Name: 线虫生殖道内精子引导和运动的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习利用线虫透明体表进行活体内精子迁移与行为定量分析的方法。该技术通过荧光标记和延时成像评估秀丽隐杆线虫子宫内精子分布、运动速度及导向机制，为生殖生物学研究提供重要工具。

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我们深切感谢已故的导师迈克尔·米勒博士（Dr. Michael Miller），感谢他富有启发性和无私的指导，以及创建了这一方法作为更好地理解精子与卵子通讯的工具。他的突然离世对其家庭、实验室以及科学界都是巨大的损失。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（MAM 获得 R01GM085105，MH 获得 F30HD094446）。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

注意：本方案中的所有步骤均在室温（约 20–22 °C）下进行，或在设定为 16 °C 或 20 °C 的恒温培养箱中进行。雄虫和雌雄同体的 C. elegans 采用标准培养条件培养，以 NA22 或 OP50 E. coli 作为食物来源21,22。以下实验步骤中使用野生型 N2 雌雄同体和 fog-2(q71) 雄虫。
1. 第1天：挑选L4期雌雄同体进行交配
<ol>
	<li>为获得一致的结果，应将所有雌雄同体个体同步为处于活跃繁殖期的成虫。挑选20-30只L4期的雌雄同体个体至一个6 cm涂有大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上。在20 °C条件下培养28-30小时。 
	注意：仅需使用12-15只雌雄同体个体进行交配实验，其余个体为多余。</li>
</ol>
2. 第1天：使用荧光线粒体染料（Mito-dye）对雄性进行染色
<ol>
	<li>通过放置一滴制作雄性染色板 E. coli （食物点）置于未接种的NGM平板中央。制备食物点时，用玻璃搅拌棒末端刮取 E. coli 从接种平板的细菌菌苔上取菌并接种到未接种的平板上，接种点直径应为 ~ 5–7 mm。</li>
	<li>混合在一起 2 µL 1 mM 线粒体染料（见 材料表) 溶于 DMSO 中 10 μL M9 缓冲液（3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 mL 1 M MgSO₄4，H20 至 1 L。加入 MgSO₄4 高压灭菌后）。用移液器将全部线粒体染料溶液滴加到雄性染色板的食物点上，避光干燥约30分钟。 
	注意： Mito-dye 对光敏感。所有含 Mito-dye 的溶液、培养板和线虫均需避光。将 1 mM 储存液置于 -20 °C.</li>
	<li>挑选约100只1至3日龄的成年雄性果蝇23 到雄性染色板上经线粒体染料染色的食物点。用铝箔纸包裹培养板，并在过夜孵育 16 °C交配时，每12–15条雌雄同体使用约50–60条雄虫。若需要超过约100条雄虫，应制备更多染色平板，以避免雄虫过度拥挤。 
	注意： 雄性个体也可通过在染色液中孵育进行染色 10 μM 在载玻片上用 M9 缓冲液中的 mito-染料溶液孵育线虫 3 小时。保持线虫覆盖，防止蒸发和光照。3 小时后，使用巴斯德吸管将雄虫转移至一块 10 cm 的接种 NGM 平板上，尽量减少 mito-染料溶液的转移量。用铝箔包裹平板，于 4°C 过夜孵育 16 °C.</li>
</ol>
3. 第2天：交配
<ol>
	<li>从第1天开始，挑选染色的雄虫转移到新的接种NGM平板上。将平板置于黑暗环境中直至交配。此步骤可确保去除雄虫周围过量的线粒体染料染色细菌。若将过多的染料染色细菌带入交配平板，可能导致雌雄同体组织被染色。</li>
	<li>通过滴加制备交配平板 2 μL 较厚的 E. coli 将混合物置于未接种的NGM平板上，待浓稠的细菌干燥后形成交配点。雄性和雌雄同体线虫将被转移至该交配点进行交配。制备浓稠 E. coli，离心3 mL过夜培养物 E. coli 并将细菌沉淀重悬于1 mL M9培养基中。该混合物可保存于 4 °C 可重复使用长达6个月。 
	注意： 厚度 E. coli 可根据需要调整溶液浓度。如果溶液过稀，雄性果蝇可能会爬离交配点，而非聚集在交配点进行交配。交配点由以下成分制备： E. coli 溶液过稠可能会降低交配效率。</li>
	<li>在步骤 3.2 的交配平板干燥的同时，混合以下成分 300 μL 1% (w/v) 三卡因（Tricaine，Tri） 300 μL 0.1% (w/v) 四甲基咪唑（Tet），以及 900 μL M9的 
	注意： 将1% (w/v) 三卡因和0.1% (w/v) 四咪唑以分装形式储存于-20 °C避免反复冻融。</li>
	<li>转移 600 μL 将Tet/Tri溶液滴加至表面皿中。</li>
	<li>将第1天挑选的12-15条雌雄同体线虫转移至表面皿中的Tet/Tri溶液。孵育30分钟以固定雌雄同体线虫。孵育期间保持表面皿加盖，防止Tet/Tri溶液蒸发。 
