Name: 使用一套实用可行的方法,描述英国皇家空军家族激酶与疾病相关的突变体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解用于表征RAF家族激酶疾病相关突变体的实用方法，包括体外激酶测定、RAF共激活测定和互补分裂荧光素酶测定。这些技术在293T细胞培养中验证，具有高灵敏度和可重复性。

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作者谨此感谢毛细胞白血病奖学金对袁继民的支持。本工作获得亚洲癌症研究基金（AFCR2017/2019-JH）、杜克-国大科桥基金奖（Duke-NUS-KBrFA/2018/0014）、国家癌症中心研究基金衔接拨款（NCCRF-YR2018-JUL-BG4）、国家癌症中心研究基金试点拨款（NCCRF-YR2017-JUL-PG3）以及SHF学术医学研究拨款（AM/TP011/2018）的资助。

1. 用于测量 RAF 突变体催化活性的体外激酶实验
<ol>
	<li>使用Gibson组装或传统分子克隆方法构建在C末端带有FLAG(DYKDDDDK)标签的RAF突变体编码载体（图1A）。
	<ol>
		<li>通过PCR将FLAG标签和突变引入RAF编码序列，然后使用Gibson组装或T4 DNA连接酶按照制造商说明书将完整序列插入pCDNA3.1(+)载体中。PCR反应条件如下：(1) 95 °C，2 min；(2) 95 °C，30 s；(3) 59 °C，30 s；(4) 68 °C，3 min；(5) 20个循环（步骤2至4）；(6) 4 °C保存。 
		注意： 克隆用PCR引物序列：5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 和 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3。</li>
		<li>将GST编码序列插入RAF突变体编码序列的上游，使用与步骤1.1.1所述相同的方法构建编码GST融合RAF突变体的载体。</li>
		<li>转染前通过DNA测序验证所有载体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染前一天，以每孔5 × 105个细胞的密度将293T细胞接种于6孔板中。第二天当细胞融合度达到80~90%时，按照转染试剂说明书（材料表）将编码FLAG标签RAF激酶或其突变体的载体（来自步骤1.1）转染入细胞。</li>
	<li>转染24小时后更换培养基。</li>
	<li>转染48小时后吸除培养基，每孔加入400 µL裂解缓冲液（25 mM Tris·HCl，150 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），0.25% NP-40，pH 7.2），并加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，在冰上裂解细胞。 
	注意： 裂解缓冲液中NP-40的浓度对于体外检测具有中等二聚体亲和力/稳定性的RAF突变体催化活性至关重要。高浓度去垢剂或强效去垢剂可能破坏RAF二聚体，从而抑制RAF激酶或其突变体的催化活性。</li>
	<li>将细胞裂解物转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，去除细胞碎片。</li>
	<li>取每份样品300 µL澄清的全细胞裂解物转移至1.5 mL离心管中，每份样品加入20 µL抗FLAG亲和磁珠，在4 °C冷室中旋转孵育1小时。同时每份样品另取40 µL澄清全细胞裂解物留样，用于后续通过免疫印迹检测RAF突变体的表达水平及其活性（磷酸化ERK1/2）。</li>
	<li>用裂解缓冲液轻柔洗涤抗FLAG磁珠一次，再用激酶反应缓冲液（20 mM HEPES，10 mM MgCl2，0.5 mM Na3VO4，0.5 mM DTT，pH 7.2）洗涤一次，然后每份样品加入20 µL激酶反应混合液（含2 μg MEK1(K97A)和100 µM ATP的20 µL激酶反应缓冲液）。 
	注意： 磁珠洗涤操作应轻柔快速，加激酶反应混合液前需彻底吸除残留缓冲液，本步骤所有操作均应在4 °C冷室中进行。</li>
	<li>在室温（25 °C）孵育激酶反应10分钟，孵育期间每隔一分钟用手轻轻翻转离心管。</li>
