾部力量的影响26。此外，难以区分由指屈肌（在大鼠中仅由MN支配，是抓握试验的评估对象9）产生的力量与腕屈肌产生的力量，后者包括接受尺神经支配的尺侧腕屈肌9,10,27。为了尽量避免这些潜在偏差，本方案采用一种类似于医学研究委员会（Medical Research Council Scale）的等级评分法，后者常用于评估人类肌肉力量10,11,62。此外，其他研究者也描述了通过视频分析和基于视频的评分系统对抓握功能进行详细评估的方法11,63。
与坐骨神经相比，使用肌膈神经（MN）的一个潜在缺点是关于后者的文献资料更为丰富。这反过来可能使得将采用MN获得的数据与以往的实验研究结果进行比较更加困难46,48,64。此外，由于MN的尺寸较坐骨神经更小，手术操作也更具挑战性8,12,27,56,65。
与本文所述方法不同，神经电图评估可使用置于前臂和大鱼际区域的经皮单极电极进行51。尽管该方法侵入性较小，但由于存在刺激前臂区域尺神经而导致混淆的可能，因而具有一定风险9,51。
大多数作者认为，并非所有在大鼠中使用的研究方法都能得出一致的结果，因为周围神经修复依赖于一系列复杂的因素，包括神经元存活、轴突延伸与修剪、突触形成、成功重新支配失神经支配的感觉器官和运动单位，以及大脑可塑性7,10,50,66,67。
最后需要指出的是，啮齿类动物模型存在一个显著的局限性，即大鼠的外周神经比相应的人类结构更靠近终末器官，且横截面积要小得多。然而，这种尺寸差异保证了在啮齿类动物中能更快获得实验数据，与人类相比，大鼠的整体实验结果也更理想68。事实上，已有若干作者警示，在将啮齿类动物外周神经修复实验所得数据外推至人类时必须谨慎对待7,69。灵长类动物模型被认为更具可比性70。然而，其应用伴随着棘手的伦理、后勤和预算限制71。
尽管坐骨神经是外周神经研究中最常用的神经，但大鼠肌神经（MN）具有多种优势。例如，MN损伤与较低的关节挛缩发生率以及患肢自残行为相关11,12,16,56。值得注意的是，坐骨神经横断术后继发的自残行为会影响11–70%的大鼠，这可能导致诸如坐骨神经功能指数等现有评估方法无法实施14。进而，这使得为达到特定统计效能所需动物数量的估算变得复杂15。
此外，由于肌皮神经（MN）比坐骨神经短，因此可更早观察到神经功能的恢复58,72,73,74,75,76。此外，肌皮神经未被肌肉组织覆盖，其解剖操作在技术上比坐骨神经更容易16。另外，肌皮神经在上臂的走行与尺神经平行，因此尺神经可方便地用作修复肌皮神经损伤的移植神经。最后，在人类中，大多数周围神经损伤发生在上肢，这进一步支持在大鼠中使用该神经作为研究模型77,78。
可以说，啮齿类动物是外周神经修复研究领域中最常用的实验动物48,79。如前所示，大鼠运动神经（MN）是研究外周神经损伤与修复的便捷模型。事实上，目前已有多种标准化策略可用于评估运动和感觉功能的恢复情况，从而更便于对结果进行比较36,46,60,80,81,82。其中许多方法具有非侵入性，可实现每日评估。
此外，物理治疗是周围神经损伤患者护理标准的一部分。正如本文所示，有多种策略可为接受运动神经（MN）损伤的实验大鼠提供类似术后物理治疗的环境4,5。因此，该模型特别适用于模拟临床情况，有助于将研究结果外推至人类12,27,48,56,58,83。
如本文所示，在大鼠的运动神经（MN）模型中，存在多种标准化策略可用于评估运动和感觉功能的恢复。这些策略大多数为非侵入性操作，可实现频繁评估。此外，由于人类的周围神经损伤多发生于上肢，上述实验性物理治疗设置能更恰当地模拟临床情况下的功能恢复。这在一定程度上有助于将研究结果外推至人类，进一步验证在大鼠中使用该神经模型的合理性。

周围神经损伤常由创伤、感染、血管炎、自身免疫、恶性肿瘤和/或放射治疗引起1,2。遗憾的是，周围神经修复在临床上仍表现出不可预测且常常令人失望的结果3,4。目前普遍认为，仍需开展大量基础和转化研究，以改善受影响患者的预后4,5,6,7。
大鼠的正中神经与人类的正中神经具有高度相似性8,9（图1）。该神经起源于腋区的臂丛神经，沿臂部内侧下行至肘部，再分支支配前臂掌侧室的大部分肌肉。正中神经继续延伸至手部，支配大鱼际肌、前两个蚓状肌，以及部分大鼠手部皮肤9（图1）。
利用大鼠的肌皮神经（MN），可以充分模拟人类的周围神经损伤10,11,12。与常规使用的坐骨神经相比，该神经在研究中具有多项潜在优势。由于MN位于大鼠的前肢（类似于人类的上肢），其实验性损伤对大鼠整体健康状况的影响远小于坐骨神经损伤，因为坐骨神经支配着后肢的大部分区域13。此外，在人类中，大多数临床神经损伤发生在上肢，这与大鼠的前肢相对应10,11,12,14,15,16。
本文介绍了如何在大鼠中制造不同类型的运动神经（MN）损伤。此外，还展示了模拟术后物理治疗的多种方法。最后，描述了评估运动神经功能恢复的测试方法。目前已有多种标准化策略可用于评估运动和感觉功能的恢复，这些策略基于外周神经损伤与修复的运动神经模型，从而便于对结果进行直接比较。运动神经模型特别适用于模拟临床情况，有助于将研究结果外推至人类。

