Name: 用心脏灌注和二固定仪对脑和垂体血管进行标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学习使用心脏灌注和DiI固定剂标记青鳉鱼脑与垂体血管的技术。该方法操作简便、快速高效，可揭示血管解剖结构及神经元与血管的关系，适用于多种硬骨鱼类研究。

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我们感谢Shinji Kanda博士在青鳉中演示用固定液进行心脏灌注，感谢Lourdes Carreon G Tan女士在青鳉饲养方面提供的帮助，以及Anthony Peltier先生提供的插图。本工作由挪威生命科学大学（NMBU）和挪威研究理事会资助，资助编号为248828（Digital Life Norway项目）。

所有动物操作均按照挪威生命科学大学关于实验动物护理与福利的建议进行，并在授权研究人员的监督下实施。
1. 仪器与溶液的准备
<ol>
	<li>在1.5 mL塑料管中，将5 mg DiI晶体溶于1 mL 96%乙醇（EtOH）中，配制DiI储存液。涡旋振荡30秒，并用铝箔覆盖避光保存。 
	注意：DiI储存液可在-20 °C避光条件下保存数月。</li>
	<li>通过将一块聚苯乙烯材料切割成5 cm长、3 cm宽、2 cm厚，并将其粘附至一个直径为9 cm的塑料培养皿上，制备鱼类固定装置（图1A）。使用手术刀片在聚苯乙烯上切出一个3 cm长的船形孔洞。</li>
	<li>在针头末端连接一段30–50 cm长的塑料导管，以构建灌流系统（图2）。</li>
	<li>在50 mL塑料管中，将10 mL 16%多聚甲醛溶液与30 mL磷酸盐缓冲液（PBS）混合，配制40 mL新鲜的4%多聚甲醛（PFA）溶液。</li>
	<li>在10 mL塑料管中，将1 mL DiI储存液加入9 mL新配制的4% PFA溶液中，配制10 mL固定液/DiI混合溶液。使用前需避光保存。 
	注意：未溶解的DiI晶体可保留在储存液管中，后续可添加新的乙醇以重新配制DiI储存液（见步骤1.1）。</li>
	<li>配制50 mL三卡因（MS-222）储存液。
	<ol>
		<li>将200 mg三卡因粉末溶于48 mL H2O中，加入2 mL 1 M Tris碱溶液（pH 9），用1 M HCl调节pH至7，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在小烧杯中，将5 mL三卡因储存液与50 mL清洁水混合稀释。</li>
	<li>按照制造商说明，使用拉管仪拉制玻璃毛细管，制备数根5 cm长的玻璃移液管（图2）。</li>
</ol>
2. 解剖与灌注
注意：PFA 是一种有毒的挥发性化合物，因此解剖和灌注操作应在通风橱或通风良好的房间内进行，操作者必须佩戴防毒面具。
<ol>
	<li>解剖前准备好解剖工具，包括小剪刀、一把尖头镊子和一把粗齿镊子。</li>
	<li>将注射器插入盛有PFA/DiI混合液的50 mL离心管中吸取溶液，完成填充。然后将带有套管的针头连接至注射器末端（图2）。</li>
	<li>使用多段胶带以不同方向将注射器固定在实验台面上，并调整显微镜和座椅位置，以获得适合进行解剖及用肘部按压注射器活塞的操作姿势（图1B）。 
	注意：本方案中使用肘部按压注射器活塞，但也可采用其他方式，例如由他人协助操作。</li>
	<li>将鱼放入步骤1.7中配制的过量三卡因溶液中实施安乐死。等待30秒后，用镊子夹住鱼的尾鳍测试其反射反应。当鱼不再对刺激产生反应时即可用于后续操作。</li>
	<li>将鱼腹面朝上置于鱼体固定装置中，用一根针固定头部末端，另一根针固定尾部上方，以稳定鱼体位置。</li>
	<li>用剪刀水平剪开腹部前方的表层皮肤，打开前腹部。</li>
	<li>使用镊子移除心脏上方的皮肤，直至清晰暴露心室和动脉球（图3）。</li>
	<li>将玻璃移液管连接至毛细管末端，并折断玻璃移液管尖端。 
	注意：折断后的尖端孔径应足够大以允许液体顺利流出，但仍需足够小以便轻松插入组织。若未断裂或堵塞，玻璃移液管可重复使用。</li>
	<li>将玻璃移液管靠近心室，并用肘部施加压力推动注射器活塞，使液体排出。</li>
	<li>在持续向注射器施压的同时，用玻璃移液管固定心室。</li>
	<li>紧接着，用镊子穿刺静脉窦，使血液能够从循环系统中流出。 
	注意：由于固定剂的作用，心室组织会变得更加脆弱；同时因血液被固定剂/DiI溶液稀释，颜色也会变浅。</li>
	<li>从心室开始，调整玻璃移液管的角度，寻找动脉球的入口。将移液管开口插入动脉球内（如图2所示），并继续对注射器施加压力。 
	注意：动脉球呈透明状，组织具有弹性。当DiI/固定剂替代血液时，心脏内的玻璃移液管会更加明显，且随着压力增加，动脉球体积应出现扩张。此步骤至关重要，用以确保已施加足够压力，使所有血管均被固定剂/DiI溶液充分灌注。成功时，PFA常引发肌肉收缩，导致鱼体出现运动。</li>
	<li>继续保持对注射器施压30–60秒，同时维持玻璃移液管位于动脉球内。</li>
	<li>移除鱼体上的玻璃移液管和固定针。</li>
	<li>解剖取出脑组织和垂体，并将组织置于新鲜的4% PFA PBS溶液中，在室温避光条件下固定2小时。 
	注意：脑和垂体的解剖方法此前已由Fontaine等26&#160;和Ager-Wick等27详细描述。由于固定作用，组织会变得较硬，脑与垂体之间的脆弱连接可能断裂。解剖后，也可在4 °C条件下进行过夜后固定处理。</li>
	<li>成像前用PBS冲洗组织两次，每次10分钟。 
	注意：随后可将组织置于载玻片与盖玻片之间，使用间隔垫片和封片剂进行共聚焦显微成像（见图4）；或如Fontaine等26&#160;所述，先用振动切片机进行切片，再置于载玻片与盖玻片之间，用于体视显微镜成像（见图4）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

