使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析
August 6th, 2019
乘腔snRNA的生物发生是一个复杂的过程,涉及各种细胞隔间。在这里,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,以监测其在细胞内的传输。
在这里，我们应用荧光标记RNA的微注射来检测RNA序列，这些序列对于将短核RNA定位到称为Cajal天体的核结构中至关重要。这项技术有两个主要优点。首先，它可以应用于短期RNA，否则很难标记和跟踪。
其次，它允许快速筛选不同的序列，并测试它们在RNA定位中的作用。在微注射前一天，种子 HeLa 或其他粘附细胞在 12 毫米盖玻片上达到 50% 的汇合在微注射时。首先，将准备好的盖玻片放入培养皿的中心，添加细胞和两毫米培养介质。
第二天，将充满细胞的培养皿放在显微镜的舞台上。使用微加载器，将三微升的 SnRNA 混合物加载到针头中，然后将针头以与 Petri 盘表面 45 度的角度安装到微注射器的支架中。使用 10 倍长距离目标查找针头。
首先，在喷油器上设置粗糙的速度并降低针头，直到它接触培养介质。使用显微镜双筒望远镜，找到针接触培养基的地方的亮点。将速度更改为精细，进一步降低针头，同时观察显微镜，直到观察到针头的尖端。
在视场中间移动针头，然后切换到 40 倍远距离目标。在此之后，选择单元格并移动单元格上方的指针。设置电池接触的压力和时间。
将针头向下移动到单元格中，然后设置微操纵器的下限。设置下限是协议最重要的部分。由于盖玻片表面并不完美，并且每个单元格都不同，因此在注射过程中必须多次设置下限。
接下来，将针头移回电池上方，然后按下喷油器操纵手柄上的喷射按钮。针头将在细胞内自动移动到设定为注射RNA混合物的地方。要完成，请按下喷油器上的菜单按钮，然后从支架上取下针头。
然后断开喷油器和微操纵器，然后断开管与喷油器的连接。微注射后，将细胞返回二氧化碳培养箱，在37摄氏度下孵育一小时。接下来，在室温下用PBS冲洗细胞三次。
在 pH 6.9 的 0.1 摩尔管中用 4% 的甲醛修复细胞 20 分钟。然后用室温PBS清洗细胞三次。如果只分析snRNA定位，请在水中短暂冲洗细胞，并用DAPI安装介质。
在额外的蛋白质定位的情况下，在室温下用0.5%Triton X-100渗透细胞5分钟。用PBS冲洗细胞三次，并用文本协议中概述的适当的初级抗体和二级抗体染色。然后用 PBS 冲洗三次，在水中冲洗一次。
在此之后，使用 DAPI 将电池安装到安装介质中。准备好成像时，请使用配备浸入式目标的高端荧光显微系统获取图像。一旦识别了微射细胞，收集一叠20 Z部分，每个样本有200纳米Z步数，并经过数学去卷。
要量化荧光信号，请首先打开 ImageJ 中的显微镜图像，然后将通道拆分为窗口。通过同步窗口工具同步窗口。接下来，绘制通过线圈免疫污染识别的卡哈尔体周围感兴趣的区域。
测量线圈定义 ROI 中 snRNA 信号的强度。确定随机放置在核质中的ROI中的snRNA荧光强度。保存测量值并计算卡哈尔体和核质中的RNA信号比。
在这项研究中，荧光标记的snRNA被微表示，以监测它们在细胞内的传输。为了测试SM位点是否对Cajal身体积累很重要，缺少SM位点的SnRNA被微入细胞核。注射到细胞质作为控制，而全长snRNA被微注入，作为一个积极的控制。
孵育后，通过间接免疫荧光对微注射细胞进行固定，对Cajal身体标记线圈进行可视化。在核质和细胞质注射后，在Cajal身体中累积的全长snRNA。相比之下，缺乏SM位点的snRNA在微注射到这个隔间后仍留在细胞质中，而没有SM位点的SnRNA的核微注射表明SM结合序列对Cajal身体定位很重要，因为这种SnRNA留在细胞核中，但不会积聚在Cajal体内。
有时，只有一个细胞隔间的微注射失败，欺骗的德克斯特拉70千代吨可以在细胞核和细胞质找到。这些单元格从进一步分析中被丢弃。尽管荧光标记的 snRNA 在注射前储存在负 80 摄氏度，但RNA可能会降解。
注入细胞质的降解性SnRNA不会被运送到细胞质中，并在细胞质中保持局部化。这种snRNA应该被丢弃，新的snRNA应该合成。正确调整细胞类型的注射和补偿压力非常重要。
正如之前说的，为细胞注射设置正确的下限对于良好的微注射至关重要。请记住，RNA 分离期间使用的苯酚氯仿是危险的，微注射针是一个尖锐的物体。处理这些材料时要小心。
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概述
本研究通过利用荧光标记的snRNA的微注射来研究剪接体snRNA的生物合成及其在细胞内的运输。主要的生物学问题集中在这些snRNA在称为Cajal小体的核结构中的定位，提供了有关其正确定位的重要序列的见解。
研究的主要组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 分子生物学
- RNA定位
背景
- snRNA在剪接和RNA处理中扮演着关键角色。
- 了解它们的定位可以阐明RNA功能性所涉及的细胞机制。
- Cajal小体是与snRNA处理相关的亚核结构。
- 微注射能够直接操纵和观察活细胞内的RNA分子。
研究目的
- 检查剪接体snRNA的运输和定位机制。
- 评估特定RNA序列在决定snRNA定位中的重要性。
- 开发一种可靠的方法来追踪细胞内snRNA分子。
使用的方法
- 使用荧光标记的snRNA采用了微注射技术。
- HeLa细胞被用作研究snRNA定位的生物模型。
- 在注射过程中进行了各种控制和调整以确保准确性和可靠性。
- 细胞被固定并进行免疫荧光以可视化Cajal小体标记。
- 使用ImageJ进行荧光信号的定量分析以获得详细数据。
主要结果
- 完整的snRNA成功定位于Cajal小体，确认了SM位点对正确积累的必要性。
- 缺少SM位点的snRNA在Cajal小体中显示定位缺陷，仍然留在细胞质中。
- 控制注射展示了预期的运输模式，协助验证结果。
- 微注射方法的培养和仔细调整对于成功结果至关重要。
结论
- 本研究提供了一种详细的协议来研究活细胞中snRNA的运输和定位。
- 了解RNA定位机制有助于揭示与RNA活动相关的潜在调控途径。
- 从这项研究获得的见解可能有助于更广泛的与RNA功能和细胞组织相关的分子生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding spliceosomal snRNA localization into Cajal bodies provides mechanistic insight into RNA processing pathways relevant to target validation in nucleic acid therapeutics. The microinjection-based localization assay enables rapid interrogation of sequence determinants governing subcellular trafficking, supporting early-stage de-risking of RNA-targeted modalities. This approach contributes to predictive confidence in identifying functional RNA elements critical for therapeutic efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates RNA sequence elements that govern subcellular localization, enabling hypothesis testing of functional domains in snRNA.