<table><tbody><tr><td>对乙酰氨基酚</td><td>亚马逊</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Childrens-Tylenol-grape-flavor-ages/dp/B0051VVVZG</td></tr><tr><td>Acland钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>00398 V</td><td>http://www.merciansurgical.com/aclandclamps.pdf</td></tr><tr><td>Acland单侧夹持钳 B-1V（一对）</td><td>精细科学工具</td><td>396</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>Biogel 外科手套</td><td>Medex Supply</td><td>30465</td><td>https://www.medexsupply.com</td></tr><tr><td>BSL 分析</td><td>BIOPAC系统</td><td></td><td>https://www.biopac.com/</td></tr><tr><td>Castroviejo持针器</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td>http://s-andt.ne</td></tr><tr><td>钳夹施加器</td><td>Fine Science Tools</td><td>CAF-4</td><td>http://www.merciansurgical.com/acland-clamps.pdf</td></tr><tr><td>恒压刺激器</td><td>BIOPAC 系统</td><td>STM200</td><td>https://www.biopac.com/product/constant-voltage-stimulator-unipolar-pulse/</td></tr><tr><td>Cutasept 皮肤消毒剂</td><td>Bode Chemie</td><td></td><td>http://www.productcatalogue.bode-chemie.com/products/skin/cutasept_f.php</td></tr><tr><td>Dafilon 10-0</td><td></td><td>G1118099</td><td>http://www.bbraun.com/cps/rde/xchg/bbraun-com/hs.xsl/products.html?prid=PRID00000816</td></tr><tr><td>德福持针器 12 cm TC</td><td>Fine Science Tools</td><td>703DE12</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>干热灭菌器</td><td>Quirumed</td><td>2432</td><td>http://www.quirumed.com/pt/灭菌材料/灭菌器</td></tr><tr><td>测力计</td><td>SAUTER</td><td>FH5</td><td>https://www.sauter.eu/shop/zh/measuring-instruments/force-measurement/FH-S/</td></tr><tr><td>神经电生理检查设置</td><td>BIOPAC系统</td><td>MP36</td><td>https://www.biopac.com/product/biopac-student-lab-basic-systems/</td></tr><tr><td>Ethilon 5-0</td><td></td><td>W1618</td><td>http://www.farlamedical.co.uk/</td></tr><tr><td>FLIR 软件</td><td>FLIR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Graeffe 钳，0.8 mm 尖端，弯曲</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td>http://www.finescience.de</td></tr><tr><td>坐标纸</td><td>安巴尔</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热灯 HL-1</td><td>哈佛仪器公司</td><td>727562</td><td>https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613</td></tr><tr><td>肝素钠溶液（Heparin LEO 10000IU/ml）</td><td>通用药房</td><td></td><td>http://www.universaldrugstore.com/medications/Heparin+LEO/10000IU%2Fml</td></tr><tr><td>高温电烙术</td><td>Fine