先前已使用DiI进行心脏灌注以标记多种模式物种中的血管24，包括硬骨鱼类13。
由于DiI通过血管灌注直接递送至内皮细胞膜，因此可通过提高固定液中DiI的浓度来增强信噪比。此外，该荧光染料在激发时可产生强烈的染色信号，且光漂白程度较低，因而能够实现相对较长时间的荧光发射18,30。&#160;同时，标记信号可维持数天，并可与其他需要温和处理条件的标记技术联合使用，例如免疫荧光（IF）31。
然而，该技术存在一些局限性。组织从固定液中取出后，应尽快完成标记和成像操作，因为随着时间推移，标记强度会减弱，信号也会发生扩散（图8）。若使用可增加膜通透性的去垢剂，这一过程将更快发生。此外，由于PFA...

血管在脊椎动物体内发挥着至关重要的作用，因为它们为所有器官提供必需的营养物质、氧气和激素信号。此外，自从发现血管参与癌症发展以来1，它们在临床研究中受到了广泛关注。尽管已有大量研究探讨了血管生长和形态发生的机制，并鉴定出许多对血管形成至关重要的基因2，但关于细胞或组织与循环血液之间相互作用的许多方面仍有待深入理解。
观察脑和垂体中的血管系统非常重要。脑内的神经元需要大量的氧气和葡萄糖供应3，而垂体包含多达八种重要的激素分泌细胞类型，这些细胞依赖血流接收来自脑部的信号，并将其相应的激素输送至不同的外周器官4,5。在哺乳动物中，位于下丘脑底部、名为正中隆起的门脉系统连接了脑与垂体6，但在硬骨鱼类中尚未描述存在如此明确的血液通路。事实上，在硬骨鱼类中，前视-下丘脑神经元直接将其轴突投射到垂体的神经部7，并主要直接支配各种内分泌细胞类型8,9。然而，其中一些神经元的神经末梢位于血管外间隙，紧邻毛细血管10。因此，硬骨鱼类与哺乳动物之间的差异并不十分明确，硬骨鱼类中血管系统与脑及垂体细胞之间的关系仍需进一步研究。
斑马鱼在许多方面具有与其他脊椎动物物种在解剖结构和功能上相似的血管系统11。它已成为心血管研究中一种强大的脊椎动物模型，这主要得益于多种转基因品系的建立，这些品系中血管系统的组分被荧光报告蛋白标记12。然而，循环系统的精确解剖结构可能在不同物种之间，甚至在同一物种的两个个体之间存在差异。因此，对于尚无转基因技术工具的其他硬骨鱼类而言，血管的可视化也可能具有重要意义。
已有多种技术被用于标记哺乳动物和硬骨鱼类的血管系统，包括针对血管特异性基因的原位杂交、碱性磷酸酶染色、微血管造影以及染料注射（综述见13）。荧光脂溶性阳离子吲哚羰花青染料（DiI）最初被用于研究膜脂质的侧向流动性，因其可保留在脂双层中并能在其中迁移14,15,16。事实上，DiI分子由两条烃链和发色团组成。当烃链插入与其接触的细胞的脂双层细胞膜时，发色团则保留在其表面17。一旦进入膜内，DiI分子便在脂双层中进行侧向扩散，从而有助于染色那些未直接接触DiI溶液的膜结构。因此，通过心脏灌注注入DiI溶液，可标记所有与该化合物接触的内皮细胞，实现对血管系统的直接标记。如今，DiI还被用于其他染色目的，例如单分子成像、命运图谱绘制以及神经元示踪。值得注意的是，存在多种不同发射波长的荧光基团，可与其它荧光标记联合使用，且DiI的整合及其侧向扩散可在活体组织和固定组织中均发生18,19。
甲醛由费迪南德·布卢姆（Ferdinand Blum）于1893年发现，至今仍被广泛用作组织固定的首选化学试剂20,21。它对大多数细胞成分具有广泛的特异性，并能良好保存细胞结构22,23。此外，甲醛还能保留大多数荧光染料的荧光特性，因此可用于固定转基因动物，使其靶向细胞中表达的荧光报告蛋白得以保存。
