Name: 多克沙六烯、环氧体和阿拉奇酮酸的环氧代谢物酶合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: 学习利用细菌细胞色素P450酶BM3酶法合成对映纯环氧脂肪酸的方法，适用于DHA、EPA和花生四烯酸的大规模制备。该方案简单快速、成本低廉，可推动这些代谢物生物机制研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（R00 ES024806）、美国国家科学基金会（DMS-1761320）以及密歇根州立大学的启动资金资助。作者感谢加州大学戴维斯分校的Jun Yang博士和密歇根州立大学的Lalitha Karchalla在酶促反应优化方面的协助，以及密歇根州立大学质谱与代谢组学平台的Tony Schilmiller博士在高分辨质谱数据采集方面的帮助。

警告：使用所列化学品前，请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。
1. 野生型BM3的表达
<ol>
	<li>将转染了 pBS-BM3 的 DH5α E. coli（由 Dr. F. Ann Walker 惠赠）接种于含有 0.5 mg 氨苄青霉素的 5 mL 无菌 LB 液体培养基中，置于 20 mL 培养管内。</li>
	<li>在 37 ˚C、200 rpm 条件下振荡培养细胞 24 小时。将过夜培养的菌液（5 mL）和 100 mg 氨苄青霉素加入 1 L 无菌 LB 液体培养基中，置于 Fernbach 或 Erlenmeyer 烧瓶内，先在 37 ˚C、200 rpm 条件下振荡培养 6 小时，随后在 30 ˚C、200 rpm 条件下继续振荡培养 18 小时。</li>
	<li>在 4 ˚C、1,000 × g 条件下离心收集菌体 10 分钟。弃去上清液，将菌体沉淀保存于 -78 ˚C，待进行酶纯化。 
	注意：上清液可通过加入漂白剂进行化学灭菌，或使用高压灭菌器灭菌后，再排入下水道。</li>
</ol>
2. BM3的纯化。
<ol>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>将细胞沉淀在冰上解冻，并用40 mL预冷（4 ˚C）的溶解缓冲液（10 mM Tris，0.01 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），0.01 mM EDTA；pH 7.8）重悬。 
		注意：PMSF 接触后具有毒性。</li>
		<li>在冰上使用超声波均质器对细胞进行1分钟超声处理（输出功率设为10，占空比100%），随后在冰上静置1分钟，以裂解细胞。重复此步骤6次。将细胞裂解液在4 ˚C、11,000 × g 条件下离心30分钟，以沉淀细胞碎片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亲和层析
	<ol>
		<li>使用缓冲液A（10 mM Tris，pH 7.8）在4 ˚C条件下洗涤强阴离子交换层析柱（参见材料表；直径：2.8 cm × 6 cm，柱体积：37 mL），洗涤体积为5个柱体积（CV）。</li>
		<li>将细胞裂解液上样至平衡后的层析柱，用3个柱体积的冷缓冲液A洗涤层析柱，然后用冷缓冲液B（10 mM Tris，600 mM NaCl）洗脱BM3，洗脱体积为6个柱体积。</li>
		<li>收集红棕色的洗脱组分。若蛋白不立即使用，应加入等体积甘油，用液氮速冻，并将冻存样品置于-78 ˚C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. BM3 对 DHA 的环氧化反应
<ol>
	<li>将0.308 g（0.940 mmol）DHA溶于18.8 mL二甲基亚砜（DMSO）中，加入到2 L搅拌状态的反应缓冲液（0.12 M磷酸钾，5 mM MgCl2，pH 7.4）中，并加入20 nM解冻后的BM3酶，以配制反应体系。酶浓度可通过一氧化碳/连二亚硫酸盐光谱分析法测定19。</li>
	<li>在溶液持续搅拌的同时，加入1当量的NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸四钠盐，0.808 g，0.940 mmol），该物质预先溶于反应缓冲液中以启动反应。反应过程中持续搅拌30分钟，并通过连接在注射器和针头上的气球向反应混合物中通入空气。</li>