Science Tools</td><td>AA03</td><td>http://www.boviemedical.com/products_aaroncauteries_high.asp</td></tr><tr><td>恒温毯系统配柔性探头</td><td>哈佛仪器公司</td><td>507220F</td><td>https://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/haisku3_10001_11051_39108_-1_HAI_ProductDetail_N_37610_37611_37613</td></tr><tr><td>红外相机</td><td>FLIR</td><td>E6</td><td>http://www.flir.eu/instruments/e6-wifi/</td></tr><tr><td>Instrapac - 阿德森有齿镊（超细）</td><td>Fine Science Tools</td><td>7973</td><td>http://www.millermedicalsupplies.com</td></tr><tr><td>虹膜剪 11.5 cm 弯型 EASY-CUT</td><td>Fine Science Tools</td><td>EA7613-11</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮/盐酸赛拉嗪溶液</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>K113</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/k113?lang=zh&amp;&region=PT</td></tr><tr><td>Lacri-lube 眼用软膏 5g</td><td>表达化学家</td><td>LAC101F</td><td>http://www.expresschemist.co.uk/lacri-lube-eye-ointment-5g.html</td></tr><tr><td>14厘米直刃斜面剪刀 EASY-CUT</td><td>Fine Science Tools</td><td>EA7652-14</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Recropharma</td><td>Mobic</td><td>https://www.recropharma.com/product-pipeline/meloxicam</td></tr><tr><td>亚甲蓝溶液</td><td>Sigma- Aldrich</td><td></td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product</td></tr><tr><td>微型珠宝镊子 11 厘米直头 00108</td><td>Fine Science Tools</td><td>JF-5</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>微型珠宝商镊子 11厘米弯头 00109</td><td>Fine Science Tools</td><td>JFA-5b</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>微型牵开器</td><td>Fine Science Tools</td><td>RS-6540</td><td>http://www.finescience.de</td></tr><tr><td>显微剪刀 圆柄 15 厘米 直刃</td><td>Fine Science Tools</td><td>67</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>微血管扩张器 11 厘米 0.3 毫米尖端 00124</td><td>Fine Science Tools</td><td>D-5a.2</td><td>http://www.merciansurgical.com</td></tr><tr><td>Monosyn 5-0</td><td></td><td>15423BR</td><td>http://www.mcfarlanemedical.com.au/15423BR/SUTURE-MONOSYN-5_or_0-16MM-70CM-(C0023423)-BOX_or_36/pd.php</td></tr><tr><td>用于冲洗的生理盐水</td><td>Hospira, Inc.