	注意： 雌雄同体需至少麻醉30分钟，时间不足可能导致成像过程中线虫移动，从而干扰成像效果。</li>
	<li>在雌雄同体孵化期间，从步骤3.1中挑选50–60只染色的雄虫，转移至交配点（步骤3.2）。将培养板避光保存，直至步骤3.8。</li>
	<li>在Tet/Tri溶液中孵育30分钟后，使用玻璃巴斯德吸管将固定化的雌雄同体从表面皿转移至未接种的NGM平板上。尽可能去除液体，并让多余的液体自然干燥。 
	注意： 不要让雌雄同体个体过度干燥。一旦所有可见液体蒸发完毕，立即开始下一步操作。</li>
	<li>将麻醉后的雌雄同体从无菌NGM平板转移至含有染色雄虫的交配点。避光孵育30分钟，使雄虫与雌雄同体完成交配。</li>
	<li>交配30分钟后，立即进行雌雄同体的活体成像，或将其转移至新的接种NGM平板上静置1小时后再进行成像。 
	注意： 通过延时录像记录雌雄同体子宫内的精子运动，用于量化精子速度和转向频率；交配后1小时拍摄的子宫静态图像用于量化精子分布或精子导向。</li>
</ol>
4. 第2天：固定线虫以进行观察
<ol>
	<li>用 H2O 中 2% 琼脂糖制备封片垫 
	注意：2% 琼脂糖可预先大量制备，分装至玻璃试管中，于 4 °C 保存。使用时每次取一份分装样品，微波加热融化，并置于加热块中以防止凝固。
	<ol>
		<li>制备封片垫时，将三片玻璃载玻片并排摆放，长边相互接触。在两侧的外侧载玻片上各叠加两层封口胶带。这些带胶带的外侧载玻片将作为支撑，使最终形成的琼脂糖垫厚度为“两层胶带的厚度”。</li>
		<li>在中间的载玻片（无胶带的载玻片）中央加入约 75 μL 融化的 2% 琼脂糖。立即在其上覆盖一片新的玻璃载玻片，使该上层载玻片与其他载玻片垂直，两端分别置于两个支撑载玻片的胶带上。</li>
		<li>静置使琼脂糖凝固（约 30 秒）。小心地将上层载玻片从琼脂糖垫上滑移移除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 2% 琼脂糖垫上加入 10–15 μL 的 Tet/Tri 溶液。将交配过的雌雄同体线虫转移至垫上，注意尽量减少细菌的转移。</li>
	<li>在琼脂糖垫上的线虫上加盖盖玻片。</li>
</ol>
5. 第2天：图像采集设置
注意：任何配备落射荧光装置、10倍和60倍物镜以及数码相机的直立显微镜均可用于获取精子分布图像。评估精子运动速度、定向速度和转向频率时，需使用能够采集时间序列图像的软件。
<ol>
	<li>交配后1小时进行成像
	<ol>
		<li>将载玻片置于显微镜载物台上。通过目镜使用10倍物镜和红色荧光发射滤光片（TRITC滤光片）在琼脂糖垫上扫描线虫。找到线虫后，短暂打开荧光光源，观察线虫是否已完成交配。若在子宫内可见精子，则切换至60倍物镜。 
		注意：60倍物镜对盖玻片施加的压力可能损伤部分脆弱的线虫，导致肠道或生殖腺从体内突出。使用10倍物镜先行扫描可减少线虫暴露于额外压力下的机会。避免让已交配的线虫长时间暴露于荧光光源下。</li>
		<li>采用微分干涉差显微技术（DIC），调整线虫位置，使其阴门和一个受精囊均可见。通过聚焦受精囊中心来调节图像清晰度。检查DIC和TRITC通道的曝光情况。在DIC图像中，线虫内部结构应清晰可见；在TRITC图像中，单个精子应表现为独立的点状荧光信号。 
		注意：每幅图像应包含从阴门至其中一个受精囊的整个子宫区域。若子宫过长无法在单幅图像中完整呈现，可分别拍摄两幅图像。所有图像无需保持完全相同的曝光水平，但必须确保荧光图像中单个精子可被清晰分辨并用于定量分析。</li>
		<li>对每个子宫分别采集DIC和荧光图像。</li>
		<li>重复步骤5.1.1–5.1.3，直至所有已交配的雌雄同体线虫均完成成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集延时视频
	<ol>
		<li>扫描琼脂糖垫，定位子宫内含有标记精子的雌雄同体线虫，方法同步骤5.1.1和5.1.2所述。</li>
		<li>设置软件以在DIC和TRITC通道中采集延时图像。通常，每15–30秒采集一次图像，每个子宫持续采集10–20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 定量分析
<ol>
	<li>交配后1小时子宫图像中精子分布的定量分析
	<ol>
		<li>从一端的外阴到另一端的受精囊，将子宫分为三个相等部分，分别代表三个区域。区域1（Z1）包含外阴，区域3（Z3）包含受精囊。</li>
		<li>手动计数子宫每三分之一部分内的精子数量，并将每个区域的精子数报告为整个子宫总精子数的百分比。以下提供了一个示例。 
		<img alt="精子分布公式（%精子在Z3中 = Z3/(Z1+Z2+Z3)）。数学方程。" src="/files/ftp_upload/59783/59783eq1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程"> 