	<li>使用分光光度计（见材料表），检测反应混合物在340 nm处的吸光度，以判断NADPH是否已消耗完毕。若吸光度不再存在，表明NADPH已完全消耗，反应完成。 
	注意：通常情况下，反应在30分钟后即已完成。</li>
	<li>缓慢滴加1 M草酸溶液，逐滴加入反应混合物中，直至溶液pH达到4，以终止反应。</li>
</ol>
4. EDP 的提取
<ol>
	<li>用 2 L 无水乙醚（无过氧化物）萃取淬灭后的缓冲溶液，共萃取 3 次。收集乙醚层（共 6 L），并用无水硫酸镁（MgSO4）干燥。</li>
	<li>将溶液中的 MgSO4 过滤除去，然后在旋转蒸发仪上浓缩干燥后的乙醚层，得到粗制的 EDP 残留物。</li>
	<li>通过快速柱色谱法纯化残留物（使用 40 g 硅胶柱即可）。以正己烷中含 10% 乙酸乙酯（EtOAc）开始，22 分钟内线性梯度洗脱至正己烷中含 60% EtOAc。 
	注意：得到三个主要峰，按洗脱顺序分别为：1. 未反应的 DHA；2. EDP 异构体混合物；3. 二环氧产物（正常过度氧化产物）（见图 1）。</li>
	<li>合并各馏分并在旋转蒸发仪上浓缩。本示例中获得 0.074 g（24%）未反应的 DHA、0.151 g（47%）EDP 异构体和 0.076 g（22%）二环氧产物。</li>
</ol>
5. EDP 的酯化、16(S),17(R)-EDP 与 19(S),20(R)-EDP 的分离，以及酯的皂化
警告：三甲基硅基重氮甲烷（TMS-重氮甲烷）通过接触和吸入均具有剧毒。仅可在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备。
<ol>
	<li>在圆底烧瓶或小瓶中，将环氧化物（0.151 g，0.435 mmol）溶于2 mL无水甲醇（MeOH）和3 mL无水甲苯中，加入搅拌子，并在氩气保护下加入TMS-重氮甲烷（1.2摩尔当量，或2 M己烷溶液0.26 mL）。</li>
	<li>静置10分钟后，继续加入TMS-重氮甲烷（0.050 mL），直至反应液呈现淡黄色并保持不变。</li>
	<li>30分钟后，使用旋转蒸发仪小心浓缩反应混合物，并通过快速柱色谱纯化残留物。以正己烷中含4%乙酸乙酯（使用40 g硅胶柱或柱芯）为洗脱剂，洗脱22分钟。本示例中得到19,20-EDP甲酯（0.116 g，74%）和16,17-EDP甲酯（0.029 g，19%），均为无色油状物（总收率93%）。</li>
	<li>收集含有纯化EDP甲酯区域异构体的馏分。19(S),20(R)-EDP甲酯先被洗脱，随后为16(S),17(R)-EDP甲酯。</li>
	<li>若仍有混合馏分存在（同时含有两种异构体；可通过薄层色谱（TLC）在8:1正己烷/乙酸乙酯体系中检测，并用高锰酸钾（KMnO4）显色），则使用相同溶剂系统重新进行色谱分离。</li>
	<li>浓缩含有单一区域异构体的馏分。 
	注：此时可通过核磁共振（NMR）分析产物的结构与纯度（以CDCl3为溶剂；参见图2图注）。</li>
	<li>为将各EDP甲酯区域异构体转化为相应的酸形式，将EDP酯溶于THF:水（约0.7 mL/0.1 mmol酯）。加入2 M水溶液氢氧化锂（LiOH，3摩尔当量），室温搅拌过夜。 
	注：可通过薄层色谱（TLC）检测反应是否完全，使用3:1正己烷/乙酸乙酯体系，高锰酸钾（KMnO4）显色；产物的保留因子约为0.3。</li>
	<li>缓慢加入甲酸淬灭反应，调节混合物pH至3–4。加入水和乙酸乙酯（1–2 mL/0.100 mmol酯），分液。水相用乙酸乙酯萃取（3 × 5 mL），合并有机相后用饱和氯化钠（NaCl）溶液洗涤，再用无水硫酸钠（Na2SO4）干燥。</li>
	<li>使用旋转蒸发仪浓缩乙酸乙酯溶液，加入正己烷（10 mL）后再次浓缩。重复此操作两次，以共沸除去残留的甲酸。通过快速柱色谱纯化残留物，以10–30%乙酸乙酯梯度洗脱，持续15分钟。</li>
	<li>合并目标馏分，并在真空下干燥，得到纯化的酸产物。 
	注：此阶段可评估对映体纯度（通过手性HPLC分析，参见图&#160;3&#160;– 图4的图注中所述色谱柱与条件）。化学纯度可通过C18（非手性）HPLC进行评估（参见材料表及参考文献14）。</li>
</ol>

