在定义良好的剪切应力下单细胞电电流的电生理记录

该协议的目的是描述一个经过修改的平行板流室,用于研究通过剪切应力实时激活美能敏感子孔通道。

使用经过修改的平行板流室可以帮助研究人员回答与机械离子通道对剪切应力的功能反应有关的关键问题。该技术的主要优点是，它允许实时调查在易于组装的可重复使用的平行板流室中流动激活的离子通道。要开始该过程，在 C 片矩形空间的边缘周围涂抹一层薄薄的硅胶弹性体溶液，并轻轻地将矩形盖玻璃、片 D 直接放在弹性体溶液上，以完全覆盖片 C 的开放式矩形空间。

然后，重复将矩形盖玻璃（F 片）粘附到片 E 底部的过程，并允许硅胶弹性体溶液在室温下通宵固化。现在，按顺序将 MPP 流室组装，将每一件放在上一个顶部，从底部腔室开始，然后从 C 件开始，然后在顶部放置件 A。接下来，将各件的螺杆孔与角上的螺杆孔对齐，将碎片紧密拧在一起，以防止泄漏发生，同时管理流向 MPP 流量室的流量。

在六井板中，在每个井中放置四到五、12 毫米盖玻璃圈。保存10%至30%汇合之间的细胞，以便单细胞可用于电生理记录。随后，在标准培养条件下孵育细胞不少于两小时，使细胞粘附，且不超过24小时，因为内皮细胞在亚流体下播种超过24小时时将变得扁平且难以修补。

接下来，从六井板的井中取出含有粘附细胞的盖玻璃，并在 PBS 中快速冲洗。然后，将带电池的盖玻璃转移到含有两毫升电生理 BAF 溶液的 35 毫米培养皿中。立即将带电池的盖玻璃转移到 MPP 流室。

将盖玻璃圈转移到长方形盖玻璃 D 片上，该玻璃块粘附在 MPP 流室的 C 片上。添加 BAF 溶液，将盖玻璃圈和电池完全淹没。随后，将盖玻璃圆放在片件D上，使电池与片B的狭缝开口一样，确保盖玻璃圆通过溶液玻璃粘附粘附在片D上，避免通过流动应用破坏盖玻璃圆的位置。

然后，按适当的顺序将部件拧在一起，组装 MPP 流室。将腔室转移到显微镜阶段，并立即使用 BAF 溶液对腔室进行透镜。接下来，为实验确定一个具有暗边框和明显细胞核的健康细胞。

避免出现虚张声势的单元格或与其他细胞接触的单元格。为了控制剪切应力，通过将一个 30 毫升的分级注射器筒将一个 30 毫升的流式注射器筒连接到装有微孔管的三向 Luer 锁来建立重力灌注系统。接下来，使用双面胶带将分级圆柱体连接到电生理学钻机周围的法拉第笼上。

在将管子插入 MPP 腔室之前，使用 BAF 溶液预填充注射器和管材。然后，将管子插入 MPP 流量室入口孔 A.用溶液预先填充 MPP 流量室，以便将其在真空储液罐中清除。停止流向腔室，将分级油缸重新填充到顶部标记。

使用秒表手动计算流速，允许溶液以给定的注射器气缸高度流经腔室。升起或降低注射器以改变流量，并使用此方程计算平行腔室中的剪切应力。重复此过程，直到找到所需的剪切应力水平。

随后，将包含粘附细胞的组装室转移到电生理学钻机的显微镜阶段。将预填充的 BAF 溶液的管子插入 A 片孔中，然后填充腔室，同时用 10 毫升的 BAF 溶液清洗细胞。一旦成功获得所需的贴片配置，让通道电流在室温下稳定在静电浴中。

一旦电流稳定下来，请逐步应用剪切，使增加的电流在下一步剪切应力增加之前稳定下来。通过停止流向腔室，消除剪切接触到电池的剪切，使机械敏感通道电流回到静态浴中观察到的基线电流。此处显示的是来自原小鼠内肠内皮细胞的 Kir 电流的代表性原始记录，具有显著的线性向外泄漏电流。

超过 400 毫秒，对贴片应用负 140 到正 40 毫伏的斜坡。泄漏电流可防止对实际 Kir 通道活动进行分析。要减去泄漏电流，首先计算泄漏电流的线性斜率传导。

多个 G 斜率由整个原始跟踪的相应电压绘制原始数据上的泄漏电流。线应完全覆盖向外线性泄漏。然后，从整个轨迹中减去绘制的泄漏电流，使线性向外电流约为每皮科法拉德的零皮奥安佩雷斯，并可以分析真正的 Kir 电流。

尝试此过程时，要记住的最重要的事情是将盖玻璃正确定位在腔室中，以便细胞可供实验使用。此外，请确保盖滑完全粘附在 D 片上，这样液体流动不会破坏包含电池的盖玻璃。