Name: 循环死亡后心脏捐献的临床前模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 了解循环死亡后心脏捐献的临床前模型，使用麻醉成年大鼠评估心脏保护策略。该方法通过Langendorff离体灌流系统测试不同干预条件，为扩大移植器官来源提供研究框架。

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本工作的部分研究得到了马塞尔和罗兰德·戈塞林基金会以及斯蒂芬·富米先生基金会的慷慨资助。Nicolas Noiseux 是魁北克健康研究基金会（FRQ-S）的学者。
作者感谢 Josh Zhuo Le Huang、Gabrielle Gascon、Sophia Ghiassi 和 Catherine Scalabrini 在数据收集过程中提供的支持。

所有动物护理和实验方案均符合《实验动物护理和使用指南》的要求，并已获得蒙特利尔大学医院研究中心机构动物护理与使用委员会的批准。
1. 初步准备
<ol>
	<li>打开水浴，加热心脏停搏液输送系统（图 1A）和离体 Langendorff 灌注系统（图 1B）。将水温设定为 38.5 °C，以使溶液温度达到 37 °C。装置设置照片见补充图 1A,B。</li>
	<li>准备 1 L 心脏停搏液。向 1 L Plasma-Lyte A（140 mM Na、5 mM K、1.5 mM Mg、98 mM Cl、27 mM 醋酸盐、23 mM 葡糖酸盐）中加入 1 mL 2% 盐酸利多卡因和 10 mL 2 mM KCl（终浓度为 20 mM）。使用 6 N HCl 将 pH 调至 7.4。 
	注意：该模型对 pH 高度敏感。若 pH 调节不当（超出 7.3–7.4 的生理范围）或溶液 pH 不稳定，可能影响实验结果或导致数据不可靠。</li>
	<li>准备 4 L Krebs 溶液（113 mM NaCl、4.5 mM KCl、1.6 mM NaH2PO4、1.25 mM CaCl2、1 mM MgCl2∙6H2O、5.5 mM D-葡萄糖、25 mM NaHCO3）。每 1 L 溶液所需溶质质量如下：6.1 g NaCl、0.3355 g KCl、0.2035 g MgCl2∙6H2O、0.192 g NaH2PO4、0.1387 g CaCl2、0.99 g D-葡萄糖、2.1 g NaHCO3，用超纯去离子水定容至 1 L。最后加入 NaHCO3 以避免沉淀。使用 0.22 µm 滤器过滤溶液，并于 4 °C 过夜保存。当溶液温度达到 37 °C 时，用 5% CO2/95% O2 混合气体平衡并调节 pH 至 7.4。</li>
	<li>用 Krebs 溶液填充 Langendorff 灌流回路并启动系统泵。确保管路内无气泡残留。调节蠕动泵转速至 80 rpm（相当于 1 L/min）。通过三通旋塞调节灌流速度，使主动脉插管末端保持缓慢滴流状态，直至心脏连接完成（图 1B）。取 15 mL Krebs 溶液置于冰上 50 mL 锥形管中，用于心脏运输。</li>
	<li>用心脏停搏液填充心脏停搏液输送系统。排尽气泡后，通过三通旋塞将回路切换至生理盐水（图 1A）。调节滴速，确保导管尖端缓慢滴出生理盐水，以防止在动物死亡前意外注入心脏停搏液。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>使用吸入式麻醉舱，以3%异氟烷诱导麻醉。当动物失去反应后，按照当地法规，通过腹腔注射给予氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）或其他合适的麻醉剂，以维持后续操作过程中的麻醉状态。通过脚趾夹捏无反应及眨眼反射消失来确认麻醉深度。</li>