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<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li>
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 <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019).</li>
<li>Graham-Lorence, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+site+substitution%2C+F87V%2C+converts+cytochrome+P450+BM-3+into+a+regio-+and+stereoselective+%2814S%2C+15R%29-arachidonic+acid+epoxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An active site substitution, F87V, converts cytochrome P450 BM-3 into a regio- and stereoselective (14S, 15R)-arachidonic acid epoxygenase.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 1127-1135 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需披露。

本文介绍了一种操作简便且成本效益高的方法，用于制备DHA的两种最丰富的环氧代谢物——19,20-和16,17-EDP。这些环氧脂肪酸可利用野生型BM3酶以高对映体纯度（作为其S,R-异构体）的形式制备。下文描述了若干关键步骤，可用于问题排查，以及将本方法拓展至制备AA和EPA的对映体纯环氧代谢物的相关内容。
BM3 储存指南
将纯化的BM3酶与等体积甘油混合，用液氮速冻后于-78 ˚C冰箱中保存。酶冻结后可保存长达一年。该酶仅能解冻一次，且必须在冰上解冻，解冻后在冰上放置不得超过4小时。再次冷冻或在无冰浴条件下使其解冻均会导致酶失活。
化学品储存指南
该实验步骤所需的多种化合物对空气敏感，包括二高-γ-亚麻酸（DHA）及其他多不饱和脂肪酸（PUFA）、环氧二十碳五烯酸（EDP）及其他环氧代谢物，以及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP...

近年来，随着人们对多不饱和脂肪酸（尤其是ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸）在人类生物学中所起作用的兴趣日益增长，研究人员开始关注其代谢产物所表现出的广泛有益效应。其中，细胞色素P450酶类产生的环氧脂肪酸代谢物已成为研究的重点。例如，多种多不饱和脂肪酸环氧化物，包括环氧二十碳三烯酸（EETs）、环氧二十二碳五烯酸（EDPs）和环氧二十碳四烯酸（EEQs），在血压调节和炎症调控中发挥着关键作用1,2,3,4,5。有趣的是，花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA）环氧化物的特定对映异构体和区域异构体已被证实对血管收缩具有不同的影响6,7。尽管EETs和EEQs的对映异构体与区域异构体的生理效应已有文献记载，但对于由DHA形成的类似环氧二十二碳五烯酸（EDPs）的作用仍知之甚少。富含EPA和DHA的鱼油被广泛使用8，也进一步激发了人们对EDPs的研究兴趣9。这些补充剂的益处被认为部分归因于DHA的下游代谢产物（其中以16,17-EDP和19,20-EDP含量最为丰富），因为在体内的EDP水平与饮食中DHA的摄入量高度一致10,11。
通过代谢组学、化学生物学及其他方法研究这些环氧脂肪酸的作用机制和靶点一直具有挑战性，部分原因是它们以区域异构体和立体异构体的混合物形式存在，因此需要一种能够获得纯度足够的对映体和区域异构体的方法。传统的化学合成方法已被证明效果不佳。使用过氧酸（如meta-氯过氧苯甲酸）进行环氧化反应存在诸多缺点，尤其是缺乏环氧化选择性，这导致必须进行昂贵且繁琐的单个区域异构体和对映体的纯化。尽管可对DHA和EPA代谢物进行全合成，但该方法同样存在高成本和低产率等缺陷，使其难以适用于大规模合成12,13。酶法合成则可实现高效的总体生产，因为酶促反应具有区域选择性和立体选择性14。研究表明，利用BM3对AA和EPA进行酶促环氧化反应兼具区域选择性和对映选择性15,16,17,18，但该方法尚未在DHA上进行测试，也未实现大规模应用。本方法的总体目标是放大并优化这种化学-酶法环氧化工艺，以快速制备大量高纯度的单一对映体环氧脂肪酸。通过本文所述方法，研究人员可获得一种简便且经济高效的EDPs及其他多不饱和脂肪酸环氧代谢物的合成策略。

