Name: 荧光血管造影用于评估大鼠和兔动脉瘤模型中的动脉灌注和父动脉鉴赏 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 8 s
Description: 学习使用荧光视频血管造影技术评估大鼠和兔动脉瘤模型中的血流灌注情况。该方法无需昂贵设备即可实现实时可视化，阳性预测值达92.6%，为血管生物学研究提供简便可靠的解决方案。

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本研究部分得到了瑞士阿尔高州立医院研究基金的资助。

实验动物饲养于动物护理设施中，实验方案经瑞士伯尔尼大学动物福利委员会审查并批准（BE 108/16）和（BE65/16）。所有动物均维持在标准实验室饮食条件下，可自由获取食物和水。所有动物实验均在充分考虑“3R原则”（替代、减少和优化）的基础上进行。实验共纳入10只雌性新西兰白兔和48只雄性Wistar大鼠。严格遵循ARRIVE指南8。
注意：通过将去细胞化动脉血管袋缝合到供体兔的颈动脉上，在10只兔子体内构建了20个侧壁动脉瘤。此外，如先前所述4,9，在48只大鼠体内构建了48个显微外科侧壁动脉瘤。动脉瘤成模后4周进行影像学检查和大体分析。
1. 荧光素眼底血管造影所需材料的准备
<ol>
	<li>通过在手电筒上粘贴蓝色带通滤光片（参见材料表）对其进行改装，该滤光片将作为激发滤光片使用。改装后手电筒应仅发射蓝光。使用黑色胶带以避免未过滤的光泄漏。</li>
	<li>为相机（例如，连接至显微镜的相机）配备绿色带通滤光片（参见材料表），该滤光片将作为发射光滤光片使用。此时仅允许绿光通过。</li>
</ol>
2. 工作场所和材料的准备
<ol>
	<li>使用消毒液对工作区域进行消毒。</li>
	<li>用无菌铺巾覆盖台面，以防止污染。</li>
	<li>手术过程中使用无菌器械。</li>
</ol>
3. 手术前动物的准备
<ol>
	<li>称重动物。</li>
	<li>诱导麻醉，并根据体重调整剂量。
	<ol>
		<li>对于兔子，开始实施平衡麻醉。注射期间用一只手遮住其眼睛，以减少惊吓反应。用布单覆盖笼子，有助于镇静动物。</li>
		<li>在注射前，将大鼠置于含4%异氟烷和96%氧气的麻醉气体室中进行麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测麻醉深度。轻捏脚趾之间以确认动物是否已入睡。
	<ol>
		<li>将兔子重新置于仰卧位，此时应无反应。</li>
		<li>对于大鼠，轻捏其尾巴，确保无任何反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在啮齿类动物的眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。将大鼠的舌头拉出，以防吞咽。</li>
	<li>开始维持麻醉状态。
	<ol>
		<li>对于兔子，通过耳缘静脉插管（使用22 G带保护套的静脉留置针并连接注射端口，参见材料表），持续维持平衡&#160;麻醉。使用三通阀以便同时进行多次注射。</li>
		<li>对于大鼠，按50 mg/kg剂量腹腔注射盐酸氯胺酮，同时按0.5 mg/kg剂量注射盐酸美托咪啶。术中通过有害性脚趾夹捏测试监测麻醉深度；若出现反应，则追加麻醉药物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将动物仰卧位固定于手术板上，仔细剃除切口区域的毛发，并使用Betaseptic消毒。&#160;
	<ol>
		<li>对于兔子，消毒颈部区域，尤其是胸锁乳突肌周围。</li>
		<li>对于大鼠，从膀胱至横结肠区域进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整个手术过程中通过面罩给予氧气，并使用加热垫维持动物体温。</li>
</ol>
4. 动脉的制备
<ol>
	<li>为获得最佳效果，应将选定的血管与其周围组织彻底分离9,10。
	<ol>
		<li>对于大鼠，可识别尾静脉（侵入性较小，建议用于需存活的动物），或解剖股静脉以进行荧光素注射4,11。 
		注意：对于家兔，无需额外解剖血管，因耳缘静脉已用于麻醉给药。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在选定血管下方放置白色垫片，以增强血管与周围组织的对比度。</li>
	<li>调整显微镜上所安装相机的焦距，使其对准已解剖的动脉。</li>
</ol>
5. 荧光素眼底血管造影视频
<ol>
	<li>用铝箔包裹装有荧光素钠（100 mg/mL，参见材料表）的5 mL注射器，以避光保护。关闭光源（尽可能黑暗），通过静脉注射荧光素钠。应在黑暗条件下注射，以防止光漂白。
	<ol>
		<li>对于兔子，通过三通阀向耳缘静脉插管内按0.3 mL/kg剂量注射荧光素钠。</li>
		<li>对于大鼠，通过股静脉导管或25 G针头按0.4 mL/kg剂量注射荧光素钠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用0.5 mL生理盐水冲洗针头或导管，确保所有染料均被注入。</li>
	<li>使用改装后的手电筒照射手术区域。</li>
	<li>使用改装后的相机开始录像。注射后数秒内应可观察到血流（图1）。 
	注意：此处我们使用的参数为帧率 = 50 帧/秒，焦距 = 70 mm，光圈 = F3.4。</li>
</ol>
6. 宏观分析
<ol>
	<li>切除动脉瘤及其载瘤动脉复合体，用显微剪刀打开载瘤动脉，肉眼评估载瘤动脉的通畅性，并观察载瘤动脉管腔及动脉瘤开口情况（见图1、2）9。测量动脉瘤的大小。随后可将动脉瘤-载瘤动脉复合体保存以供进一步分析（如组织学检查）。</li>
</ol>