	<li>使用14 G、2英寸的静脉导管对动物进行气管插管。以每分钟50次呼吸的频率开始通气，气道压力限制在20 cmH2O以内。</li>
	<li>将动物置于调至“中等”档位的加热垫上，并用吸水垫覆盖以维持体温。插入直肠温度探头，并将经皮脉搏血氧饱和度传感器连接至其中一只脚。在整个操作过程中维持直肠温度在37 °C。</li>
	<li>血管通路
	<ol>
		<li>使用剪刀在颈部做一条3至4 cm长的正中皮肤切口。使用钝头弯剪钝性分离皮下组织，暴露右侧胸骨舌骨肌。使用无创镊子将肌肉向侧方移开，直至肉眼识别出右侧颈总动脉（有搏动）、颈外静脉（无搏动）和迷走神经（呈白色）（补充图2A）。使用钝头弯剪小心地将迷走神经与颈总动脉分离。</li>
		<li>通过右侧颈外静脉注射肝素（2,000 IU/kg）。拔针后对注射部位施加压力，防止血液渗漏。</li>
		<li>使用弯镊在颈总动脉周围穿过两根5-0丝线缝合线。将远端缝线牢固结扎，以阻断暴露段动脉上端的血流。近端缝线暂不打结，留作下一步控制出血之用（补充图2B）。两根缝线之间的距离应约为2 cm。</li>
		<li>在体视显微镜下以获得更清晰的视野，使用显微外科剪刀在颈总动脉前壁小心剪开约1 mm的切口。将一根22 G、1英寸的封闭式静脉导管朝向主动脉弓方向插入。该导管连接一个双向三通阀，可连接压力传感器以实现持续监测，并可通过心脏停搏液输送系统注入生理盐水或心脏停搏液（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 心脏捐献后循环死亡（DCD）方案的启动
注意：完整的实验方案时间线见图2。
<ol>
	<li>通过捏脚趾并评估眼睑反射来重新评估麻醉深度。如果观察到反应，则进行腹腔注射氯胺酮（37.5 mg/kg）和赛拉嗪（2.5 mg/kg）。5分钟后重新评估。若无反应，则继续操作。气管夹闭仅可在充分麻醉的动物中进行。</li>
	<li>关闭呼吸机并拔除气管插管。使用蚊式钳夹闭气管。此时刻被视为濒死期的开始。当收缩压峰值降至30 mmHg以下，或出现心脏停搏或心室纤颤（以先发生者为准）时，开始计算功能性热缺血时间（WIT）（图3）。 
	注意：损伤程度应与WIT成正比。需通过实验根据所用麻醉剂、动物品系、性别和体重优化WIT时间。在对照组动物中，颈动脉通路建立后立即注射心脏停搏液，并按下一步所述获取心脏（图2）。以开始灌注心脏停搏液作为WIT结束的标志。</li>
	<li>在WIT结束时，行胸骨正中切开术。使用Alm牵开器保持胸腔开放。用剪刀切开下腔静脉及双侧心房，以避免心肌扩张或心脏停搏液再循环（补充图3）。在膈肌上方夹闭主动脉。通过先前已插管的颈动脉，使用心脏停搏液输送系统在60 mmHg恒定压力下灌注心脏停搏液，持续5分钟。可通过调节水柱高度来调整灌注压力。</li>
	<li>心脏停搏液灌注结束后，使用弯头镊子将升主动脉近端从肺动脉分离（Supplementary Figure 4A）。在左锁骨下动脉远端切断主动脉。确保保留至少0.5 cm长的主动脉段，以便连接Langendorff装置进行插管。</li>
	<li>握住主动脉固定心脏，通过分离肺静脉及其他胸腔结构完成心脏摘除（Supplementary Figure 4B）。迅速将心脏浸入冰冻的Krebs溶液中，以实现向离体系统的快速转运。尽量缩短解剖与转运时间（5分钟内）。</li>
</ol>
4. 离体心脏灌注系统（EVHP）与心脏功能评估
<ol>