	<li>每份样品加入5 µL 5x SDS上样缓冲液（375 mM Tris·HCl，9%十二烷基硫酸钠（SDS），50%甘油，0.03%溴酚蓝）终止激酶反应，然后将样品在90 °C加热5分钟。</li>
	<li>将样品在含0.1% SDS的9~12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中电泳分离，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，通过免疫印迹检测各样品中磷酸化MEK和RAF突变体的水平。 
	注意： 磷酸化MEK也可通过γ32P-ATP掺入法进行定量。简而言之，将10 µM γ32P-ATP加入激酶反应缓冲液中，经PAGE分离后，采用标准放射自显影、磷屏成像或液体闪烁计数技术对磷酸化MEK的量进行定量。</li>
</ol>
2. 评估激酶失活型RAF突变体别构活性的RAF共激活实验
<ol>
	<li>按照步骤1.1所述，构建编码RAF受体（CRAF激酶结构域，带有不可磷酸化的NtA基序AAFF）或激酶失活的RAF激活子（RAF激酶结构域，带有模拟磷酸化的NtA基序SSDD、DDEE或DGEE）的载体（图1A）。</li>
	<li>按照步骤1.2和1.3所述，用编码RAF受体和激酶失活RAF激活子的两种载体，或仅编码其中一种蛋白的单一载体，转染293T细胞。</li>
	<li>转染后24 h更换培养基，于48 h收集转染后的293T细胞，按步骤1.4和1.5所述制备全细胞裂解液。</li>
	<li>在室温（25 °C）下将澄清的全细胞裂解液迅速与5x SDS上样缓冲液混合，随后在90 °C加热5 min。</li>
	<li>将煮沸后的全细胞裂解液样品在含0.1% SDS的9~12% PAGE凝胶中电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，并通过免疫印迹检测磷酸化ERK1/2及对照蛋白的水平。</li>
</ol>
3. 用于测量 RAF 突变体相对二聚体亲和力/稳定性的互补型分裂荧光素酶检测法
<ol>
	<li>构建编码N端连接Nluc（萤火虫荧光素酶N端，氨基酸2-416）或C端连接Cluc（萤火虫荧光素酶C端，氨基酸398-550）的FLAG标签RAF突变体的载体，方法如步骤1.1所述。</li>
	<li>按照步骤1.2所述，用一对分别编码不同Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体的载体转染293T细胞。</li>
	<li>转染24小时后，将293T转染细胞以每孔2×105的细胞密度重铺至Krystal黑色成像板中，并使用无色培养基（即不含酚红的DMEM）。</li>
	<li>24小时后，向293T转染细胞中加入D-荧光素（0.2 mg/mL），孵育30分钟，然后使用多功能检测系统（材料表）测定荧光素酶信号。</li>
	<li>测定荧光素酶信号后，吸除培养基，并按照步骤1.4和1.5所述，用裂解缓冲液裂解293T转染细胞，制备全细胞裂解液。</li>
	<li>将全细胞裂解液样品在含0.1% SDS的9~12% PAGE胶中电泳，按照步骤2.5所述通过抗FLAG免疫印迹检测Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体的表达水平。使用ImageJ软件根据免疫印迹结果定量293T转染细胞中Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体的相对表达水平。</li>
	<li>根据Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体的表达水平对293T细胞转染体的荧光素酶信号进行归一化处理。简而言之，将原始荧光素酶信号除以步骤3.6中获得的Nluc-RAF突变体和Cluc-RAF突变体的相对表达水平。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了三种用于表征与疾病相关的RAF突变体的方法，包括体外激酶活性检测、RAF共激活检测以及互补型分裂荧光素酶检测。由于RAF激酶具有催化活性和变构活性，不同的RAF突变体可通过两种不同的机制激活下游信号通路13,14,16,17,18。组成型活性RAF突变体可直接磷酸化下游效应分子MEK，而激酶失活型RAF突变体则通过反式激活其野生型对应物来触发下游信号传导。然而，无论是组成型活性还是激酶失活型RAF突变体，其功能的实现均依赖于二聚化15,16,17,19...