- Operational Value: Facilitates rapid screening of mutant constructs to identify sequences essential for nuclear body accumulation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking specific RNA motifs to validated subcellular localization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Enables quantitative assessment of RNA trafficking via fluorescence intensity ratios in defined subcellular compartments.
- Operational Value: Provides a reusable platform for testing RNA variants with standardized readouts for localization efficiency.
- Assay Readiness: Generates quantitative, imaging-based outputs suitable for hit confirmation in RNA-focused screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system compatibility by using human HeLa cells to model snRNA localization mechanisms.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by defining sequence-function relationships in RNA nuclear trafficking.
- Predictive De-risking: Reduces mechanistic ambiguity in RNA therapeutic design by validating localization-dependent functionality.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling sequence-function analysis prior to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of RNA sequence determinants in subcellular localization and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative fluorescence readouts and reproducible localization metrics.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (Cajal body/nucleoplasm fluorescence ratios) enabling comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via use of human cell models and defined localization endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized capability for RNA localization testing applicable across multiple target programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of RNA therapeutics by validating sequence-specific localization to functional nuclear compartments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility through controlled microinjection, fixation, and quantitative imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking RNA sequence features to validated subcellular trafficking, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of RNA targets based on demonstrated localization competence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, fluorescence microscopy, and ImageJ-based quantification.
- Dependent on microfluidic injection systems, fluorescence microscopes with Z-sectioning capacity, and deconvolution software.
- Necessitates standardization of injection pressure, incubation time, and fixation protocols across users and cell lines.
- Requires adaptation considerations when extending to non-adherent or primary cell models.
- Practical limitations include RNA degradation risk and variable injection success, necessitating quality controls for labeled RNA integrity.