<ol><li>Kakucs, C., Florian, I. A., Ungureanu, G., Florian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescein+Angiography+in+Intracranial+Aneurysm+Surgery%3A+A+Helpful+Method+to+Evaluate+the+Security+of+Clipping+and+Observe+Blood+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22World+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Fluorescein Angiography in Intracranial Aneurysm Surgery: A Helpful Method to Evaluate the Security of Clipping and Observe Blood Flow.</a> World Neurosurgery. 105, 406-411 (2017).</li>
<li>Ajiboye, N., Chalouhi, N., Starke, R. M., Zanaty, M., Bell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unruptured+Cerebral+Aneurysms%3A+Evaluation+and+Management%5BTitle%5D)+AND+%22ScientificWorldJournal%22%5BJournal%5D)">Unruptured Cerebral Aneurysms: Evaluation and Management.</a> ScientificWorldJournal. 2015, 954954(2015).</li>
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</ol>

所有作者均确认无利益冲突。

FVA 是一种有前景且简便的方法，可用于检测啮齿类动物的血管，可使用商用设备和现成的仪器完成。在任何需要术中评估血管完整性的手术过程中，均可实施 FVA，但前提是血管需先经过适当的解剖分离。
作者倾向于静脉注射而非动脉注射，因为后者发生感染、缺血和骨筋膜室综合征等意外事件的风险更低12。静脉注射可实现可靠、空间局限且高浓度的染色，且所需染料剂量较小13,14。此外，静脉注射有助于荧光素的快速清除14,15。另一种方法是将造影剂直接注入选定的动脉。本实验未采用该方法，因为研究者希望避免血液和荧光素污染手术区域。为降低该风险，建议采用外周静脉注射造影剂13。
优势 &#160;FVA 具有高对比度（人眼易...