RAF 激酶家族是 RAS/RAF/MEK/ERK 信号级联通路中的关键组分，负责将信号从 RAS 传递以激活丝裂原活化蛋白激酶（MEK）1,2,3,4。该激酶家族在细胞生长、存活和分化过程中发挥重要作用，其异常改变可导致多种疾病，尤其是癌症5,6,7,8。近年来，基因组测序已鉴定出许多与疾病相关的 RAF 突变体，这些突变体在 RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路中的信号传递表现出不同的特性9,10,11。对 RAF 突变体进行细致的表征将有助于我们理解其改变 RAS/RAF/MEK/ERK 通路信号输出的分子机制，最终为治疗各类由 RAF 突变驱动的疾病选择合适的策略提供依据。
RAF 激酶家族包含三个成员：CRAF、BRAF 和 ARAF，它们具有相似的分子结构，但在激活下游信号通路的能力上存在差异1,2,3,4在这些旁系同源蛋白中，BRAF 因其组成型磷酸化的 NtA 而具有最高的活性N-t末端 acidic）基序12,13,14，而ARAF由于其非经典的APE基序，活性最低15这或许可以解释RAF旁系同源基因在疾病中突变频率的差异：BRAF&#62;CRAF&#62;ARAF。此外，在同一RAF旁系同源蛋白中，不同位点的突变可能以不同的方式激活下游信号通路，这为RAF激酶家族的调控增加了另一层复杂性。近期研究表明，所有RAF激酶均具有催化活性和变构活性13,14,16,17,18. 组成型活性RAF突变体通过磷酸化MEK直接激活下游信号通路，而激酶失活型RAF突变体则可通过侧向二聚化反式激活其野生型 counterparts，从而启动MEK-ERK信号通路16,19,20二聚体亲和力/稳定性是一个关键参数，不仅决定了激酶失活的RAF突变体的变构活性，还影响组成型激活的RAF突变体的催化活性15,21,22激酶失活的RAF突变体若具有高二聚体亲和力或稳定性，可直接反式激活内源性的野生型RAF15而具有中等二聚体亲和力/稳定性的分子则需要活性Ras的协调或更高水平的野生型RAF分子才能发挥功能13,15,20,21,23同样，组成型激活的RAF突变体以依赖二聚体的方式磷酸化MEK，而那些二聚体亲和力或稳定性较低的突变体在免疫沉淀过程中会因弱RAF二聚体解离，导致其体外催化活性丧失。15,21,22二聚体亲和力/稳定性也决定了RAF突变体对其抑制剂的敏感性，并与RAF抑制剂的耐药性呈正相关。24因此，为了表征与疾病相关的RAF突变体，必须测定其催化活性、变构活性以及二聚体亲和力/稳定性。
近年来，我们实验室及其他研究团队已开发出多种方法用于表征RAF家族激酶及其突变体。根据我们实验室及其他团队的经验，我们认为以下三种检测方法在鉴定与疾病相关的RAF突变体方面具有优势：（1）体外激酶活性检测，该方法操作简便，可用于检测组成型活性RAF突变体的催化活性15；（2）RAF共激活检测，这是一种可靠且便捷的方法，用于测量激酶失活型RAF突变体的变构活性13,15,21,22,23,25；（3）互补型分裂荧光素酶检测，与传统的共免疫沉淀检测相比，该方法在测量RAF突变体相对二聚体亲和力/稳定性方面具有更高的灵敏度，且无需使用SPR（Surface Plasmon Resonance，表面等离子共振）分析等高级设备即可完成定量分析15,22。结合这三种检测方法，我们可以更清晰地理解某种与疾病相关的RAF突变体如何改变下游信号通路，从而制定合适的治疗策略以应对由该RAF突变引起的疾病。