<table><tbody><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>无水硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td>NA</td></tr><tr><td>无水甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>无水硫酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td>NA</td></tr><tr><td>无水甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>花生四烯酸（AA）</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>对空气敏感。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO（分子生物学级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>二十二碳六烯酸（DHA）</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>对空气敏感。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA（乙二胺四乙酸）</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>二十碳五烯酸（EPA）</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>&amp;nbsp;U-99A</td><td>对空气敏感。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Flash柱层析柱：25、40、4、12 g 规格</td><td>Fisher Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>或者，也可使用常规柱层析法</td></tr><tr><td>甲酸（HPLC 级）</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td>NA</td></tr><tr><td>己烷</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>氢氧化锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td>NA</td></tr><tr><td>甲醇（HPLC 级）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH 四钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>对空气敏感。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>草酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 转染的 DH5&amp;alpha; E. coli</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>PMSF（苯甲基磺酰氟）</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>有毒！</td></tr><tr><td>高锰酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>用于薄层色谱染色。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow 树脂（GE Healthcare life sciences）</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>用于酶的阴离子交换纯化</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>四氢呋喃，无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-重氮甲烷（己烷中 2.0 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>剧毒。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;同样需要：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动快速纯化系统（我们使用的是 Buchi Reveleris X2）&amp;nbsp;</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 高效液相色谱柱（Zorbax Eclipse XDB-C18）</td><td>安捷伦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可达到 10,000 x g 的离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手性高效液相色谱柱（Lux cellulose-3），250 × 4.6 mm，5 μm &amp;micro;M, 1000 &amp;Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>普通化学实验用品：2 L 分液漏斗、容量为 1000–2000 L 的烧杯和锥形瓶、20 mL 小瓶、HPLC 小瓶、小型圆底烧瓶和搅拌子。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱（我们使用 Shimadzu Prominence LC-20AT 分析泵和 SPD-20A 紫外-可见光检测器）</td><td>岛津</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 分光光度计&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td></td></tr><tr><td>核磁共振（NMR）</td><td>核磁共振：Agilent DD2 波谱仪（500 MHz）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪或超声均质器</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸环氧化代谢物的酶法合成

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

多种多不饱和脂肪酸（PUFA）的环氧化代谢物被称为环氧脂肪酸，在人体生理过程中具有广泛的作用。这些代谢物由细胞色素P450酶系在体内生成。由于其具有多样且强烈的生物学效应，人们对研究这些代谢物表现出极大的兴趣。然而，确定这些代谢物在体内的独特功能是一项困难的任务，因为首先必须以较大量的高纯度形式获得这些环氧脂肪酸。从天然来源获取化合物通常费时费力，且可溶性环氧化物水解酶（sEH）会迅速将其水解。另一方面，通过化学反应合成这些代谢物效率极低，原因在于难以获得高纯度的区域异构体和对映异构体、产率低，以及需要复杂且昂贵的纯化步骤。本文介绍了一种高效的酶促合成方法，利用源自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）并在大肠杆菌（Escherichia coli）中易于表达的细菌CYP450酶BM3，将二十二碳六烯酸（DHA）转化为19(S),20(R)-和16(S),17(R)-环氧二十二碳五烯酸（EDP）。通过核磁共振波谱（NMR）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）对产物进行表征并确定其纯度。该方法展示了酶促合成PUFA环氧代谢物的优势，同样适用于其他脂肪酸的环氧化反应，例如花生四烯酸（AA）和二十碳五烯酸（EPA），分别生成相应的环氧二十碳三烯酸（EETs）和环氧二十碳四烯酸（EEQs）。

对酶促环氧化反应得到的粗混合物进行纯化后，使用下文所述的自动快速纯化系统进行快速柱层析，结果如图1所示。经酯化反应及区域异构体分离后，得到纯的16(S),17(R)-EDP和19(S),20(R)-EDP甲酯。通常情况下，二者比例约为1:4至1:5，其中主要产物为19(S),20(R)-EDP。未检测到其他EDP区域异构体（如13,14-或10,11-EDP）。16(S),17(R)-EDP（图2A）和19(S),20(R)-EDP（图2B）甲酯的1H-NMR谱图及其结构如下所示，表明这些化合物具有高纯度；其酸形式的C18（非手性）HPLC分析也显示纯度&gt;98%。进一步通过高分辨质谱（酸和酯...