		注意：有时需要调整TRITC通道图像的信号强度，以便使图像中捕获的每一个精子均可见并可被定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在延时图像中追踪精子 
	注意： 在本文中，我们使用 NIS-Elements 软件进行分析。在下述章节中，我们将介绍使用该软件手动追踪精子的操作步骤（步骤 6.2.1），以及使用开源软件 ImageJ/Fiji 的操作步骤（步骤 6.2.2）。
	<ol>
		<li>使用 NIS-Elements 追踪精子
		<ol>
			<li>打开包含待追踪延时序列的 .nd2 文件。要开始追踪，请在软件中右键单击并选择以打开追踪面板 分析对照 | 追踪.</li>
			<li>在追踪面板中，选择 定义新感兴趣区域. 通过单击需要追踪的每一条精子来定义每个感兴趣区域（ROI）。被选中的精子上方将出现一个彩色标记。单击 完成 当所有感兴趣区域均被选中后。</li>
			<li>一旦确定了感兴趣区域（ROI），则移动到延时序列的下一帧。将 ROI 标记拖动至图像中精子的新位置。持续执行此操作，直至无法继续追踪精子为止。虚线将连接 ROI 标记在延时图像各帧中所有放置过的位置。 
			注意： 仅应追踪2区的精子，因为1区和3区的精子即使在野生型动物中也倾向于作圆周运动。</li>
			<li>单击以将追踪到的精子的所有可量化数据（例如，路径长度、时间、XY 位置等）导出到 Excel 文档 导出 在追踪面板中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 Fiji 追踪精子
		<ol>
			<li>将延时系列中的TRITC通道图像转换为.tif文件。将同一系列的所有文件保存到同一个文件夹中。</li>
			<li>使用 BioFormats 导入功能将图像导入 Fiji。将同一时间序列的图像作为单个超堆栈导入。</li>
			<li>在 Fiji 中打开 TrackMate24 通过 插件 | 跟踪 | 使用 TrackMate 进行手动跟踪. 将打开一个对话框。</li>
			<li>在 Fiji 工具栏中选择 TrackMate 工具。双击将要追踪的精子。将出现一个带虚线的绿色圆圈。通过在圆圈内单击并拖动到所需位置，可重新定位该圆圈。通过同时按下 ALT 键和滚动鼠标。</li>
			<li>设置好追踪器的大小和位置后，再次单击圆圈。虚线绿色线条将变为实线绿色线条。同时按下 SHIFT 和 L 用于开启追踪模式的按键。这将在 Fiji 工具栏中显示。</li>
			<li>移动到延时序列的下一帧。要设置追踪精子在新帧中的新位置，请将鼠标悬停在新位置上并按下 A 关键。追踪器将出现在新的位置，且会显示一条线连接追踪器在之前各帧中所在的位置。</li>
			<li>完成轨迹绘制后，单击 分析 在 TrackMate 对话框中生成所需数据。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算速度时，将精子的总运动路径长度除以经过的时间。</li>
		<li>为计算矢量速度，从阴门开始沿子宫画一条指向受精囊的直线。测量精子在该直线上从轨迹起点到终点所迁移的距离，将该距离除以经过的时间。负值表示精子向远离受精囊的方向迁移。</li>
		<li>记录倒转频率时，统计精子轨迹产生小于 90° 在连续三个时间推移图像帧期间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

精子在复杂的雌性生殖道中游动并找到卵母细胞的能力对有性生殖至关重要。最近对体内受精动物精子的研究表明，精子能够主动响应多种环境线索，包括化学信号、液体流动和温度梯度1,5,7,9,12。然而，这些观察结果主要来自体外实验，关于精子在生殖道内的行为和通讯机制仍知之甚少。获取精子迁移和运动能力的体内数据的主要障碍之一，是大多数雌性生殖道内部缺乏可视性。本文所描述的利用C. elegans的方法克服了这一局限。如代表性结果所示，其透明的表皮使得能够在完整、活体的生物体内以单细胞分辨率直接观察和追踪每一个精子。
C. elegans 具有两种性别。雄性为 XO 基因型，仅产生精子，在本方法中用作精子供体。雌雄同体为 XX 基因型，是经过修饰的雌性个体。其生殖腺在第四幼虫期首先进行精子发生，成年后则转为卵子发生25。本实验采用成年雌雄同体个体，其生殖组织可作为雌性生殖道的模型。该实验同时利用两种性别，有助于我们鉴定调控精子导向和运动能力的雄性和雌性中的遗传与分子通路。结合适用于 C. elegans 的一系列遗传与分子技术，该方法可为精子迁移与运动机制以及精子与卵细胞间的通讯提供新的见解。
除了方案部分提供的细节外，本方案中的几个关键步骤还需进一步考虑。
线虫 