本文改编了先前用于标记小型实验哺乳动物模型中血管的方案24&#160;，以适用于鱼类。整个操作过程仅需数小时即可完成。本方法展示了如何将含有DiI的甲醛固定液灌注到鱼类心脏中，从而直接标记模式鱼类青鳉脑部和垂体中的所有血管。青鳉是一种原产于亚洲（主要分布于日本）的小型淡水鱼，是一种具有丰富分子与遗传学研究工具的研究模型生物25。因此，对该物种以及其他鱼类血管的识别，将有助于加深我们对脑组织和垂体细胞在完整组织或厚组织切片中如何与血管系统相互作用的理解。

<table><tbody><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15711</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚丙烯/聚乙烯无针注射器</td><td>Sigma</td><td>Z116866-100EA</td><td>注射器</td></tr><tr><td>BD Precisionglide 注射器针头</td><td>Sigma</td><td>Z118044-100EA</td><td>针头 18G (1.20*40)</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃，外径 10 cm，1.2 mm</td><td>sutter instrument</td><td>BF120-94-10</td><td>玻璃移液管</td></tr><tr><td>DiI (1,1&amp;prime;-二十八烷基-3,3,3&amp;prime;,3&amp;prime;-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐)</td><td>Invitrogen</td><td>D-282</td><td></td></tr><tr><td>低密度聚乙烯管，外径 1.7 mm，内径 1.1 mm</td><td>Portex</td><td>800/110/340/100</td><td>套管</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 溶液</td><td>Sigma</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>移液管拉制仪</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>VWR</td><td>391-0442</td><td></td></tr><tr><td>超级胶水凝胶</td><td>loctite</td><td>c4356</td><td></td></tr><tr><td>三卡因 (ms-222)</td><td>sigma</td><td>E10521-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

使用dii-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative

血管支配着脊椎动物的所有组织，通过提供必要的营养物质、氧气和激素信号来维持其存活。它是发育过程中最早开始发挥功能的器官之一。血管形成机制已成为高度受关注的科学和临床研究课题。然而，在成体动物中，由于血管通常位于其他组织的深层，因此很难在大多数活体动物中观察到其结构。尽管如此，血管的可视化对于内分泌学和神经生物学等多个研究领域仍然至关重要。虽然已在斑马鱼中开发出多种转基因品系，能够通过荧光蛋白的表达直接观察血管，但其他真骨鱼类尚无类似工具。本实验方案以青鳉（Oryzias latipes）为模型，介绍一种通过心脏灌注含DiI的固定液来快速、直接标记脑和垂体血管的技术。该方案有助于加深我们对脑和垂体细胞如何与血管系统在完整组织或厚组织切片中相互作用的理解。