我们介绍一种利用细菌细胞色素P450酶（BM3）大规模酶法合成和纯化花生四烯酸（AA）、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）的特定对映异构体和区域异构体环氧化物的方法。

多种多不饱和脂肪酸（PUFAs）的环氧化代谢产物被称为环氧脂肪酸，在人体生理过程中具有多种功能。这些……

因此，我们的实验方案能够制备对映体纯的环氧脂肪酸，该方法可能有助于推动关于这些代谢物在体内作用机制的研究。传统上，纯的环氧脂肪酸极难获得。而我们的方案操作简便、快速、成本低廉，并可制备出大量此类代谢物。是的，我们开发了针对DHA的实验方案，但该方案也适用于EPA和花生四烯酸。操作时需迅速，因为某些试剂对空气敏感，特别是DHA和NADPH，务必提前配对好所有试剂，以确保实验设置简便。同时，需注意相关危害。本实验方案结合了酶学和有机化学的技术。对于不熟悉这些领域专门技术的读者和观众而言，可视化演示至关重要。接种时，使用无菌接种环或移液器，蘸取含有pBS-BM3转染的DH5-alpha大肠杆菌的甘油菌种，接种至5毫升无菌LB液体培养基中，培养基中需添加0.5毫克氨苄青霉素。将细胞培养物在37摄氏度、200 rpm条件下于摇床中孵育24小时。然后，在一个锥形瓶中，向1升无菌LB肉汤中加入5毫升的种子培养物和100毫克氨苄青霉素。在37摄氏度、200 rpm条件下振荡6小时，随后在30摄氏度、200 rpm条件下继续振荡18小时。随后，将细胞培养物收集到离心管中，在 4 摄氏度、1,000 ×g 条件下离心 10 分钟。将上清液倾倒至另一个烧瓶中。使用漂白剂或高压灭菌器进行去污处理，并将细胞沉淀物保存在 -78 摄氏度，直至进行酶纯化。为进行细胞裂解，首先将细胞沉淀置于冰上融化，并用40毫升含Tris、PMSF和EDTA的预冷溶解缓冲液重悬。将细胞置于冰上，使用超声波匀浆器以输出功率10、占空比100的设置超声处理1分钟，随后在冰上静置1分钟，以裂解细胞。重复此步骤六次。将细胞裂解液在4°C、11,000 × g条件下离心30分钟，以沉淀细胞碎片。进行亲和层析时，在低温冰箱或带滑动门的冷藏室中（4°C），首先用5个柱体积的缓冲液A（10毫摩尔Tris，pH 7.8）洗涤强阴离子交换层析树脂，以平衡层析柱。接着，将细胞裂解液的上清液上样至平衡好的层析柱中，并用3个柱体积的预冷缓冲液A洗涤层析柱。然后，用6个柱体积的预冷缓冲液B（10毫摩尔Tris，600毫摩尔氯化钠）洗涤层析柱，洗脱BM3蛋白。收集红棕色的洗脱组分。如果蛋白质不立即使用，需加入等体积的甘油，并用液氮速冻。将冻存的溶液于-78摄氏度保存。为了进行DHA的环氧化反应，首先根据一氧化碳连二亚硫酸盐光谱分析法测定解冻后的BM3酶的浓度。然后，在一个装有2升反应缓冲液并置于磁力搅拌器上搅拌的烧杯中，加入用18.8毫升DMSO稀释的0.94毫摩尔DHA以及稀释至20纳摩尔的BM3酶。在溶液搅拌的同时，通过加入含有0.94毫摩尔NADPH的8.7毫升反应缓冲液，启动环氧化反应。将装有空气的气球连接至注射器和针头，并将针头用胶带固定在烧杯内壁，向反应混合物中通入空气，同时搅拌反应30分钟。之后，吸取1微升反应混合物，加入NanoDrop分光光度计中，测定340纳米处的吸光度。以水作为空白对照。若无剩余吸光度，表明 NADPH 已被消耗，则反应完成。通过缓慢逐滴加入 1 摩尔草酸，将反应混合物淬灭，直至溶液 pH 值达到约 4。随后，用 2 升无水、无过氧化物的乙醚萃取淬灭后的缓冲溶液。使用分液漏斗振荡并分离各层，将乙醚层收集至锥形瓶中。重复此操作两次，加入约50克无水硫酸镁以干燥乙醚。在减压过滤漏斗上，将干燥后的乙醚过滤以除去硫酸镁，然后将滤过的乙醚层转移至旋转蒸发仪的圆底烧瓶中。将转速调至中等，启动真空以浓缩液体，得到粗EDP残留物。将残留物上样至40克硅胶柱，使用自动快速纯化仪进行快速柱层析。以10%乙酸乙酯/己烷开始，22分钟内梯度洗脱至60%乙酸乙酯/己烷。各组分将自动收集到试管中。随后，将每个峰对应的组分合并至圆底烧瓶中，置于旋转蒸发仪上，开始蒸发。最终获得三个组分：DHA、EDP异构体和二环氧产物。