可使用 fog-2(q71)、him-5(e1490) 或 him-8(e1489) 突变型雄虫代替 N2 雄虫。这些突变可提高培养物中雄虫的出现频率，但不影响雄虫交配行为或精子功能13。可使用雌性个体（如 fog-2(q71) 雌虫）代替两性同体虫。然而，雌性个体必须预先与雄虫交配，以保证卵母细胞正常发育。此次预交配所产生的受精胚胎的存在，还可确保子宫足够长，以便准确评估精子分布情况。若需检测突变体或实验组的两性同体虫，应设置对照组。例如，应将突变体两性同体虫与野生型 N2 两性同体虫并列比较，以控制实验中其他变量的影响。对于通过喂食含 RNA 干扰质粒的细菌处理的两性同体虫，也应设置喂食含空载体对照质粒细菌的对照组。精子授精部位（阴门）至受精部位（受精囊）之间的距离可能因子宫内卵子数量不同而变化（即子宫会随着卵子数量增加而扩张）。若需在不同基因型之间进行比较，应选择子宫内卵子数量相近的两性同体虫。避免选择含有正在孵化的胚胎或活动幼虫的个体。可通过时间进程实验确定最适合进行检测的两性同体虫龄期。
挑选雌雄同体与雄性个体 
用于本实验的雌雄同体必须避免来自过度生长或食物耗尽的培养板。食物和信息素信号可调节DAF-7（一种TGFß同源物）的表达。研究表明，DAF-7信号通路可调控F系列前列腺素的合成，而这些前列腺素在引导精子进入受精囊过程中发挥重要作用20。若从过度拥挤或缺乏食物的培养板上挑选雌雄同体，可能导致精子导向缺陷，但该现象并非由目标基因引起。培养板的种群密度似乎不影响雄性精子的功能。然而，年龄过小或过大的雄性个体可能导致交配效率下降（即在交配板上，子宫内含有足够精子数量可用于定量分析的雌雄同体所占的百分比降低）。1至3日龄的成年雄性个体最适合本实验23。
麻醉雌雄同体线虫 
在我们的实验操作中，四咪唑（Tetramisole）与三卡因（Tricaine）联用可有效使线虫完全 immobilized（固定不动），同时在交配过程及图像采集期间保持其存活状态。其他麻醉剂（如叠氮化钠）亦可用于此目的，但叠氮化钠具有高毒性，需严格标准化使用条件。使用微珠、琼脂糖或微流控腔室等物理固定方法不被推荐，因其会干扰线虫的正常交配行为。
雄性染色 
本研究中使用的线粒体染料 MitoTrackerCMXRos 已被广泛用于标记 C. elegans 的精子以及其他线粒体结构。使用该线粒体染料标记的精子功能完整，能够正常激活、迁移、使卵细胞受精，并产生可存活的后代26,27。其他线粒体染料，如罗丹明6G（rhodamine 6G）和DiOC6，也曾用于染色 C. elegans 的线粒体28,29。然而，这些染料在本实验中用于标记精子时，其使用条件尚需标准化。除了线粒体标记方法外，DNA染料（如Syto17）也可用于精子迁移实验中的精子标记30。尽管这些染色技术操作相对简便快捷，但也可采用转基因策略，构建在精子特异性启动子驱动下表达荧光标签的精子模型31,32。
交配 
交配点过厚可能会降低交配效率。在将雄性和麻醉的雌雄同体转移到交配点时，应尽量减少细菌的转移量。
制备琼脂糖垫并放置盖玻片 
琼脂糖垫中可能产生气泡。这些气泡在图像采集过程中可能折射光线，或者当气泡足够大时导致线虫掉落，从而无法获取图像。同样地，当将盖玻片放置在琼脂糖垫上的雌雄同体线虫上时，线虫周围也可能产生气泡。这些气泡会折射光线，导致图像质量下降。通过练习可减少气泡的产生。
定量分析 
在对精子分布进行定量时，通过线虫子宫的不同z平面可能存在精子分布的细微差异。我们发现，对受精囊中心进行单次成像所获得的结果具有良好的可重复性，并且与通过平均多个z切片得到的结果相似。我们建议将图像聚焦于受精囊的中心，但也可以根据实验者的具体需求略微调整焦平面。然而，所有图像必须以相同的方式采集。此外，仅计数处于清晰对焦状态的精子至关重要。判断精子是否在焦内由计数者自行确定标准，但该标准必须系统性地应用于每一个被定量的线虫。对于精子运动轨迹追踪，许多软件提供自动追踪功能。然而，我们发现手动追踪在两个主要方面优于软件的自动追踪算法：1）在有限空间内存在大量大小相似的细胞核，导致软件难以区分单个精子并为每个精子建立明确的感兴趣区域（ROI）；2）当精子进出焦平面时，其荧光强度会发生变化，使得软件难以在较长时间内持续追踪同一精子。

精子（spermatozoa，简称精子）在雌性生殖道中向卵母细胞迁移的分子机制尚不完全清楚，但这些机制对于有性生殖至关重要。精子运动具有高度动态性，依赖于强大的信号通讯，这些信号可改变精子的速度和定向运动能力1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。C. elegans 已成为研究体内精子运动的有力模型，因为其雌雄同体的透明表皮允许以单细胞分辨率追踪活体精子的运动2,3,8,10。本文旨在提供在 C. elegans 雌雄同体子宫内评估精子运动的方法。
在精子与卵子于外部环境（即水生环境）中相遇的动物物种中，精子会响应卵子分泌的趋化信号。这些信号可引导精子的运动方向，使其逐渐靠近信号源4,6,11。然而，对于进行体内受精的物种，其精子运动机制的研究则相对较少。其中主要挑战在于雌性生殖道的结构复杂，在大多数物种中难以通过显微技术进行观察。例如，人类、小鼠和猪的体外研究表明，部分精子亚群能够响应化学吸引物、液体流动以及温度梯度1,5,7,9,12。然而，由于无法在活体中直接观察和追踪精子的运动，这些系统在揭示调控上述功能的关键机制方面存在严重局限。
为了克服这些局限性，我们开发了利用线虫 C. elegans 的方法，以直接观察授精后的精子，活体测量单个精子的迁移参数，并评估一群精子靶向受精部位的能力。这些方法结合 C. elegans 的分子与遗传工具包，有助于发现调控精子运动行为的化学信号分子和分子机制。例如，可在雌雄同体或雄性个体中进行遗传筛选，以鉴定对体内高效精子运动至关重要的基因13。可通过向雌雄同体的性腺注射分子，检测其对精子激活、迁移速度和定向运动能力的影响3。此外，所描述的方法还可用于监测异常精子向异位体腔区域的迁移，以及评估精子竞争能力10,14。