<table><tbody><tr><td>抗磷酸化ERK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>抗磷酸化MEK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>抗ERK1/2</td><td>AB clonal</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>抗MEK1/2</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG（小鼠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>抗HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG（兔）</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>抗FLAG磁珠（M2）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的抗小鼠IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP标记的抗兔IgG</td><td>Jackson Laboratories</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1(+)</td><td>In vitrogen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning&amp;nbsp; 试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>无酚红DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素&amp;nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis标记的MEK1 (K97A)</td><td>&amp;nbsp;由本实验室前期研究制备</td><td>N.A.</td><td>参考文献15</td></tr><tr><td>GloMax-多模式检测系统</td><td>Promega</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table>

利用一套实用且可行的方法表征raf家族激酶的疾病相关突变体

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

快速加速的纤维肉瘤（RAF）家族激酶在细胞生物学中发挥着核心作用，其功能障碍会导致癌症和发育性疾病。对与疾病相关的RAF突变体进行表征，将有助于我们为治疗这些疾病选择合适的治疗策略。近期研究表明，RAF家族激酶具有催化活性和变构活性，这些活性受到二聚化的严格调控。本文中，我们建立了一套实用且可行的方法，用于测定RAF家族激酶及其突变体的催化活性、变构活性以及相对二聚体亲和力/稳定性。首先，我们改进了经典的体外激酶活性检测方法，通过降低缓冲液中的去污剂浓度、采用温和的快速洗涤步骤，并使用谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白，防止RAF二聚体在纯化过程中解离，从而能够准确测量组成型活性RAF突变体的催化活性。其次，我们开发了一种新型的RAF共激活检测方法，利用N端截短的RAF蛋白评估激酶失活RAF突变体的变构活性，避免了现有方案中对活性Ras的依赖，从而实现了更高的检测灵敏度。最后，我们建立了一种独特的互补型分裂荧光素酶检测方法，可对多种RAF突变体的相对二聚体亲和力/稳定性进行定量测定，相较于传统的共免疫沉淀检测，该方法更可靠且更灵敏。综上所述，这些方法具有以下优势：（1）操作简便；（2）无需高端设备即可有效实施；（3）成本低廉；（4）灵敏度高且可重复性强。

RAF 家族激酶具有催化活性和变构活性，使其疾病相关突变体能够通过不同机制激活下游信号通路13,14,16,17,18。组成型活化的 RAF 突变体可直接磷酸化其底物，而激酶失活的 RAF 突变体则通过反式激活野生型 RAF 来发挥功能。如图 1B所示，在 293T 细胞中表达时，组成型活化的 RAF 突变体（如调节性脊柱（R-脊柱）突变体（BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M) 和 ARAF(DGEE/L358M)）13,23,2...