在动脉瘤手术中，完全动脉瘤闭塞及载瘤动脉完整性的证据至关重要。目前有多种方法可用于确认载瘤动脉通畅性和动脉瘤是否闭塞，例如多普勒超声、常规脑血管造影（DSA）、计算机断层血管成像（CTA）或磁共振血管成像（MRA）1,2。然而，这些方法成本较高且耗时较长，在实验室环境中往往难以实现。此外，这些技术可能带来显著的副作用，例如辐射暴露，或需要对实验动物追加镇静以避免运动伪影。
随着新型血管内器械的不断涌现，对这些器械进行临床前测试的需求也随之增加。然而，这些研究通常依赖于死后分析（例如大体病理学和组织学），缺乏关于动态灌注的信息。此外，对于研究人员而言，在实验性外科手术过程中获得即时且可靠的信息可能至关重要。荧光血管造影是一种经济高效且易于实施的可视化技术1,3,4。
因此，吲哚菁绿（ICG）血管造影术常用于临床神经外科手术中，并已得到广泛研究5,6。荧光素血管造影术（FVA）是一种替代技术，其额外优势在于产生的荧光信号位于人眼可见光波长范围内，因此无需扩展光谱红外相机即可用肉眼观察7。荧光素血管造影术在临床脑血管手术中的应用较少，关于其在实验环境中应用的报道也较为罕见1,4。
本报告旨在展示FVA在大鼠和兔类临床前脑血管研究中应用的可行性和适用范围。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;用于家兔&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物剃毛器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色滤光片</td><td>Thorlabs MF475-35</td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物保温板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Sony NEX-5R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>22G Vasofix Safety</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠</td><td>Fluorescein Faure 10%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>绿色滤光片</td><td>Thorlabs MF539-43</td><td></td><td></td></tr><tr><td>失禁垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>输液泵</td><td>Perfusor Secura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td></td><td></td><td>任何通用产品</td></tr><tr><td>针头</td><td>25G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>林格氏液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td>显微镊、显微剪、钝头手术剪</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml、5 ml、50 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三通阀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手电筒光源</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td></td><td></td><td>任何通用产品</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;用于大鼠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物剃毛器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色滤光片</td><td>Thorlabs MF475-35</td><td></td><td></td></tr><tr><td>动物保温板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Sony NEX-5R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>消毒剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠</td><td>Fluorescein Faure 10%</td><td></td><td></td></tr><tr><td>绿色滤光片</td><td>Thorlabs MF539-43</td><td></td><td></td></tr><tr><td>失禁垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td></td><td></td><td>任何通用产品</td></tr><tr><td>盐酸美托咪啶</td><td></td><td></td><td>任何通用产品</td></tr><tr><td>针头</td><td>25G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>林格氏液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术器械</td><td></td><td></td><td>显微镊、显微剪、钝头手术剪</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>OPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml、5 ml 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手电筒光源</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于评估大鼠和兔动脉瘤模型中动脉瘤灌注及载瘤动脉通畅性的荧光血管造影

Fluorescence Angiography for Evaluation of Aneurysm Perfusion and Parent Artery Patency in Rat and Rabbit Aneurysm Models

脑动脉瘤的治疗重点在于实现动脉瘤的完全闭塞，同时保持载瘤动脉的血流。荧光素钠和吲哚菁绿分别用于观察血流和血管灌注状态。本研究旨在对兔和大鼠建立侧壁动脉瘤模型后，应用荧光血管造影（FVA）验证动脉瘤的实时血流、血管灌注状态及闭塞情况，并在这些动物物种中验证该操作流程的有效性。
通过将脱细胞动脉血管袋缝合到供体兔的颈动脉上，在10只兔子中创建了20个侧壁动脉瘤。此外，在48只大鼠中创建了48个显微外科侧壁动脉瘤。在造模后一个月的随访期间，解剖主干动脉/动脉瘤复合体，并通过耳静脉导管（兔）或股静脉导管（大鼠）注射静脉荧光素（10%，1 mL）进行荧光血管造影（FVA）。随后收获动脉瘤，并通过肉眼评估其通畅性。
在大体观察下，16个兔动脉瘤中有14个显示载瘤动脉无残余血流，管腔完全闭塞，但其中11个（79%）通过荧光血管造影（FVA）被检测到。另有4个动脉瘤因技术问题被排除。在大鼠中，48例中有25例在大体上观察到动脉瘤残余灌注。在其余23例无大体灌注证据的病例中，FVA证实了其中22例（96%）存在动脉瘤。未发现与FVA相关的不良事件。荧光素易于应用，且无需特殊设备。该方法在实验环境下评估兔和大鼠的载瘤动脉完整性以及动脉瘤的通畅性/残余灌注情况是安全且极为有效的。使用荧光素作为对比剂的FVA在控制动脉瘤及其载瘤血管的通畅性方面表现出有效性，并可进一步适用于旁路手术。