</td><td>0409-6138-22</td><td>http://www.hospira.com/zh/search?q=sodium+chloride+irrigation%2C+usp&amp;&fq=contentType%3A产品</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>徕卡外科显微系统</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/surgical-microscopes/</td></tr><tr><td>Skin Skribe 外科皮肤标记笔</td><td>摩尔医学</td><td>31456</td><td>https://www.mooremedical.com/index.cfm?/皮肤标记笔外科皮肤标记器/&amp;amp;PG=CTL&amp;amp;CS=HOM&amp;&FN=产品详情&amp;&PID=1740&amp;amp;spx=1</td></tr><tr><td>零食</td><td>Versele-Laga</td><td>完整克洛克-贝里</td><td>http://www.versele-laga.com/zh/complete/products/complete-crock-berry</td></tr><tr><td>直型蚊式止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td>http://www.finescience.de</td></tr><tr><td>手术铺巾</td><td>屏障</td><td>800430</td><td>http://www.molnlycke.com/surgical-drapes/</td></tr><tr><td>Veet 舒缓肌肤脱毛霜 芦荟和维生素E 100 ml</td><td>Veet</td><td></td><td>http://www.veet.co.uk/products/creams/creams/veet-hair-removal-cream-sensitive-skin/</td></tr></tbody></table>

评估大鼠正中神经再生的功能与生理学方法

Functional and Physiological Methods of Evaluating Median Nerve Regeneration in the Rat

本研究的主要目标是展示如何在大鼠中建立和修复不同类型正中神经（MN）损伤。此外，还介绍了模拟术后物理治疗的多种方法。通过采用多种标准化策略，利用周围神经损伤与修复的正中神经模型来评估运动和感觉功能的恢复情况，从而便于对结果进行直接比较。本研究包含多种选择，可为接受正中神经损伤手术的大鼠提供类似术后物理治疗的环境。最后，本文提供了一套评估正中神经功能恢复的方法，包括多种无创性测试（如抓握试验、针刺试验、梯格行走试验、攀绳试验和足迹分析）以及生理学检测指标（红外热成像、电神经肌电图、屈肌力量评估和桡侧腕屈肌重量测定）。因此，该模型特别适用于模拟临床情境，有助于将研究结果外推至人类。
尽管坐骨神经是周围神经研究中最常被研究的神经，但对大鼠肌皮神经（MN）的研究具有多种优势。例如，在MN损伤研究中，受累肢体发生关节挛缩和自残行为的发生率较低。此外，MN未被肌肉组织覆盖，因此其解剖比坐骨神经更为简便。另外，由于MN比坐骨神经短，其功能恢复出现得更早。同时，MN在上臂的走行与尺神经平行，因此尺神经可被方便地用作修复MN损伤的神经移植物。最后，大鼠的MN位于前肢，类似于人类的上肢；而在人类中，上肢是大多数周围神经损伤的发生部位。

总共34只大鼠被随机分为以下几组：假手术组（n = 17）、切除组（n = 17）和神经移植组（n = 10）进行手术。所有大鼠均顺利完成了手术及术后阶段。术后一周开始，在随后的100天内，所有动物每周接受一次上述功能测试。各项测试的代表性结果如下所述。
抓握力测试
抓握试验中呈阳性反应的大鼠百分比在以下组别中最高 假手术 组。该值在来自该组的大鼠中随时间逐渐增加 压碎 和 神经移植物 组（图3).
针刺试验
假手术组大鼠在累积针刺痛觉测试中的评分优于神经移植组大鼠。这两组的评分均优于切除组大鼠（图4）。
梯式跑步测试
大鼠在梯子跑步测试中的运动速度在 假手术 组相比，接受运动神经元损伤的大鼠跑过梯子所需时间较长。在后者中，跑梯时间随时间推移呈下降趋势，与运动神经元功能恢复相平行。图5).
绳索测试
与梯子行走实验类似，大鼠攀爬绳索所用的时间更短 假手术 组相比，坐骨神经损伤组的大鼠在该测试中的运动速度有所增加，当坐骨神经得到恢复时，大鼠的运动速度进一步提高（图6).
步态轨迹分析
行走轨迹分析往往显示出脚掌印形态的变化（图7）。这些变化在神经 crush 损伤中通常比在节段性神经缺损中更为明显50。
红外热成像
在术后前30天检查前爪之间的温度差异时，红外热成像技术非常有用。在坐骨神经损伤更严重的的大鼠中，温度差异更为明显，例如切除组的大鼠（图8 和 图9）。
神经电生理检查
表1总结了电神经肌电图测量的生物学意义，并提供了不同实验组的代表性结果。电神经肌电图观察到多种模式。假手术组大鼠表现为正常的复合肌肉动作电位（CMAP），而多相性CMAP则与运动神经元不同程度的损伤相关，如 crush组和神经移植组所示（图10）。在切除组中未观察到CMAP。
腕屈肌力
鉴于腕屈主要依赖于正中神经（MN），本测试用于评估该神经支配区域的运动功能恢复情况。当恢复达到最大程度时，腕屈肌力最接近正常水平图11).