	<li>使用镊子打开主动脉腔。通过滴注的克雷布斯液（Krebs solution）充满管腔以排出主动脉内的气体，避免气泡进入冠状血管。将套管缓慢插入主动脉，注意不要越过主动脉根部或损伤主动脉瓣叶。用小夹子固定装置。</li>
	<li>利用双向停流阀增加灌注流量，检查主动脉是否存在可能的泄漏。若未发现泄漏，使用2-0丝线将主动脉牢固地固定在套管上。完全打开至套管的灌注流路。将主动脉压力维持在生理水平60–70 mmHg（通过调节系统高度进行调整）。此时开始初始再灌注和稳定期。可根据研究者的实验设计调整主动脉压力。</li>
	<li>旋转心脏，使心脏基底部（心房）朝向压力传感器。通过解剖肺静脉扩大左心室-心房开口。插入连接至压力传感器的乳胶球囊。通过目视确认球囊完全位于心室内。缓慢向球囊内注入生理盐水，直至舒张末期压力（EDP）达到15 mmHg。根据需要调整以保持EDP恒定（预先确定的生理EDP）。EDP可根据每位研究者的实验目标进行调整。</li>
	<li>将起搏电极插入心脏前表面（右心室流出道）。避免穿刺冠状血管。一旦观察到自主搏动，以每分钟300次的频率开始起搏。所需电压可能因实验条件和大鼠品系而异。</li>
	<li>经过10分钟的稳定期后，开始持续记录心室内压力。此时刻被视为再条件化与评估阶段的起始点（时间0），该阶段将持续1小时（图2）。可延长再条件化时间，但所有心脏均会出现随时间依赖性下降的收缩力。</li>
	<li>在再条件化开始时，收集从心脏静脉滴下的心脏流出液5分钟，用于基础冠状动脉流量评估和生化分析。肌钙蛋白T每15分钟重复采集一次（时间为0、15、30、45和60分钟）。其他分析需根据具体情况个性化设定采集时间（图2）。</li>
</ol>
5. 实验结束
<ol>
	<li>从兰格多夫装置中取出心脏。</li>
	<li>使用直型高碳钢刀片（如切片刀或类似刀具），切除心脏基底部（包括主动脉和肺动脉）。</li>
	<li>将右心室朝下，横向切割心室组织，制成1–2 mm厚的切片。在其中一个代表性切片（通常为第三个）中分离右心室，并迅速冷冻左心室。该样品可用于生化分析。</li>
	<li>将剩余切片浸入新配制的5% 2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（溶于pH 7.4的商用磷酸盐缓冲液）中，37 °C孵育10分钟。存活组织染成砖红色。</li>
	<li>用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次，随后在4 °C下用10%福尔马林固定过夜。再用pH 7.4的磷酸盐缓冲液洗涤两次，并始终保持各切片浸没状态。</li>
	<li>吸去多余液体后称量每张切片。对两面拍摄数码彩色图像。采用平面测量法计算梗死面积百分比，并根据切片重量和总心室重量进行校正。染色会随时间褪色，必须尽快拍照。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>为每只动物分别保存所有压力数据到一个新文件中。</li>
	<li>进行压力分析时，每个时间点至少选择 200 个压力周期。分析可在实验结束后离线进行，使用专用软件（例如 LabChart）。可获得的常见心血管参数包括：最大生成压力、舒张末期压力、+dP/dt（压力曲线上升支最陡斜率，反映心室收缩能力）、-dP/dt（压力曲线下降支最陡斜率，反映心室舒张能力）等。 
	注意：对于肌钙蛋白分析，预期在再灌注时肌钙蛋白释放增加。在 EVHP 系统中再灌注 1 小时后，肌钙蛋白水平可能降至基线，因此必须精确控制样本采集和处理的时间。</li>
</ol>