C. elegans 在自然界中以雌雄同体和雄性两种形式存在（见图1）。雌雄同体的性腺具有两个呈镜像对称的U形臂。在L4幼虫阶段，最靠近受精囊（spermatheca）的近端生殖细胞开始进行精子发生。每个初级精母细胞进入减数分裂，产生四个单倍体的精细胞。这些精细胞随着第一个成熟的卵细胞被推入受精囊，并在此处完成精子形成（spermiogenesis）15。成年雌雄同体个体随后由精子发生转换为卵子发生。卵细胞在性腺中以流水线方式依次成熟，其中最成熟的卵细胞位于性腺近端，紧邻受精囊。精子释放的MSP信号是触发卵细胞减数分裂成熟和排卵所必需的16,17。相比之下，雄性 C. elegans 具有J形性腺，仅产生精子。精细胞储存在精囊中。当雄性与雌雄同体或雌性交配时，其尾部附近的交配刺会插入对方的阴门。在射精过程中，精细胞接触到精液后被激活18。C. elegans 的精子无鞭毛，因此不能游动，而是依靠伪足爬行通过生殖道。已有充分证据表明，体型更大的雄性精子在与雌雄同体精子的竞争中具有优势14。
在本方法中，雄性 C. elegans 作为精子供体，与成年雌雄同体个体进行交配。成年雄虫经荧光线粒体染料染色，以产生标记的精子。精子通过雌雄同体的阴门释放后，必须在子宫内绕过胚胎，向受精部位——精囊（spermatheca）移动。由于 C. elegans 模型具有透明的表皮，可直接观察单个精子在雌性生殖道内的迁移过程。近年来，本实验室已成功利用该方法证明了一类F系列前列腺素在引导精子从阴门向精囊迁移过程中的重要作用19,20。然而，雌雄同体合成该信号分子的分子机制以及精子对其响应的机制仍在研究之中。该评估精子运动能力与迁移行为的方法，极大促进了对体内受精动物中精子与卵母细胞间通讯关键调控因子的鉴定。以下实验方案将逐步介绍该检测方法的具体操作步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂与材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm × 15 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（Miller 配方）</td><td>Fisher</td><td>1426-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; 菌株 NA22</td><td>秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）</td><td>NA22</td><td>NA22 或 OP50 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 均可用于&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 的维持与实验。两者均可从 CGC 购买</td></tr><tr><td>N2</td><td>CGC</td><td>N2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;fog-2(q71)&lt;/em&gt;</td><td>CGC</td><td>CB4108</td><td></td></tr><tr><td>直径 0.25 mm 铂金丝</td><td>Alfa Aesar</td><td>10288</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; 一次性巴斯德吸管</td><td>Fisher</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>表面皿</td><td>Fisher</td><td>02-612A</td><td></td></tr><tr><td>直径 5 mm 玻璃棒</td><td>Fisher</td><td>50-121-5269</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker CMXRos（线粒体染料）</td><td>Fisher</td><td>M7512</td><td>避光，-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher</td><td>S374-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Fisher</td><td>BP231-1</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher</td><td>01-213-102</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸乙酯间氨基苯甲酸</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>Tricaine 为通用名。