肌肉重量与形态学
桡侧腕屈肌的重量和形态取决于运动神经元的恢复情况，因为该肌肉仅由运动神经元（MN）支配9,10。因此，Sham组中观察到正常的重量和肌肉形态。而在Crush、Nerve Graft和Excision组中均观察到肌肉重量减轻和营养不良（图12）。
<img alt="小鼠解剖图；突出显示神经和肌肉，包含详细的肢体和脊髓示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：大鼠正中神经解剖结构的示意图。 
（1）大鼠脑内正中神经的起始与终止部位（绿色区域 = 初级运动区；蓝色区域 = 初级感觉区）。（2）C7节段水平的脊髓横切面；（3）腋神经；（4）肌皮神经；（5）桡神经；（6）正中神经；（7）尺神经；（8）臂内侧皮神经；（9）前臂内侧皮神经；（10）腋动脉；（11）肱动脉；（12）正中动脉；（13）浅桡动脉；（14）尺动脉；（15）支配旋前圆肌的正中神经运动支；（16）支配桡侧腕屈肌的正中神经运动支；（17）支配指浅屈肌的正中神经运动支；（18）支配指深屈肌的正中神经运动支；（19）支配大鱼际区域的正中神经感觉支；（20）第一骨间区的掌侧共干动脉；（21）第一指掌侧指动脉；（22）支配大鱼际肌的正中神经运动支；（23）掌动脉弓；（24）第一指掌侧指神经；（25）第一指尺侧掌侧指神经；（26）第三骨间区的掌侧共干动脉；（27）正中神经终末分支支配前三条蚓状肌的运动支；（28）第二、第三和第四指的尺侧掌侧指神经；（29）第四和第五指的尺侧掌侧指动脉；（30）第二、第三和第四指的桡侧掌侧指神经；（31）第五指的桡侧掌侧指动脉；（32）前足部正中神经的皮肤分布区域（蓝色阴影区）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经解剖示意图：解剖学研究中的桡神经、正中神经、腋神经、尺神经和肌皮神经。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：大鼠右前肢照片，显示臂部和腋区正中神经的手术解剖结构。 
Cr，头侧；Me，内侧 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="生存分析图；大鼠术后恢复情况；假手术组、切除组、神经移植组比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：术后100天内不同实验组大鼠抓握试验呈阳性百分比。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="针刺测试结果的柱状图。比较假手术组、切除组和神经移植组在不同恢复天数下的表现。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过累积针刺测试结果评估手术侧前肢的伤害性感受，数据已标准化为对侧前肢，比较不同实验组之间的差异。 
竖直条表示 95% 置信区间。图上方的水平线表示实验组之间具有统计学显著性差异，***p&lt;0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="条形图比较假手术组、切除组和神经移植组术后30、45、60天的平均速度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：不同实验组在梯子行走测试中的平均速度。 
竖条表示95%置信区间。图上部的星号表示组间具有统计学显著差异，*p&lt;0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="术后恢复的爬行速度箱线图；绿色=假手术组，红色=切除组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：绳索测试中的平均攀爬速度 假手术 和 切除 组 
竖线表示 95% 置信区间。图中上方的星号表示组间具有统计学显著性差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。&lt;0.05；**p&lt;0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="步态分析柱状图，比较假手术组、切除组和神经移植组在术后第30天、第60天和第90天的时间点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：不同实验组的足印参数。 