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<li>Azar, T., Sharp, J., Lawson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+rates+of+male+and+female+Sprague-Dawley+and+spontaneously+hypertensive+rats+housed+singly+or+in+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Heart rates of male and female Sprague-Dawley and spontaneously hypertensive rats housed singly or in groups.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (2), 175-184 (2011).</li>
<li>Bonney, S., Hughes, K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic+cardioprotection%3A+the+role+of+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Anesthetic cardioprotection: the role of adenosine.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (36), 5690-5695 (2014).</li>
<li>Ali, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+model+of+veno-arterial+extracorporeal+membrane+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rat model of veno-arterial extracorporeal membrane oxygenation.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 37(2014).</li>
</ol>

作者声明本文中提及的任何产品或讨论的概念均不涉及任何所有权或商业利益。

本文介绍了一种简单、便捷且用途广泛的心脏停搏后捐献（DCD）模型，可用于评估心脏功能恢复、组织损伤情况，以及应用后处理心脏保护剂来改善原本因不符合标准而被弃用的供体心脏的恢复效果。离体心脏灌注系统（EVHP）已得到优化，为评估心脏功能提供了平台，并独特地实现了递送和测试添加了后处理药物制剂的改良灌注液，以在心脏DCD的小动物15和大动物16,17模型中保护和修复DCD心脏。然而，现有方案往往细节不足，且并非始终具有临床相关性，导致向临床应用转化困难。
在DCD模型领域，离体DCD模型（如Sanz18所述）缺乏濒死期。通过停止机械通气诱导心脏骤停，会导致交感神经系统过度激活，从而引发“儿茶酚胺风暴”19。儿茶酚胺水平的升高会改变供体器官的特性，并与实验性DCD器官功能状态下降相关19</su...

全球范围内，实体器官移植尤其是心脏移植的数量正在持续上升1,2。目前器官获取的标准方法是脑死亡后捐献（DBD）。由于DBD具有严格的纳入标准，所供心脏中被接受的不到40%3，这导致在需求不断增长的情况下器官供给受限，等待移植名单不断延长。为应对这一问题，循环死亡后捐献（DCD）器官的使用被视为一种潜在解决方案4。
然而，在DCD供体中，撤除生命支持后必然会出现濒死阶段，并在复苏前经历一段无保护的热缺血期5。循环死亡后的潜在器官损伤可导致器官功能障碍，这解释了为何临床上对常规开展DCD心脏移植持谨慎态度。据报道，目前仅有4个中心在临床中使用DCD心脏，且标准极为严格，包括热缺血时间极短以及供体为无慢性疾病的年轻个体6,7。由于伦理和法律原因，在循环死亡前对供体几乎无法或只能有限实施心肌保护干预措施5,8,9。因此，减轻缺血-再灌注（IR）损伤的手段仅限于在早期再灌注阶段使用停跳液启动的心肌保护治疗，且无法实现充分的功能评估。体外心脏灌注（EVHP）及利用专用平台对DCD心脏进行再条件化处理已被多位学者提出作为替代方案并开展研究10,11,12,13。EVHP为向DCD心脏递送后处理药物以改善功能恢复提供了独特机会。然而，为了实现有效的临床转化，仍有许多技术和实际问题有待解决，且目前在判断心脏可否移植所依据的一系列灌注和功能标准方面尚缺乏共识，进一步加剧了这一挑战6,8。
本文报道了一种可重复的临床前小型动物DCD方案，该方案结合了离体心脏灌注系统，可用于研究在器官获取时、初始再灌注期间和/或整个EVHP过程中启动的器官后处理效应。