本方案演示了对青鳉大脑和垂体中的血管进行标记并同时固定组织的逐步操作流程。通过心内注射含有DiI的固定液至心脏后，可在切片上使用荧光体视显微镜（图4）或在完整组织上使用共聚焦显微镜（图5）观察到血管。无论是在较厚的组织切片还是在完整组织上，均可实现对血管结构的三维观察。在固定完成后，可使用标准免疫荧光方案对组织切片进行特定靶蛋白的标记，也可在转基因品系中对目标细胞表达荧光报告蛋白的情况进行观察（图6）。这使得研究者能够探究血管与其他特定细胞类型之间的相互作用。例如，此处使用了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）的青鳉转基因品系，以揭示垂体Lh细胞的位置28。可以观察到这些细胞向血管发出突起。若灌注效果不理想，部分血管可能无法被充分标记。例如，若将溶液注射至心室而非动脉球，或注射时注射器活塞施加的压力过低和/或时间过短，则可能出现此情况（图7）。最后，通过以相同...

本文介绍了一种通过将DiI溶于固定液后进行心脏灌注，以快速标记辐鳍鱼类血管的实验方案，以青鳉（Oryzias latipes）为模型，重点针对脑和垂体组织。

使用DiI-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

血管支配着所有脊椎动物的组织，通过提供必要的营养物质、氧气和激素信号来维持其存活。它是一种……

本实验的总体目标是对辐鳍鱼类脑部和垂体中的血管进行标记，我们以模式物种青鳉鱼为研究对象，通过心脏灌注含有DiI的固定液来实现这一目的。该技术操作简便且高效，有助于回答有关辐鳍鱼类脑和垂体血管解剖结构的重要问题，以及神经元或内分泌细胞与血管之间的关系。该技术的优点包括制备过程快速、简便，且适用于多种辐鳍鱼类。制备鱼固定装置时，将一块聚苯乙烯切割成5厘米长、3厘米宽、2厘米厚的尺寸，并将其粘附至一个直径为9厘米的塑料培养皿上。然后使用解剖刀在聚苯乙烯上切出一个长约3厘米、船形的孔洞。为准备灌流系统，在灌流系统针头的末端连接一根长度为30至50厘米的塑料套管。为制备5厘米长的玻璃移液管，使用移液管拉制仪按照制造商说明拉伸单根玻璃毛细管。在开始解剖前，用已配制的DiI-固定液溶液填充一支10毫升注射器，并在注射器末端安装带有套管的针头。然后使用多条以不同方向粘贴的胶带将注射器固定在实验台上，并调整显微镜和座椅的位置，以获得适合解剖操作以及用肘部按压注射器活塞的良好姿势。接下来，将一条已处死的鱼腹部朝上放置于鱼体固定装置中，并用大头针固定头部和尾部。使用剪刀水平剪开腹部前方浅层皮肤，然后用镊子去除心脏上方的皮肤，直至清晰暴露心室和动脉球。在毛细管末端连接一根玻璃管，并折断玻璃管的尖端。将玻璃移液管靠近心室，同时对注射器活塞施加肘部压力，以推动液体流出，并用移液管固定住心脏心室。随后立即用镊子穿刺静脉窦，使血液从循环系统中释放。从心室处调整玻璃移液管的角度，找到动脉球的入口，并将移液管开口移入动脉球内部。然后在保持移液管位于动脉球内的同时，继续对注射器施加压力 30 至 60 秒。为了实现所有血管的最佳标记，关键是要灌注足够长的时间，以确保动脉球内的血液完全被 DiI-固定液取代。灌注约 60 秒后，当观察不到进一步的血液渗漏时，从鱼体内移除玻璃移液管和针头，并将脑和垂体组织收集至新鲜的 4% 多聚甲醛中，在室温避光条件下固定两小时。然后用新鲜的PBS清洗组织两次，每次10分钟，之后准备样品进行成像。按照上述方法在心脏注射含有DiI的固定液后，可通过荧光体视显微镜在组织切片上或通过共聚焦显微镜在完整组织上观察到标记的血管。需要注意的是，如果将溶液注射至心室而非动脉球，或注射压力过低和/或注射时间过短，则会导致血管标记不充分。此外，在使用相同的成像参数对同一组织进行成像时，可观察到数天后标记强度下降，信号在组织样本中的分布显得更加弥散。对于转基因品系的组织切片，若其中目标细胞表达荧光报告蛋白，可进一步采用标准免疫荧光染色方法对特定目标蛋白进行标记，从而研究血管与其他细胞类型之间的相互作用。到达动脉球非常重要。当达到此状态后，向注射器活塞施加压力应可诱导球部扩张，从而确认操作成功。该技术可用于研究硬骨鱼类垂体中内分泌细胞与血管之间的相互作用，尤其可用于更具体地探讨硬骨鱼类与哺乳动物垂体门脉系统之间可能存在的差异或相似之处。由于该操作涉及有毒且易挥发的化合物，因此在进行这些实验时，必须始终采取预防措施，例如佩戴防毒面具并在通风良好的环境中操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用心脏灌注和二固定仪对脑和垂体血管进行标记