患肢的数值以对侧肢体均值的百分比表示。（A）站立相因子；（B）足印长度；（C）足趾展开因子；（D）中间足趾展开因子；（E）步长；（F）支撑基底宽度。竖直条表示95%置信区间。图上方的水平线表示实验组之间的统计学显著差异。D30、D60、D90 = 术后第30、60和90天，*p&lt;0.05；**p&lt;0.01；***p&lt;0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="术后30、60、90天假手术组与切除组体温变化对比图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：红外热成像记录的平均温度差异。 
箱形图显示了Sham组（n = 17）和Excision组（n = 17）中，手术侧（右侧，正中神经掌侧区域）与对侧（左侧）之间的温度差异，*p&lt;0.05；**p&lt;0.01。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示术后恢复的热成像；45天内的温度变化；热图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig09.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 9"> 
图9：切除组动物术后前45天内的典型红外热成像模式。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="CMAP模式图；假手术组与神经移植组对比；电生理学分析；正常、多相性信号" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：复合肌肉动作电位的典型模式 (复合肌肉动作电位) 来自一只动物的 假手术 和 神经移植物 术后90天的各组 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="腕屈肌力 AUC 比较柱状图；假手术组、切除组、神经移植组；实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 11"> 
图 11：不同实验组术后 90 天双前肢腕屈肌力的评估。 
通过 30 秒时间内的曲线下面积（AUC）并采用超强刺激法评估腕屈肌力。垂直线表示 95% 置信区间。图上方的水平线标示组间具有统计学显著性差异，**p&lt;0.01。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="假手术组、切除组、神经移植组的肌肉重量分析图及组织对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59767/59767fig12.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图12"> 
图12：桡侧腕屈肌肌肉重量及术后100天的大体外观。 
(A) 箱形图显示不同实验组中标准化的桡侧腕屈肌肌肉重量，**p&lt;0.01；***p&lt;0.001。(B) 假手术组与切除组右侧和左侧肌肉的实物照片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59767/59767fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>参数意义</td>
			<td>假手术组</td>
			<td>切除组</td>
			<td>NG组</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经刺激阈值 (%)</td>
			<td>评估神经再生情况，因为需要一定数量的神经纤维才能产生复合肌肉动作电位（CMAP）或可见的肌肉收缩12</td>
			<td>281.63 ± 271.65</td>
			<td>5359.98 ± 3466.52</td>
			<td>2108.12 ± 2115.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>运动刺激阈值 (%)</td>
			<td>评估神经再生情况，因为需要一定数量的神经纤维才能产生复合肌肉动作电位（CMAP）或可见的肌肉收缩12</td>
			<td>462.52 ± 118.91</td>
			<td>1694.10 ± 503.24</td>
			<td>1249.50 ± 503.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>潜伏期 (%)</td>
			<td>评估最快神经纤维（即最大有髓纤维）的神经传导速度44</td>