<table><tbody><tr><td>0.9% 氯化钠，1 L 袋装</td><td>Baxter</td><td></td><td>改良兰格多夫系统中用于冲洗的电解质溶液。</td></tr><tr><td>14 G 2&quot; 静脉导管</td><td>Jelco</td><td>4098</td><td>用作气管插管。</td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基四氮唑氯化物</td><td>Milipore-Sigma</td><td>T8877</td><td>活体染色剂</td></tr><tr><td>22 G 1&quot; 静脉导管</td><td>BD</td><td>383532</td><td>带延长管的静脉导管，便于颈动脉插管操作</td></tr><tr><td>Adson 组织镊，4 3/4&quot;，齿状</td><td>Skalar</td><td>50-3147</td><td>用于组织操作的附加镊子</td></tr><tr><td>Alm 自持式牵开器，4×4 齿，钝头，2-3/4&quot;</td><td>Skalar</td><td>22-9027</td><td>用于保持胸腔开放的组织牵开器</td></tr><tr><td>Bridge 放大器</td><td>ADinstruments</td><td>FE221</td><td>用于颈动脉内血压测量的桥式放大器</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Milipore-Sigma</td><td>C1016</td><td>无水氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;），颗粒状，&amp;le;7.0 mm，&amp;ge;93.0%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Milipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>D-葡萄糖，&amp;ge;99.5%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>DIN(8) 至一次性血压传感器连接线</td><td>ADinstruments</td><td>MLAC06</td><td>连接桥式放大器与压力传感器的转接电缆</td></tr><tr><td>一次性血压传感器（三通阀）</td><td>ADinstruments</td><td>MLT0670</td><td>用于颈动脉内血压测量的压力传感器</td></tr><tr><td>无钙镁磷酸盐缓冲液（dPBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>不含钙或镁的电解质溶液。</td></tr><tr><td>眼科组织镊，直型，齿状，4&quot;</td><td>Skalar</td><td>66-2740</td><td>用于组织操作的附加镊子</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Milipore-Sigma</td><td>HT501128</td><td>固定液</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbean</td><td>756-CN</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠 1,000 IU/mL</td><td>Sandoz</td><td></td><td>用于全身抗凝</td></tr><tr><td>盐酸，36.5% 至 38.0%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td>1:1 稀释用于 pH 调节</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Bimeda</td><td></td><td>麻醉剂，100 mg/mL</td></tr><tr><td>LabChart</td><td>ADinstruments</td><td></td><td>Powerlab 多道生理记录仪的控制软件，支持离线分析。版本 7，启用血压和压力-容积环模块</td></tr><tr><td>左心室压力球囊</td><td>Radnoti</td><td>170404</td><td>乳胶材质，尺寸 4。</td></tr><tr><td>盐酸利多卡因 2% 溶液</td><td>AstraZeneca</td><td></td><td>用于停跳液的抗心律失常药物</td></tr><tr><td>氯化镁 ACS</td><td>ACP Chemicals</td><td>M-0460</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，&amp;ge;99.0%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>微型压力传感器</td><td>Radnoti</td><td>159905</td><td>与心室内球囊连接的微型压力传感器及放大器</td></tr><tr><td>起搏器</td><td>Biotronik</td><td>Reliaty</td><td>设定为每 200 毫秒产生一次脉冲，对应心率为 300 次/分钟。</td></tr><tr><td>pH 台式计</td><td>Fisher Scientific</td><td>AE150</td><td></td></tr><tr><td>生理监测仪</td><td>Kent Scientific</td><td>Physiosuite</td><td>用于手术过程中持续监测啮齿动物的体温和血氧饱和度</td></tr><tr><td>Plasma-Lyte A</td><td>Baxter</td><td></td><td>作为制备心脏停跳液基础的电解质溶液</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Milipore-Sigma</td><td>P4504</td><td>KCl，&amp;ge;99.0%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>氯化钾 2 mEq/mL</td><td>Hospira</td><td></td><td>心脏停跳液的组成部分</td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 多道生理记录仪</td><td>ADinstruments</td><td></td><td>电子多道生理记录仪</td></tr><tr><td>2-0 丝线</td><td>Ethicon</td><td>A305H</td><td>兰格多夫装置用缝合材料</td></tr><tr><td>5-0 丝线</td><td>Ethicon</td><td>A302H</td><td>颈动脉插管用缝合材料</td></tr><tr><td>小动物麻醉工作站</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A2770</td><td>小动物呼吸机</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Milipore-Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;，&amp;ge;99.5%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Milipore-Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl，&amp;ge;99.5%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒</td><td>ACP chemicals</td><td>S3700</td><td>稀释至 5 N（10 g 溶于 50 mL）用于 pH 调节</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Milipore-Sigma</td><td>S0751</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，&amp;ge;99.0%，克雷布斯溶液的组成部分</td></tr><tr><td>Stevens 腱膜剪，直型，精细，SH/SH，4 1/2&quot;</td><td>Skalar</td><td>22-1240</td><td>用于心房和腔静脉切开的小型剪刀</td></tr><tr><td>组织切片刀片</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C18</td><td>实验末期用于组织切片的直型碳钢刀片</td></tr><tr><td>25 G 5/8&quot; 带针结核菌素安全注射器</td><td>CardinalHealth</td><td>8881511235</td><td>用于肝素注射</td></tr><tr><td>兽用普通外科器械包</td><td>Skalar</td><td>98-1275</td><td>包含解剖剪和蚊式钳的外科手术器械</td></tr><tr><td>兽用显微外科器械包</td><td>Skalar</td><td>98-1311</td><td>包含显微剪的外科手术器械，用于颈动脉切开</td></tr><tr><td>工作心脏系统（大鼠/豚鼠/兔）</td><td>Radnoti</td><td>120101BEZ</td><td>根据实验需求改装的模块化工作心脏系统，包含所有必要的管道、水浴保温储液器和阀门，包括二通和三通旋塞阀</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer</td><td></td><td>镇静剂，20 mg/mL</td></tr></tbody></table>