手术期间监测心率和血压。兔子的平均心率为193次/分钟，大鼠的平均心率为196次/分钟。兔子的体重范围为3.05-4.18 kg，大鼠的体重范围为335-690 g。
在十只兔子中，我们成功对八只进行了FVA（图1）。由于技术问题，两只兔子的四个动脉瘤检查未被摄像记录。未见有关大鼠FVA操作中出现技术困难的报告。然而，由于股静脉穿刺困难，一只大鼠未能完成FVA。
在8只兔子的16个动脉瘤中，2个动脉瘤显示载瘤动脉持续灌注（经大体解剖证实）（见表 1），而FVA检测出5例存在残余灌注。14个兔动脉瘤在大体上未见残余灌注，但其中11例（79%）随后通过FVA被检出。在48只大鼠中，25只经大体观察发现存在残余灌注（表 1），其余23只大鼠在大体上未见残余灌注迹象（图 2）。这23个动脉瘤中的22个经FVA确认（96%）。总体而言，27例中有25例...

我们提出了一种利用基于荧光素的荧光视频血管造影（FVA）技术，高效评估大鼠和兔侧壁动脉瘤灌注情况及血管通畅性的实验方案。该方法无需特殊设备，操作简便，经济有效，其阳性预测值达92.6%。

脑动脉瘤治疗的重点在于实现完全闭塞，同时保留载瘤动脉的血流。荧光素钠和……

该方法是一种可靠且简便的技术，可用于可视化动脉瘤和血管中的实时血流，适用于多种动物模型。该技术的主要优势在于，无需昂贵设备或复杂的手术操作，即可在手术过程中实现血流的可视化。在开始操作前，使用黑色胶带将绿色带通滤光片固定在手电筒上，作为激发滤光片。并检查手电筒仅发射蓝光。为相机配备绿色带通滤光片，以用作发射光滤光片。此时，只有绿光应能通过。然后，使用消毒液对工作区域进行消毒，并用无菌铺巾覆盖台面，以防止污染。在兔子身上进行荧光素眼底血管造影（FVA）时，需确认麻醉后的动物对疼痛刺激无反应，再将兔子置于仰卧位。剃除胸锁乳突肌周围颈部的毛发。将相机对准解剖好的动脉，并用铝箔覆盖装有100毫克/毫升荧光素钠的5毫升注射器。尽可能关闭光源，通过导管的注射端口以0.3毫升/千克的剂量静脉注射荧光素钠。随后，用0.5毫升生理盐水冲洗注射器，以确保所有染料均已注入。立即用改装后的手电筒照亮手术区域。灯光开启后，立即使用改装后的相机开始拍摄。注射后几秒钟内应可观察到血流情况。在随访动物中，对血管造影后的血管进行肉眼分析时，切除动脉瘤及其载瘤动脉复合体，或在移除临时夹后通过观察动脉瘤和/或旁路的充盈情况来直观确认血流。在本项代表性研究中，10只兔子中有8只成功实施了血流可视化分析（FVA）。在8只兔子中发现的16个动脉瘤中，有2个动脉瘤显示载瘤动脉持续灌注，而FVA识别出5例存在残余灌注。14个兔动脉瘤在肉眼观察下无残余灌注，而后续通过荧光血管造影（FVA）检测出11个存在残余灌注。在48只大鼠中，有23只在肉眼观察下可见残余灌注，其余25只大鼠则未见肉眼可见的残余灌注迹象。在23个无肉眼可见灌注的动脉瘤中，有22个通过FVA得以确认。总体而言，27例兔和大鼠的联合病例中可确认25例，阳性预测值为92.6%，敏感率为100%，特异性为94.1%。进行该操作时最重要的两点是正确解剖血管，以及在注射和观察荧光素时于暗室中操作。该方法可用于任何动物模型，以评估任何可见血管中的血流情况。

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神经科学

荧光血管造影用于评估大鼠和兔动脉瘤模型中的动脉灌注和父动脉鉴赏

本文介绍了一种优化的显微外科技术，用于构建模拟人类脑动脉分叉部动脉瘤的动脉分叉部动脉瘤模型。将静脉囊缝合至两侧颈总动脉人工创建的真实分叉处。借助改进的显微外科操作技术，以及积极的术后抗凝和镇痛措施，可显著降低动物手术并发症发生率，并实现较高的动脉瘤通畅率。...