			<td>113.55 ± 25.04</td>
			<td>N/A</td>
			<td>132.80 ± 69.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经肌肉传导速度 (%)</td>
			<td>评估最快神经纤维（即最大有髓纤维）的神经传导速度44</td>
			<td>92.01 ± 20.88</td>
			<td>N/A</td>
			<td>91.30 ± 26.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMAP波幅 (%)</td>
			<td>评估重新支配的运动单位数量34</td>
			<td>110.63 ±45.66</td>
			<td>N/A</td>
			<td>41.60 ± 24.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMAP持续时间 (%)</td>
			<td>评估肌肉神经支配的同步性，该指标取决于肌肉再神经支配程度以及支配运动纤维的髓鞘化程度44,45</td>
			<td>101.12 ± 23.92</td>
			<td>N/A</td>
			<td>151.06 ± 54.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">NG，神经移植物 
			CMAPs，复合肌肉动作电位 
			N/A，不适用 
			所有参数均表示为对侧平均值的百分比 
			数值变量以平均值 ± 标准差表示</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：实验结束时的神经肌电图评估。

本文介绍了一种在大鼠中制备不同类型正中神经（MN）损伤及修复的实验方案。此外，该方案还展示了如何通过多种非侵入性行为学测试和生理学测量方法来评估神经功能的恢复情况。

本研究的主要目标是展示如何在大鼠中建立和修复不同类型的正中神经（MN）损伤。此外，还可采用不同……

利用大鼠的正中神经，可以充分模拟人类的周围神经损伤。临床上，大多数此类损伤发生在上肢，这支持了使用该实验模型的合理性。本文将介绍如何在大鼠中制造不同类型的正中神经损伤。此外，我们将演示如何通过多种测试评估该神经的功能恢复情况。正中神经起源于脊髓节段 C6 至 T1。正中神经以绿色高亮显示。在本视频中，出于演示目的未使用手术巾。手术过程中请使用手术巾。切开右臂内侧及胸肌区域的皮肤，直至深筋膜平面。仔细结扎出血的血管。接下来，仔细切开臂部内侧的臂筋膜，注意不要损伤血管和神经结构。用一把剪刀在胸大肌远端止点下方钝性分离，将该肌肉与其深面的腋动脉、腋静脉以及臂丛的终末分支分开。随后用电凝刀切断胸大肌的止点。随后暴露并切断胸小肌。将正中神经从臂丛血管及尺神经上钝性分离，直至肘部区域。此时可观察到臂丛的不同终末分支，即正中神经、尺神经、桡神经、腋神经和肌皮神经。在暴露并分离正中神经后，可诱导产生不同的机械性损伤。通过仅对正中神经进行解剖，可建立假手术组。在挤压组中，使用显微外科镊子对正中神经进行压迫，持续15秒。切除组通过切除一段长度为10毫米的正中神经形成。正中神经的近端残端使用8-0尼龙缝线结扎，以防止轴突再生。或者，也可将切除的神经段旋转180度，用作自体神经移植材料。在此情况下，将正中神经断端的近端和远端残端使用10-0尼龙缝线缝合至神经移植物上。物理治疗是周围神经损伤患者康复护理的标准组成部分。对于接受正中神经损伤手术的大鼠，存在多种术后物理治疗策略。选择年轻的实验大鼠，并在手术前让其接触物理治疗仪器，这一点非常重要。这有助于大鼠更顺利、更快速地适应运动训练环境。此外，物理治疗仪器应允许大鼠具有一定程度的活动自由，理想情况下能够使其前肢完成精细动作。物理治疗有多种实施方法。例如，可以使用单独的球体。将大鼠放入球体内，然后将其放置在障碍物较少的房间中。让它在房间内探索半小时，每天进行一次。大鼠也可单独饲养在各自的笼子中。配备有跑轮，大鼠可以随时根据自身需求进行任意量的运动。另一种方法是将大鼠分组饲养在较大的笼具中。使用皮革、绳索、跑轮和其他环境丰富化元素对笼子进行个性化设置。这些措施使大鼠拥有充分的活动自由，符合其自然的探索行为，并让大鼠逐步熟悉功能测试中将出现的部分装置元素。在进行功能测试之前，应先让大鼠熟悉你所选用的作为阳性强化物的食物奖励。在傍晚进行测试，此时大鼠自然活动更为活跃。首先进行抓握测试。将大鼠置于网格上，提起其尾部，使其能够抓住网格。当大鼠能够用双侧前爪以相似的力量抓住网格时，表明正中神经功能正常，抓握试验视为阳性。如果其无法用受伤的前爪抓住网格，则抓握试验视为阴性。