为了酯化所得的0.151克环氧化物，在圆底烧瓶或小瓶中加入2毫升无水甲醇和3毫升无水甲苯，并加入一个搅拌子。通过橡胶隔垫和针头将烧瓶与充满氩气的气球连接，同时在搅拌下用注射器加入0.26毫升2摩尔的TMS-重氮甲烷。等待10分钟，然后继续加入0.05毫升TMS-重氮甲烷，直至出现淡黄色。30分钟后，使用旋转蒸发仪小心浓缩混合物，并在快速色谱仪上使用40克硅胶柱 cartridge 纯化残留物。以正己烷中含4%乙酸乙酯的等度体系在22分钟内洗脱。首先收集含有纯化的19S,20R-EDP甲酯的馏分，随后收集16S,17R-EDP甲酯馏分。现在，使用正己烷与乙酸乙酯按8:1比例配制的混合溶剂，通过薄层色谱分析各馏分。用高锰酸钾染色以检测是否含有两种异构体的混合馏分。在旋转蒸发仪上浓缩对应于每个峰的馏分，然后在天平上称重，以确定所获得的EDP酯的量。若仍有混合组分，使用先前相同的溶剂系统对它们进行再次色谱分离。用旋转蒸发仪浓缩含有各个区域异构体的组分。为将各个环氧二十二碳五烯酸甲酯区域异构体转化为其酸形式，取环氧二十二碳五烯酸酯置于小玻璃小瓶中，每0.1毫摩尔酯加入约0.7毫升四氢呋喃和0.175毫升水进行稀释。将小瓶置于冰浴中冷却至零摄氏度，加入三当量的氢氧化锂溶液，在氩气氛围下于搅拌器上搅拌过夜，同时逐渐升温至室温。次日早晨，缓慢加入甲酸以淬灭反应，直至混合物的 pH 值达到 3 至 4。然后加入水和 2 毫升乙酸乙酯以分离液层。用10毫升乙酸乙酯萃取水层三次，用20毫升饱和氯化钠溶液洗涤，向溶液中加入数克无水硫酸钠以干燥乙酸乙酯层。使用旋转蒸发仪浓缩乙酸乙酯溶液，加入10毫升正己烷，再次浓缩。重复两次，以共沸法除去残留的甲酸。通过快速柱色谱纯化残余物，以乙酸乙酯在15分钟内梯度洗脱，比例从10%升至30%。将目标馏分在旋转蒸发仪中浓缩，并在真空下干燥，得到纯化的酸。此处展示了对酶促环氧化粗混合物进行纯化时获得的快速柱色谱图。得到三个主要峰，洗脱顺序依次为：第一个是未反应的DHA，第二个是EDP异构体的混合物，第三个是二环氧产物，这些均为常见的过氧化产物。经过酯化反应及区域异构体的分离后，质子核磁共振（NMR）谱图显示，获得了高纯度的16S,17R-EDP和19S,20R-EDP甲酯。手性高效液相色谱（HPLC）证实了EDP酸形式的对映体纯度。在操作和接种过程中，务必保持肉汤无菌，以避免污染。该环氧化方法也可用于其他脂肪酸。因此，我们还尝试了花生四烯酸和二十碳五烯酸，均获得了较高产率的对映体纯环氧化物，即14,15-环氧二十碳三烯酸（14,15-EET）和17,18-环氧二十碳五烯酸（17,18-EEQ）。因此，一种能够使研究人员获取环氧脂肪酸的实验方案可能有助于研究这些化合物的生物学功能，进而推动其作为药物先导化合物的应用。其中的危险化学品包括PMSF（接触有害）和TMS-重氮甲烷（接触和吸入均有剧毒）。因此，后者必须在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备。

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Research

科研

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Chemistry

化学

多克沙六烯、环氧体和阿拉奇酮酸的环氧代谢物酶合成

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利用酶级联反应由L-赖氨酸合成手性氨基醇

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超分子胶体的合成与表征

学习利用细菌细胞色素P450酶BM3酶法合成对映纯环氧脂肪酸的方法，适用于DHA、EPA和花生四烯酸的大规模制备。该方案简单快速、成本低廉，可推动这些代谢物生物机制研究。

二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和花生四烯酸环氧化代谢物的酶法合成

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