循环死亡后心脏捐献的临床前模型

Pre-clinical Model of Cardiac Donation after Circulatory Death

心脏移植的需求日益增长；然而，由于合适的供体稀缺，器官供体的可获得性十分有限。循环死亡后器官捐献（DCD）是解决器官供体短缺的一种方案，但由于存在较长时间的热缺血以及组织损伤的风险，DCD在心脏移植中的常规应用仍较为罕见。本文提供了一项详细的操作方案，该方案紧密模拟当前DCD背景下的临床实践，并持续监测心脏功能，可用于评估新型心肌保护策略及干预措施，以减轻缺血-再灌注损伤。
在该模型中，通过停止机械通气以诱导循环衰竭，在麻醉的Lewis大鼠中启动DCD方案。当收缩压降至30 mmHg以下时，开始计算热缺血时间。经过预设的热缺血期后，心脏用常温停搏液冲洗，随后被获取并安装到Langendorff离体心脏灌注系统上。在初始再灌注和稳定10分钟后，通过心室内压力监测连续评估心脏功能恢复情况，持续60分钟。通过检测心肌肌钙蛋白T水平评估心肌损伤，并通过组织学染色定量梗死面积。热缺血时间可根据需要进行调节，以建立不同程度的结构与功能损伤。该简易方案可用于评估在停搏、初始再灌注和/或离体灌注阶段引入的不同心脏保护性预处理策略。该方案所得结果可在大型动物模型中重复，有助于临床转化研究。

拔管后，血压会以可预测的模式迅速下降（图3）。预期死亡时间少于5分钟。
图4 显示了在经历 0、10 和 15 分钟热缺血时间（WIT）后，再灌注开始时的平均压力/时间曲线。收缩功能将随时间逐渐恢复。采用较短的 WIT 可使心肌收缩力恢复正常，且无法检测到形态学损伤（图5 和 图6）。
在心脏停搏液中添加保护剂并在稳定阶段使用该保护剂的概念验证表明，在此模型中由15分钟热缺血时间（WIT）引起的损伤可通过心肌保护剂进行调控（图4、图5 和 图6）。
<p class="jove_content" fo:ke...