进行针刺试验时，将大鼠放置于平台上，等待数分钟，直至其探索行为和主要的理毛活动减少。当大鼠静止并以前肢站立时开始试验。借助镜子，将Von Frey纤维从网格中插入，轻刺前肢掌面。在每只前爪上重复此操作五次，交替进行，每次评估后等待数秒。根据以下标准对回缩反应进行评分：无回缩反应记为零分；若大鼠缓慢将爪子从纤维丝移开，则记为一分；若大鼠迅速对刺激产生反应并抬起爪子或舔舐爪子，则记为二分。将大鼠置于梯子底部，轻轻触碰其尾部。当大鼠开始行走时启动计时器，当其鼻尖穿过箱子入口时停止计时。记录时间，并重复测试三次。将大鼠置于绳子底部，通过轻轻触碰其尾巴的方式诱导其向上攀爬。如果动物在完成任务过程中没有犹豫或停止攀爬，则视为测试有效。动物开始攀爬时启动计时器，当大鼠的鼻尖越过平台入口的瞬间停止计时。大鼠正确完成任务后给予零食奖励，并让其休息数分钟后再重复实验。在走廊地面上放置一张坐标纸。然后抓住大鼠的尾巴，使其握住浸有亚甲蓝的画笔，将其置于走廊入口处，使其走入箱内。从走廊地板上取下坐标纸，并重复测试，直到获得前后肢清晰且具有代表性的足印。从所得的足印中，选择一个前后肢连续印迹清晰的足印，并测量以下参数：足印长度、脚趾展开度、中间脚趾展开度和站立因子。最后测量两个连续足迹中第二脚趾之间的距离，即步幅长度。进行热成像评估时，在海绵上放置一小块双面胶。将大鼠置于其上，并按图示将前肢粘住。等待一分钟，以消除因接触大鼠足部而产生的热量交换。将相机以90度角、距离大鼠约30厘米处进行拍摄。采集两次图像。首先，拍摄一张全身热成像图，然后将相机靠近大鼠的上半身，拍摄第二张热成像图。从获得的热成像图中，找到与前肢掌部区域相对应的兴趣区域。测量双侧前肢该区域的平均温度、最低温度和最高温度值，并计算温度差异。为进行以下评估，按照之前所述方法暴露双侧正中神经。首先将大鼠仰卧放置，并将刚刚展示的电极插入皮肤。接地电极置于大鼠大腿部位，刺激电极和记录电极则置于左侧上肢。将记录电极置于指浅屈肌肌腹处，刺激电极大致置于正中神经位置。以10毫伏的刺激强度开始采集，随后以10毫伏为步长逐步增加，直至达到2伏。在采集过程中，记录出现手指首次可见屈曲时的刺激强度。这就是运动刺激阈值。能够引出复合肌肉动作电位（C.M.A.P.）所需的最小刺激强度，称为神经刺激阈值。最后，选择在超强刺激下产生的具有代表性的C.M.A.P.，并测量以下参数：潜伏期、波幅和持续时间。进行屈肌力量评估时，首先将一根5号或6号丝线缝合环穿过每只前爪的掌面区域，并留出5厘米长度。将大鼠仰卧位放置。从左前爪开始，将缝合线钩在测力计的钩子上，并使前爪与测力计对齐，注意不要对钩子施加过大的张力。将刺激电极放置在正中神经附近。调节刺激幅度至1.5伏，记录30秒内的瞬时力。根据获得的曲线图，分析最大力值、最小力值、平均力值以及曲线下面积。桡侧腕屈肌由正中神经支配，需双侧切除并用精密天平称重。关于部分代表性结果，在抓握试验中，假手术组大鼠出现阳性反应的百分比最高，而神经移植组大鼠的阳性反应率随时间逐渐升高。针刺试验结果显示，假手术组的得分高于移植组和切除组。在梯子行走实验中，假手术组大鼠的速度高于接受正中神经损伤的大鼠。在较轻的损伤情况下，随着正中神经的恢复，大鼠跑过梯子所需的时间 tends to 随时间减少。与梯子行走实验中观察到的结果类似，假手术组大鼠攀爬绳索所需的时间短于正中神经受损各组大鼠。在此项测试中，允许正中神经恢复的大鼠，其行走速度会增加。如这些柱状图所示，对行走大鼠的分析往往显示出足印形态的变化。这些变化在神经 crush 损伤中通常比在节段性神经缺损损伤中更为明显。该图显示，红外热成像在术后前30天内检测前爪之间的温度差异方面似乎是一种有用的工具。这些温度差异在正中神经损伤更严重的实验大鼠中更为明显，例如切除组的大鼠。大鼠的屈曲力量与神经恢复程度呈直接相关。当恢复达到最大时，最接近正常状态，这一点可以从这些条形图中看出，图中比较了切除组和神经移植组双侧前爪的力量。在神经电生理检查方面，可观察到多种模式。正常的复合肌肉动作电位（C.M.A.P.）是假手术组大鼠的典型表现。尽管多相性复合肌肉动作电位（C.M.A.P.）与正中神经不同程度的损伤相关，这种情况可见于压榨伤组和神经移植组；而在切除组中则不存在C.M.A.P.。桡侧腕屈肌的波形和形态取决于正中神经的功能恢复情况。这两幅图像分别显示了假手术组和切除组中这些肌肉的情况。如本文所示，大鼠正中神经是研究周围神经损伤与修复的便捷模型。目前已有多种标准化策略可用于评估运动和感觉功能的恢复情况，其中许多方法具有非侵入性，可实现每日评估。最后，实验性物理治疗设置可以模拟临床环境中的康复过程，有助于将研究结果推及至人类。

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