兔模型中静脉 pouch 动脉分叉动脉瘤的显微外科技术：技术要点

本视频介绍了通过向兔模型的降主动脉注射造影剂以实现血管造影的技术，用于观察血管灌注情况。该技术有助于理解血管在发生阻塞以及治疗后恢复期间的灌注状态。...

通过血管造影评估血管灌注：一种在兔模型中向降主动脉注入造影剂以可视化血管灌注的技术

来源：Wanderer, S., 等。兔动脉囊微血管吻合口动脉瘤模型。J. Vis. Exp.

利用经弹性蛋白酶处理的血管袋在兔体内建立实验性动脉瘤模型

通过将主动脉移植物与腹主动脉进行端侧吻合，可在大鼠体内构建显微外科侧壁动脉瘤。本文提供了详细的分步操作说明，并探讨了解剖学与外科技术细节，以成功建立实验性囊状动脉瘤。...

赫尔辛基大鼠显微外科侧壁动脉瘤模型

本文介绍了一种使用不透射线的含铅硅橡胶灌注小鼠血管系统的详细方法，用于在主动脉瘤和主动脉夹层小鼠模型中定量测定主动脉直径。...

利用微计算机断层扫描对β-氨基丙腈诱导的小鼠主动脉瘤与主动脉夹层疾病模型进行定量分析

冠状动脉血流储备（CFR）定义为最大冠状动脉血流量与静息冠状动脉血流量的比值。本文介绍一种通过超声评估大鼠CFR的实验方案，该方法可在无阻塞性冠状动脉疾病的情况下用于预测心血管危险因素。...

大鼠心肌缺血再灌注后冠状动脉血流储备的评估

开发和测试用于颅内动脉瘤治疗的血管内装置仍然具有重要意义。目前大多数动脉瘤模型要么缺乏动脉退化管壁的重要特征，要么无法模拟真实分叉处的血流动力学。因此，我们旨在设计一种新型的兔动脉囊状分叉模型。...

兔动脉囊微血管吻合分叉动脉瘤模型

本方案描述了建立具有两个经弹性蛋白酶消化且血流动力学不同的动脉瘤（残端型和分叉型构型）的兔模型的步骤。该模型可在单个动物体内，对具有不同血管结构和血流动力学条件的动脉瘤进行新型血管内器械的测试。...

在一只兔体内构建两个具有不同血流动力学特征的囊状弹性蛋白酶消化性动脉瘤

本文介绍了在兔子体内通过显微外科技术构建大型分叉动脉瘤的方法，用于评估血管内治疗装置。...

兔体内大型分叉动脉瘤的显微外科构建及其在血管内治疗器械评估中的应用

我们建立了脑室周围白质软化症（PVL）的小鼠模型，PVL 是早产儿主要的脑损伤类型，其特征为脑室周围白质损伤。缺氧/缺血伴或不伴全身感染是 PVL 的主要原因。通过单侧颈总动脉结扎联合缺氧暴露，伴或不伴脂多糖注射，可在出生后第6天（P6）小鼠中诱导出类似 PVL...

脑室周围白质软化小鼠模型

学习使用荧光视频血管造影技术评估大鼠和兔动脉瘤模型中的血流灌注情况。该方法无需昂贵设备即可实现实时可视化，阳性预测值达92.6%，为血管生物学研究提供简便可靠的解决方案。

用于评估大鼠和兔动脉瘤模型中动脉瘤灌注及载瘤动脉通畅性的荧光血管造影

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