一种具有稳定人源化肠道微生物组和人类免疫系统的人源化BLT小鼠双模型

本方案具有重要意义，因为它可被用于可重复地构建同时拥有人源肠道微生物组和人源免疫系统的小鼠模型。我们将这类小鼠称为双人源化小鼠。双人源化小鼠模型可用于基础研究和转化医学研究，包括研究人源肠道微生物组与人源免疫系统之间的体内相互关系。

演示该实验操作的是来自我们实验室的博士后张建水和博士研究生常一伦。将肝脏和胸腺组织植入左肾包膜时，首先将小鼠放入通风橱中。在手术当天，以每克体重12厘戈瑞的剂量对小鼠进行全身亚致死剂量照射。

在确认小鼠达到适当的镇静水平后，剃除其左侧外侧和内侧的毛发。将眼用软膏涂抹于动物的眼睛上，并根据需要佩戴耳标。使用碘伏和70%异丙醇依次进行三次皮肤消毒擦拭。

皮肤准备就绪后，使用镊子将一块体积为1至6立方毫米的人类胎儿肝脏组织碎片装入套管针中，随后装入一块体积为1至1.6立方毫米的人类胎儿胸腺组织碎片。用镊子提起皮肤，使用手术刀在皮肤上做一个小的纵向切口，将切口向小鼠左侧延伸至1.5至2厘米。

用镊子提起肌肉层。用剪刀纵向切开肌肉层，根据需要延长切口以暴露肾脏，并轻轻夹住肾脏周围脂肪组织。用手术刀在肾包膜的后端做一至二毫米的切口，然后将预装好的套管针沿肾脏长轴平行缓慢插入切口内。

松开肾包膜与肾脏之间的组织，将肾脏和肠管复位至正常位置。然后使用缝线缝合肌肉层，用外科缝钉闭合皮肤。将小鼠放入经高压灭菌的独立通风隔离笼中，持续监测直至完全恢复卧位。

手术后6小时，将小鼠置于加热灯下，并用70%异丙醇对尾巴进行消毒。在每只动物的一条扩张尾静脉中，注射1.5至5 × 10⁵个CD34阳性人胎儿肝脏组织分离的造血干细胞，溶于200 µL PBS中。然后轻压止血，并将小鼠放回其原有饲养笼中。

手术后9至12周，使用合适尺寸的塑料梳状固定器固定一只人源化小鼠的一条腿，并用70%异丙醇喷洒该腿内侧。在采血部位涂抹抗生素和止痛药膏。用一支25号针头以90度角刺穿隐静脉，将50至100 µL血液收集至EDTA包被的采血管中。

获得适量血液后，在将小鼠放回笼中前，用无菌纱布对采血部位施加压力以止血。随后，使用收集的外周血样本，通过针对人CD45、CD3、CD4、CD8、CD19及小鼠CD45的抗体，采用流式细胞术评估人免疫细胞重建水平。对于新鲜粪便样本的采集，将单独灭菌的纸袋放入通风橱中，每只小鼠放入一个袋内，直至每只动物排便。

然后将小鼠放回笼中，并使用无菌镊子将每份粪便样本分别转移至对应每只小鼠的1.5毫升离心管中，于-80摄氏度保存。在14天抗生素处理结束时，将饮用水更换为高压灭菌的无菌水，并将小鼠转移至新的高压灭菌笼具中。在停止抗生素处理后24小时和48小时，将制备妥当的粪便微生物移植材料在厌氧条件下于厌氧工作站中解冻，并进行分装。

进行粪便移植时，通过口服灌胃法向每只实验动物给予200微升的粪便微生物群移植材料，并将任何剩余的解冻材料涂抹于人源化小鼠的皮毛或笼具垫料上。此处展示了一例术后10周人源化BLT小鼠外周血流式细胞术分析结果。可同时鉴定出T细胞和B细胞群体，以及CD4和CD8阳性T细胞亚群。

在此图中，可以观察到用于移植肠道微生物组以构建双重人源化小鼠的人类粪便供体样本的相对丰度。抗生素处理引起的脾脏和盲肠表型变化与无菌动物中观察到的变化相似。该代表性16S核糖体RNA测序数据的主成分分析图显示，双重人源化小鼠具有类似于人类供体样本的独特人类肠道微生物组。

该实验方案最关键的环节是限制外源性细菌的引入，以确保小鼠健康并维持其体内的人源肠道微生物组。该模型有望推动个性化医疗的发展，并使我们能够在控制其他干扰因素的前提下，研究人类疾病对肠道微生物组的影响。