在明确定义的剪切应力下进行单细胞离子电流的电生理记录

使用改良的平行板流动室可帮助研究人员解答关于机械敏感性离子通道对剪切应力功能反应的关键问题。该技术的主要优势在于，它能够在易于组装且可重复使用的平行板流动室内，实时研究流体激活的离子通道。开始操作时，在部件C的矩形区域边缘涂抹一层薄薄的硅酮弹性体溶液，然后轻轻将矩形盖玻片（部件D）直接放置在弹性体溶液上，完全覆盖部件C的开口矩形区域。仔细擦去多余的硅酮弹性体溶液。

然后，重复上述操作，将矩形盖玻片 F 片粘附至 E 片底部，并在室温下静置过夜，使硅胶弹性体溶液充分固化。接下来，通过依次叠加各部件的方式组装 MPP 流动室，首先放置底部腔室 E 片，然后依次为 C 片、B 片，最后将 A 片置于顶部。随后，对齐各部件角落处的螺丝孔，并用螺丝紧密固定，以防止在向 MPP 流动室施加流体时发生泄漏。

在六孔板中，每个孔内放置4至5个直径为12毫米的盖玻片。将细胞保存在10%至30%融合度之间，以便进行电生理记录时能够获取单个细胞。随后，在标准培养条件下孵育细胞，时间不少于2小时，以使细胞充分贴壁；但不超过24小时，因为内皮细胞在低密度接种超过24小时后会变得扁平，难以进行膜片钳记录。

接下来，从六孔板的一个孔中取出载有贴壁细胞的盖玻片，迅速用 PBS 冲洗。然后将带有细胞的盖玻片转移至含有 2 毫升电生理 BAF 溶液的 35 毫米培养皿中。立即再将带有细胞的盖玻片转移至 MPP 灌流室中。

将盖玻片圆片转移至矩形盖玻片（部件D）上，该盖玻片已粘附于MPP流动室的部件C。加入BAF溶液，完全浸没盖玻片圆片及细胞。随后，将盖玻片圆片放置在部件D上，使细胞与部件B的狭缝开口对齐。确保盖玻片圆片通过溶液与玻璃之间的粘附力牢固贴附于部件D，以避免流动施加时导致盖玻片位置发生偏移。

然后，按正确顺序将MPP流动室的各部件拧紧组装。将组装好的腔室转移至显微镜载物台上，并立即用BAF溶液对腔室进行灌注。接着，在实验中选择一个具有深色边界和明显细胞核的健康细胞。

避免选择出现空泡化或与其他细胞接触的细胞。为了控制剪切应力，通过将一个30毫升带刻度的注射器筒连接到配有微孔管的三通鲁尔锁接头上，建立重力灌流系统。接着，使用双面胶带将带刻度的注射器筒固定到围绕电生理设备的法拉第笼上。

在将管路插入MPP腔室之前，先用BAF溶液预填充注射器和管路。然后将管路插入组件A的MPP流动腔室入口孔中。用溶液预填充MPP流动腔室，使溶液流入真空储液器中。停止向腔室供液，并将量筒重新加液至最上方刻度线处。

通过秒表手动计算流速：使溶液在给定注射器筒高度下流经腔室。通过升高或降低注射器来调节流速，并使用以下公式计算平行腔室中的剪切应力。重复此过程，直至达到所需的剪切应力水平。

随后，将含有贴壁细胞的组装好的腔室转移至电生理设备的显微镜载物台上。将预先充满BAF溶液的管路插入A部件的孔中。同时，用10毫升BAF溶液灌注腔室并洗涤细胞。一旦成功获得目标膜片构型，即在室温下静置浴液中使通道电流稳定。

电流稳定后，逐步施加剪切力，每次增加剪切应力后需等待电流稳定，再进行下一步剪切应力的增加。通过停止向腔室灌流来解除对细胞的剪切力刺激，使机械敏感性通道电流恢复至静态灌流条件下观察到的基线水平。图中显示的是从小鼠肠系膜原代内皮细胞记录的典型Kir电流原始数据，可见明显的线性外向漏电流。

在400毫秒内对膜片施加从负140至正40毫伏的电压斜坡。漏电流会干扰真实Kir通道活性的分析。为扣除漏电流，首先计算漏电流的线性斜率电导。

将整个原始曲线中各点的电导（G）斜率与相应电压相乘，以在原始数据上绘制漏电流。该直线应与向外的线性漏电流完全重合。随后，从整个曲线中减去所绘制的漏电流，使向外的线性电流接近零皮安每皮法（pA/pF），从而可对真实的内向整流钾电流（Kir电流）进行分析。

进行此操作时，最重要的是要正确地将盖玻片放置在腔室中，以确保细胞能够被实验所触及。此外，务必确保盖玻片已充分粘附于D部件上，以防止液体流动干扰含有细胞的盖玻片。