本文介绍了一组用于表征与疾病相关的 RAF 家族激酶突变体的实用且可行的方法，包括体外激酶活性检测、RAF 共激活检测以及互补型分裂荧光素酶检测。

利用一套实用且可行的方法表征RAF家族激酶的疾病相关突变体

快速加速的纤维肉瘤（RAF）家族激酶在细胞生物学中发挥核心作用，其功能障碍可导致癌症和发育异常……

该方法有助于有效表征与疾病相关的RAF激酶活性。该技术具有高灵敏度和可重复性，成本低，操作简便，且无需任何高级设备。为检测RAF突变体的催化活性，可通过PCR将flag标签突变引入RAF编码序列中，随后根据标准操作流程将完整序列插入相应载体。以相同方式，将谷胱甘肽-S-转移酶编码序列插入RAF突变体编码序列的上游，构建编码谷胱甘肽-S-转移酶融合RAF突变体的载体。按照标准操作流程，将编码Flag标签RAF激酶或其突变体的载体转染至80%至90%融合度的293T细胞培养物中。培养24小时后，更换每份培养物中的培养基。培养 48 小时后，向每孔中加入 400 微升含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液，并置于冰上。冰上孵育 5 至 10 分钟后，将细胞裂解物转移至 1.5 毫升离心管中，离心以沉淀细胞碎片。随后，将每个样本的 300 微升上清液分别转移至各自的 1.5 毫升微量离心管中。每个样本预留 40 微升，用于后续全细胞裂解液中化石性胞外信号调节激酶 1 和 2 的表达与活性氨基酸印迹分析。向每根试管中加入 20 微升抗 FLAG 亲和磁珠，在 4 °C 冷室中旋转孵育 1 小时。孵育结束后，在冷室中用裂解缓冲液快速轻柔地洗涤抗 FLAG 磁珠 1 次，再用激酶反应缓冲液洗涤 1 次，然后加入 20 微升激酶反应混合液。具有低Dima亲和力的突变体可能由于Dima解离而在体外失去催化活性。因此，快速且温和的洗涤步骤至关重要。室温下每两分钟翻转一次，反应10分钟后，每样品加入5微升5×SDS上样缓冲液终止激酶反应，并在90摄氏度下煮样5分钟。孵育结束后，将样品在含有0.1% SDS的9%至12%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，以便通过免疫印迹检测各样品中磷酸化丝裂原活化蛋白激酶和RAF突变体的水平。为评估激酶失活RAF突变体的变构活性，构建编码RAF受体或激酶失活RAF激活子的载体。将编码RAF受体和激酶失活RAF激活子的两种载体共转染293T细胞，或仅转染编码其中一种蛋白的单一载体，如图所示。在培养48小时后收获全细胞裂解物，如所示操作，并在室温下将澄清的全细胞裂解物与5×SDS上样缓冲液迅速混合，随后在90摄氏度下煮沸5分钟。然后将煮沸后的全细胞裂解物样品上样至含0.1% SDS的9%至12%聚丙烯酰胺凝胶电泳胶中，通过免疫印迹法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，检测磷酸化细胞外信号调节激酶1和2以及对照蛋白的水平，操作如所示。为测定RAF突变体的相对二聚体亲和力和/或稳定性，构建编码Flag标签突变体与萤光素酶N末端或萤光素酶C末端融合的质粒载体。按照所示方法，用一对分别编码不同N端和C端的萤火虫荧光素酶标记的RAF突变体的载体共转染293T细胞。转染后24小时，将2×10⁵个293T细胞转染产物每孔接种至无色培养基中的结晶紫显像板中。转染后48小时，向293T细胞转染产物中加入荧光素，孵育30分钟。在多模式检测系统上检测荧光素酶信号之前。测量结束后，吸去上清液，并用裂解缓冲液裂解转染的293T细胞，操作如图所示。将全细胞裂解液样品在含0.1% SDS的9%至12%聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上进行电泳。通过抗flag氨基酸印迹法检测萤光素酶RAF突变体的末端或萤光素酶RAF突变体C末端的表达水平，如图所示。然后根据萤光素酶RAF突变体末端及C末端的表达水平，对293T细胞转染子的萤光素酶信号进行归一化处理。体外激酶活性检测可用于有效探究某些组成型活性R-spine突变体的催化活性，但不能用于检测具有融合C-spine的激酶失活突变体的活性。然而，对于二聚体亲和力或稳定性较弱的组成型活性RAF突变体，其催化活性可能无法通过该ASA进行检测，因为它们的二聚体在纯化过程中会被破坏。为避免弱二聚体亲和力或稳定性RAF突变体的催化活性丧失，可将这些突变体与谷胱甘肽S-转移酶融合，以恢复突变体的催化活性。RAF共激活ASA可用于评估激酶失活RAF突变体的变构活性。如图所示，具有酸性末端基序和C脊融合的激酶失活突变体，在293T细胞中共表达时，可作为别构激活剂，触发具有非磷酸化相关酸性末端基序突变体的催化活性。此外，可采用互补型分裂荧光素酶SA系统来检测RAF家族激酶及其突变体的相对二聚体亲和力或稳定性。在体外激酶SA实验中，使用低浓度去污剂的裂解缓冲液，并在样品纯化过程中进行快速温和的洗涤步骤，对实验成功至关重要。该技术将帮助研究人员精确确定与疾病相关的RAF突变体如何激活下游信号通路，从而促进为疾病治疗选择合适的治疗策略。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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