分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>盐酸四咪唑</td><td>Sigma</td><td>L9756-5G</td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-548-A</td><td>18 × 18-1</td></tr><tr><td>磨砂载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &amp;deg;C 和 20 &amp;deg;C 恒温培养箱</td><td>Fisher</td><td>97-990E</td><td>同一型号，设定不同温度</td></tr><tr><td>配备落射荧光照明器、相机及 10× 和 60× 物镜的正置显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>具备图像采集与追踪功能的软件</td><td>Nikon</td><td>NIS-elements AR</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>任何可用于观察 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 的体视显微镜均可用于本方案</td></tr></tbody></table>

测量精子导向性与运动能力 秀丽隐杆线虫 雌雄同体生殖道

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

成功的受精作用对于有性生殖至关重要，然而关于精子在雌性生殖道内如何被引导至卵细胞的机制，目前所知甚少。尽管体外研究表明，进行体内受精的动物的精子能够对周围环境中的多种信号产生响应，但由于无法直接观察精子在雌性生殖道内部的行为，使得人们难以理解其在天然环境中的迁移与运动特性。本文介绍一种利用 C. elegans 的方法，克服了这一局限，并充分利用了该物种体表透明的特性。C. elegans 雄性个体经线粒体&#160;染料染色后，与成年雌雄同体个体（作为改良的雌性）交配，将带有荧光标记的精子注入雌雄同体的子宫中。随后，可在活体雌雄同体个体中利用落射荧光显微镜直接追踪标记精子的迁移和运动行为。在野生型个体中，约90%的标记精子会爬行通过子宫并到达受精部位，即精囊。可在交配后1小时拍摄子宫图像，以评估精子在子宫内的分布情况以及到达精囊的精子比例。或者，也可在交配后立即进行延时成像，用于评估精子的运动速度、定向速度及转向频率。该方法可与其他适用于 C. elegans 的遗传学和分子工具相结合，用于鉴定调控雌性生殖道内精子导向与运动能力的新型遗传和分子机制。

为获得本文所示结果，将 fog-2(q71) 雄性线虫用线粒体染料染色后，与野生型 N2 雌雄同体线虫交配。图2 概括了该方法的整体流程，包括线虫准备、交配和分析过程。如视频1所示，成年雌雄同体线虫的生殖道具有两个互为镜像的分支。交配时，标记的精子通过阴门进入雌雄同体的子宫。精子在子宫内绕过正在发育的胚胎，向储精囊方向移动，并在此储存直至受精。当成年雌雄同体线虫的生殖细胞发育为卵母细胞时，最靠近近端的成熟卵母细胞通过鞘细胞收缩被推入储精囊。卵母细胞在储精囊内完成受精。
为了定量分析精子在雌性生殖道内的分布与迁移情况，将雌雄同体的子宫划分为三个区域（视频1，图3A）。区域1从阴门开始，覆盖子宫的前三分之一部分；区域2覆盖子宫的中间三分之一部分；区域3则包括子宫的最后三分之一部分以及精囊（spermatheca）。使用野生型N2雌雄同体与fog-2(q71)雄虫进行正常交配时，应有约90%的标记精子到达精囊，即区域3（图3B）。若交配后子宫内精子数量过少（图3C，少于10–15个精子）或过多（图3D，子宫内充满精子），此类样本不应纳入统计。当子宫内精子数量少于10–15个时，3–4个异常迁移的精子可能显著干扰数据分析结果。同样，当子宫完全被精子充满时，精子无法正常迁移。某些表现出精子导向缺陷表型的突变体中，精子可能看似在子宫内广泛弥散，但此时精子不应完全填满子宫的每一个角落，如图3D所示。每条性腺臂的定量结果被视为一个独立样本，即一个n值。
通过延时成像来定量分析精子运动速度和转向频率。仅应追踪第2区内的精子（图4A）因为第1区和第3区的精子（视频 1）在野生型动物中也倾向于以环形轨迹运动。通常以15-30秒的时间间隔拍摄延时图像以追踪精子。仅对连续2.5-3分钟以上可在连续帧中被追踪的精子进行定量分析。在 图4B- M红点和蓝点标记的精子符合此标准，而绿点标记的精子不符合。因此，所定义的数值在 图4N 由红点和蓝点标记的精子被用于定量分析（图 4O），而由绿点标记的精子未进行量化。