我们展示了如何使用基因枪将荧光染料（如 DiI）导入不同年龄的啮齿类动物和非人灵长类动物脑切片中的神经元。在本实验中，我们使用成年小鼠（3-6 月龄）和成年食蟹猴（9-15 岁）。该技术最初由 Lichtman 博士实验室描述（Gan et al.,...

啮齿类与非人灵长类脑切片神经元的DiOLISTIC标记

本文介绍了一种标记胚胎皮肤和胸腺血管的方法。...

一种用于胚胎小鼠血管标记的方法

本文介绍一种低成本、快速、可控且均匀的固定方法，通过大鼠心脏经血管系统灌注4%多聚甲醛，以实现对脑组织的最佳保存。...

啮齿类动物全动物灌注固定

神经回路在功能区室中具有拓扑性组织，并具有特定的分子特征。本文提供了利用一种通用的全脑免疫组织化学染色方法揭示全脑拓扑结构的实用与技术步骤。我们以小脑经典的细胞构筑和神经环路为例，展示了该方法的应用价值。...

揭示复杂脑部拓扑结构的全脑免疫组织化学染色法

啮齿类动物脑血管解剖结构的分析在实验性脑卒中研究中具有重要作用。在此领域，血管内灌注彩色乳胶多年来被视为一种标准技术。然而，该技术存在明显的技术局限性，影响其可重复性。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于可视化脑血管。通过左心室注射两种市售碳黑墨水的混合物，可实现脑血管的良好充填，并获得高对比度的显影效果。我们已成功应用该技术识别了不同遗传背景小鼠脑血管区域之间的吻合点。最后，我们证实这种新颖且简便的血管染色方法可与三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色相结合——后者是观察和分析小鼠脑梗死体积的常用工具。...

血管内灌注碳素墨水可实现脑血管的可靠可视化

利用亲脂性的1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（DiI）染色技术，可对Ambystoma...

DiI 灌注作为墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）血管可视化的一种方法

本文介绍了一种利用腹腔注射荧光示踪剂并结合灌注技术的小鼠脑血管通透性检测方法，适用于血脑屏障功能障碍的动物模型。一侧半脑用于通透性的定量评估，另一侧用于示踪剂的可视化或免疫染色。该实验流程可在10只小鼠中于5至6小时内完成。...

一个 在体 内 利用荧光标记示踪剂检测小鼠血脑屏障通透性实验

本方案描述了一种高效且可重复的小鼠脑组织学研究方法，包括灌注、脑切片、游离漂浮免疫染色、组织贴片和成像。...

小鼠脑组织的游离免疫染色

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

初步研究证实，蛛网膜下腔出血（SAH）可导致脑周细胞死亡。评估SAH后周细胞的收缩功能需区分存活与非存活的脑周细胞。因此，已建立一种可在脑组织切片中同时标记存活与非存活脑周细胞的方法，便于利用高分辨率共聚焦显微镜进行观察。...

脑出血后脑切片中脑周细胞活力成像

我们展示了通过化学诱导小鼠大脑大血管扩张，作为研究脑血管功能障碍的模型，该模型可用于血管性痴呆和阿尔茨海默病的建模。我们还展示了通过注射硅橡胶化合物来可视化血管系统，并为测量血管尺寸变化提供清晰的视觉指导。...

一种用于诱导小鼠脑血管扩张以模拟大血管介导的脑血管功能障碍的可视化方法

学习使用心脏灌注和DiI固定剂标记青鳉鱼脑与垂体血管的技术。该方法操作简便、快速高效，可揭示血管解剖结构及神经元与血管的关系，适用于多种硬骨鱼类研究。

使用DiI-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

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