本方案展示了一种简单且灵活的方法，用于评估新的预处理药物或策略，以提高心脏在循环死亡后捐献的可行性。

心脏移植需求日益增长；然而，由于合适的供体稀缺，器官供应十分有限。器官捐献在……后进行

本方案旨在通过促进不同心脏保护性预处理策略的评估，解决移植器官供应有限的问题，从而允许使用循环死亡后捐献的心脏。将动物置于设定为中等温度的加热垫上。在确认麻醉后的成年大鼠对足趾夹捏无反应后，插入直肠温度探头。将经皮脉搏血氧仪传感器连接至大鼠后肢足垫，并用吸水垫覆盖大鼠以维持体温。在颈部正中做3至4厘米长的皮肤切口，使用钝头弯剪钝性分离皮下组织，暴露右侧胸骨舌骨肌。用无创镊子将肌肉向侧方牵拉，直至辨认出右侧颈总动脉、颈静脉和迷走神经。使用剪刀小心地将迷走神经与颈动脉分离。向右侧颈静脉注射每千克2,000国际单位的肝素，在拔出针头后对注射部位施加压力，以避免血液渗漏。使用弯钳在颈动脉周围穿过两根5-0丝线缝合线。牢固结扎远端缝线以闭塞暴露的颈动脉上部，近端缝线暂不结扎，将大鼠置于体视显微镜下。然后使用显微外科剪刀在颈动脉前壁小心剪开一个1毫米的切口，插入一根22号、1英寸长的封闭式静脉导管，方向朝向主动脉弓。建议在这些步骤中使用放大设备和显微解剖工具。通过张紧近端缝线以避免出血，可实现无血视野。心脏捐献对于组装离体心脏停搏装置是必需的。要启动DCD方案，首先拔除动物的气管插管，然后使用蚊式钳夹闭气管，开始濒死阶段。当收缩压峰值降至30毫米汞柱以下，或出现心脏停搏或心室颤动时，以先发生者为准，开始计算热缺血时间。热缺血时间结束时，行胸骨正中切开术，必要时使用Alm牵开器保持胸腔开放。分离心脏与肺静脉及其他胸腔结构，完成心脏切除术。立即把心脏浸入冰冻的Krebs溶液中，迅速转运至离体系统。用2-0丝线将主动脉牢固地固定在Langendorff装置上，然后打开活塞。完全打开至套管的液流，开始初始再灌注和稳定期。旋转心脏，使心房朝向压力传感器，必要时解剖肺静脉以扩大左心室心房开口。接着，插入连接至压力传感器的乳胶球囊，确保球囊完全置于心室内。缓慢向球囊内注入生理盐水，直至舒张末期压力达到15毫米汞柱。将起搏电极插入心脏前壁，注意避免穿刺冠状血管。观察到自主心跳后，将起搏频率设定为每分钟300次。稳定10分钟后，开始持续记录心室内压力，进入再训练与评估阶段。一小时后，将心脏从兰格多夫装置中取出，并使用直的高碳钢刀片去除心房。将右心室朝下，切割成一至二毫米厚的横向心室切片。从第三片组织中分离出右心室，并将左心室迅速冷冻，用于后续的生物化学分析。将剩余的组织切片浸入新配制的含5%TTC的PBS溶液中，在37摄氏度下孵育10分钟。次日早晨，用新鲜PBS洗涤样本两次，然后将样本浸入新鲜PBS中进行成像。存活的组织将呈现砖红色。拔管后，血压会以可预测的模式迅速下降，预期死亡时间少于五分钟。此处展示了在热缺血时间（WIT）分别为0、10和15分钟时，再条件化开始阶段的平均压力随时间变化的曲线。随着时间推移，收缩功能将得到改善，短时间的热缺血可使收缩力恢复至正常水平，且无法检测到形态学

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

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肺快速恢复获取联合腹部常温区域灌注在控制性循环死亡后捐献中的应用

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