<img alt="雌雄同体与雄性解剖结构示意图；标注了生殖系、卵细胞、阴门、受精囊、精囊。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：C. elegans 成虫雌雄同体与雄性的示意图。 图中标注了主要的生殖结构。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体染色实验流程图；利用荧光显微镜进行线虫交配及分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：样品制备与数据采集的示意图。 用线粒体染料染色的雄虫与同步化的成年雌雄同体线虫进行交配。交配后立即对交配过的雌雄同体线虫进行延时成像，以获取精子运动速度和反向频率的数据。交配后1小时对交配过的雌雄同体线虫拍摄静态图像，以评估精子在子宫内的分布情况。更多细节请参见正文。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡图；通过荧光显微镜进行精子分布分析；区域定量" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：量化雌雄同体子宫内的精子分布 (A）。示意图 秀丽隐杆线虫 雌雄同体子宫。V = 阴门，E = 胚胎，S = 精囊，O = 卵母细胞，Z1-Z3 = 用于测量精子分布的1-3区。B-D）。野生型雌雄同体子宫在交配后1小时的DIC与TRITC叠加图像（左图）及仅TRITC图像（右图） fog-2(q71）经线粒体染料染色的雄性。精子呈红色。黄色轮廓标示精囊的位置。比例尺： 20 μm. B 中 Z1、Z2、Z3 的定量表示每个区域中精子所占百分比 ± 标准差。图中 C 和 D 代表配对产生的后代数量过少（C）或过多（D用于定量的精子 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="精子运动性分析、荧光显微镜示意图、速度与转向频率计算。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59783/59783fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：子宫内迁移过程中精子速度与转向频率的定量分析。（A）雌雄同体子宫的DIC与TRITC合并图像，显示荧光标记的精子（红色）。V = 阴门，黄色 = 受精囊，Z1-Z3 = 子宫的三个区域，黑框：第2区。（B-M）对第2区（A中黑框区域）进行TRITC通道延时成像的局部放大图。图像采集间隔为20秒。每张图像中追踪了3个独立的精子（红、绿、蓝点）。图M中的彩色点表示来自图B-L中各精子的运动轨迹。比例尺 = 20μm。（N）精子运动速度、矢量速度和转向频率的计算公式与定义。（O）由图B-L中红点和蓝点追踪所得精子的运动速度、矢量速度及转向频率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/59783fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="鞘收缩与排卵过程，生物学图解，线虫解剖学研究，显微镜观察。" src="/files/ftp_upload/59783/59783movie1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Movie 1"> 
视频 1：精子运动与迁移过程的动态影像。 将野生型雌雄同体线虫与经 mito-染料标记的 fog-2(q71) 雄虫交配。该视频由在不同时间间隔拍摄的时间序列图像合成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59783/Movie_1_final.mp4" target="_blank">请点击此处观看该视频。（右键可下载。）</a>

精子必须成功穿过输卵管才能使卵子受精。本文中，我们描述了一种用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）雌雄同体子宫内精子迁移的实验方法。该方法可提供交配后精子在子宫内分布的定量数据，以及精子运动速度、定向速度和转向频率等参数。

成功受精对于有性生殖至关重要，然而关于精子在雌性体内如何被引导至卵母细胞的机制，目前所知甚少……

该方法为科学家提供了一种工具，用于研究影响精子在雌性生殖道内天然环境中迁移和行为的环境遗传因素。该技术的主要优势源于秀丽隐杆线虫（C.elegans）透明的表皮，使得实验人员能够轻松地在活体动物中观察并记录精子的运动。开始时，使用由巴斯德移液管和一端压平的铂金丝制成的线虫挑取工具，挑取20至30只L4期的雌雄同体线虫，并将其轻轻转移至一个六厘米、接种过的NGM平板上。将雌雄同体线虫在20摄氏度下培养28至30小时。接着，制备一个用于雄虫染色的培养皿。用玻璃涂布棒的末端从已接种的培养皿的细菌菌苔上刮取大肠杆菌（E.coli），并将菌液转移至未接种的NGM培养皿中央，形成直径为5至7毫米的食物斑点。在微量离心管中，将2微升浓度为1毫摩尔的溶于DMSO的线粒体染料与10微升M9缓冲液混合。用移液器将全部线粒体染料溶液滴加到雄性染色板的食物点上。将培养板置于避光处干燥30分钟。在显微镜下，于含有1至3日龄成年秀丽隐杆线虫（C.elegans）的培养皿中，通过其扇形尾部识别雄性个体。挑选约100条雄性个体转移至雄性染色板上含有线粒体染料标记的食物点中。用铝箔包裹培养皿，在16摄氏度条件下过夜孵育。第二天，将染色后的雄虫转移至新的接种NGM平板，以清除多余的经线粒体染料染色的细菌。将平板避光保存直至交配。制备交配平板时，在未接种的NGM平板上滴加两微升浓稠的E.coli混合液。等待约10至15分钟，直至浓稠的细菌干燥形成交配点。在等待交配平板干燥的同时，将300微升1%（重量/体积）三卡因、300微升0.1%（重量/体积）四咪唑和900微升M9混合均匀。取600微升四咪唑/三卡因溶液转移至表面皿中。用第1天挑选的12至15条雌雄同体线虫，将其转移至表面皿中的四咪唑/三卡因溶液内。将培养皿的下半部分盖在表面皿上，以防止蒸发，并孵育30分钟以固定雌雄同体。接着，从暗处取出含有染色雄虫的接种NGM平板，挑取50至60条染色雄虫至交配平板的干燥交配点上。将平板置于暗处保存。将雌雄同体线虫固定后，使用玻璃巴斯德移液管从表面皿中吸取已固定的雌雄同体线虫。注意避免将线虫吸入移液管的狭窄部分以上。将线虫转移至未接种的NGM平板上。尽可能去除液体，并让多余的液体干燥。一旦所有可见的液体蒸发完毕，立即将麻醉的雌雄同体转移到含有染色雄虫的交配点上。在避光条件下孵育30分钟，以允许交配进行。若需评估精子分布情况，可将交配后的雌雄同体线虫转移至接种有菌的NGM平板上，静置1小时后再进行制片观察。为制备用于观察的线虫样本，首先在预先制备的2%琼脂糖胶垫上滴加10至15微升四甲唑啉/三卡因溶液，然后将交配后的雌雄同体线虫转移至胶垫上的溶液中，最后盖上盖玻片。将玻片置于配备落射荧光装置的正置显微镜上，调整线虫位置，使其阴门和一个受精囊均可见。通过聚焦受精囊中心来调节图像清晰度。检查微分干涉差（DIC）和四甲基罗丹明（TRITC）通道的曝光情况。在微分干涉相差（DIC）图像中，线虫内部结构清晰可见。在TRITC通道中，单个精子呈现为明显的点状结构。对每个子宫分别采集DIC和荧光图像。为了拍摄延时视频，首先找到子宫内含有标记精子的雌雄同体个体。在采集面板中，将图像采集间隔调整为15至30秒，持续时间为每个子宫10至20分钟。然后点击“运行”按钮，以微分干涉差（DIC）和TRITC通道采集延时图像。从一端的阴门到另一端的受精囊，将子宫分为三个区域，其中包含阴门的为第一区，包含受精囊的为第三区。人工计数子宫每三分之一区域内的精子数量，并将每个区域的精子数以占整个子宫总精子数的百分比形式报告。如有必要，可使用查找表调整TRITC通道图像的信号强度，以确保每个精子均可见并可被定量。为了在延时图像中追踪精子，使用 Fiji 软件进行分析。利用 Bio-Formats 导入功能将一个延时序列的图像作为单个超堆栈导入。然后，依次点击插件、追踪，再选择手动追踪。在打开的对话框中，选择 Fiji 工具栏中的 TrackMate 工具。双击需要追踪的精子。点击出现的带虚线的绿色圆圈内部，并拖动至目标位置。再次点击圆圈。虚线绿色线条将变为实线绿色线条。同时按下 Shift 键和 L 键以开启跟踪模式。移动到延时序列的下一帧。要在新帧中设置被追踪精子的新位置，请将鼠标悬停在新的位置点，然后按下 A 键。追踪器将出现在新位置，并显示一条连线，连接此前帧中追踪器所在的位置。对其余各帧重复相同步骤。完成轨迹绘制后，单击 TrackMate 对话框中的“分析”以生成所需数据。为计算速度，将精子的总路径长度除以经过的时间即可。为计算矢量速度，从阴门开始，沿子宫画一条指向受精囊的直线。使用直线工具测量精子在轨迹起始到结束期间沿此直线迁移的距离，再将该距离除以经过的时间。负值表示精子已从受精囊迁移出去。记录倒退频率时，统计精子轨迹在连续三个时间序列图像中产生小于90度夹角的次数。在本实验方案中，fog-2 q71雄性线虫经线粒体染料染色后，与野生型N2雌雄同体线虫交配。成年雌雄同体的生殖道具有两个互为镜像的臂状结构。交配时，标记的精子通过阴门进入雌雄同体的子宫。精子在子宫内绕过正在发育的胚胎，向精囊方向移动，并储存在该处直至受精发生。将雌雄同体子宫分为三个区域，以量化精子分布与迁移。为评估精子运动速度和转向频率，仅对第二区域内的精子通过延时成像进行追踪。第一区域自阴门起始，第三区域包括受精囊，这两个区域的精子通常呈环形运动模式。红色和蓝色圆点标记的精子其运动速度和反向频率被量化。在量化子宫内精子分布时，使用野生型 N2 雌雄同体和 fog-2 q71 雄性进行正确的精子引导，可使约 90% 的标记精子到达受精囊。如果交配导致子宫内精子过少或过多，填满每个皱褶，则不应计入数据。在每次转移操作过程中，必须轻柔地处理动物，确保雌雄同体完全固定，并且将含有 myo-dye 的培养板和线虫避光保存。该方法可与基因敲低或基因敲除实验、环境或化学暴露实验或其他干预手段联合使用，以鉴定可能调控精子迁移的因素。本技术已帮助我们鉴定出在引导精子向卵细胞迁移过程中起重要作用的特定前列腺素。这些前列腺素通过一种非传统的机制合成，该机制可能在更高等的哺乳动物中具有保守性。四咪唑、三卡因和二甲基亚砜对皮肤和眼睛具有刺激性，在高剂量下可能具有毒性作用。操作任何化学品时，务必穿戴适当的防护装备。

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