Name: 使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-06T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习利用微注射技术在人HeLa细胞中追踪剪接体snRNA的核内定位机制。该方法通过荧光标记RNA分子，帮助研究人员解析Cajal小体中的RNA转运过程及其关键序列功能。

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本工作得到了捷克科学基金会（18-10035S）、国家可持续发展计划I（LO1419）、机构支持（RVO68378050）、欧洲区域发展基金（CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001775）以及查理大学资助机构（GAUK 134516）的支持。我们进一步感谢捷克共和国布拉格分子遗传学研究所（IMG CAS）光学显微镜核心设施提供的支持（由捷克生物成像项目资助 - LM2015062）。

1. 用于显微注射的snRNA制备
<ol>
	<li>使用以下PCR体系，通过PCR制备包含全长或截短/突变版本snRNA的DNA模板：98 &#176;C，60 秒，98 &#176;℃，15 秒，68 &#176;℃，30 秒；72 ℃ &#176;C，1 分钟，98 &#176;C，15 秒，35 个循环，72 &#176;5 分钟，4 ℃</li>
	<li>正向引物必须在首个转录核苷酸的上游包含用于体外转录的启动子序列。使用含有T7启动子的正向引物和以最后一个转录核苷酸结尾的反向引物扩增U2 snRNA序列（参见 材料表 详情见上文。</li>
	<li>使用短链RNA合成试剂盒合成snRNA（参见&#160;材料表&#160;for details) 含 T7 RNA 聚合酶。加入 1 mM ATP、1 mM CTP、1 mM GTP、0.8 mM UTP、0.2 mM UTP-Alexa488、1.8 mM 三甲基鸟苷帽类似物 (m32,2,7G(5’)ppp(5’)G), 1 &#956;L RNA抑制剂和500-700 ng DNA模板加入反应体系中，37℃孵育 &#730;C 过夜。</li>
	<li>加入1 &#181;加入2U DNase至反应体系中，37℃继续孵育15分钟 &#730;C.</li>
	<li>通过酸性酚/氯仿抽提法分离snRNA。移除上层水相，加入相当于原始体积1/10的3 M醋酸钠（pH = 5.2），3 &#181;L 甘油用于更好地观察沉淀，以及 2.5 倍体积的 100% 乙醇。在 -80 ℃ 下孵育 1 小时 &#730;C，以14,000 × g离心10分钟 g 和 4 &#176;C.</li>
	<li>用70%乙醇洗涤沉淀，并溶于12 &#181;无核酸酶水 L。通常的RNA产量约为600 ng/&#956;L. 在 -80 ℃ 下保存 &#176;C.</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳监测体外转录snRNA的完整性。</li>
	<li>显微注射前，将RNA稀释至终浓度200 ng/μL。&#956;L 在含有 10 的水中 &#181;g/&#181;70 kDa L-葡聚糖-TRITC</li>
</ol>
2. 细胞
<ol>
	<li>使用前，将盖玻片用 1 M HCl 处理 1 小时，然后用蒸馏水彻底清洗，并保存在 100% 乙醇中。酸处理可促进细胞黏附，防止注射过程中或之后细胞脱落。为便于识别已注射的细胞，可使用带网格的盖玻片。</li>
	<li>在微注射前一天，将 HeLa 细胞或其他贴壁细胞接种于 12 mm 盖玻片（编号 1 或 1.5）上，使微注射时细胞融合度达到 50%。</li>
</ol>
3. 注射
注意：HeLa 细胞的显微注射在 Dulbecco 改良必需培养基（D-MEM，含 4.5 g/L D-葡萄糖、酚红和抗生素）中进行。注射使用显微注射仪和配备无菌针头的显微操作器完成（详见材料表）。整个显微镜/显微操作器系统需预先加热至 37 °C 并持续至少 4 小时，以防止显微镜和显微注射装置各部件发生温度波动。
<ol>
	<li>将含有 2 mL 培养基并置于中央的盖玻片的培养皿（30 mm）放入显微镜的载物台上。使用微量移液器吸取 3 µL snRNA 混合物并注入注射针中。将注射针以相对于培养皿表面 45° 的角度安装到显微注射仪的针夹中。</li>
	<li>使用 10x 长工作距离物镜寻找针尖。首先，在注射仪上设置速度为粗调，缓慢降低针尖直至接触培养基液面。通过显微镜双目镜观察，找到针尖接触培养基时产生的亮斑位置。</li>
	<li>将速度切换至微调，继续在显微镜下观察的同时缓慢降低针尖，直至观察到针尖末端。将针尖移至视野中央，切换至 40x 长工作距离物镜。</li>
	<li>更换物镜后，选择目标细胞，并将针尖移至该细胞上方。设置细胞接触所需的压力和时间（详见讨论部分的提示与故障排除）。</li>
	<li>将针尖向下插入细胞内，随后在显微操作器上设定下限位置。注意避免将针尖移至细胞下方。</li>
	<li>设定下限后，将针尖退回细胞上方，按下注射仪操纵杆上的注射按钮。针尖将自动进入细胞并到达预设的限位位置，随后注入 RNA 混合物。</li>
	<li>操作结束后，按下注射仪上的菜单按钮，从针夹中取出注射针。然后在关闭注射仪和显微操作器之前，断开连接管路。</li>
</ol>
4. 细胞固定与染色
<ol>
	<li>显微注射后，将细胞放回 CO2 培养箱，在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育结束后，在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞三次，用含 0.1 M PIPES（pH 6.9）的 4% 多聚甲醛固定 20 分钟，再用室温 PBS 洗涤三次。若仅分析 snRNA 定位，则用清水短暂冲洗后，置于含 DAPI 的封片剂中封片。</li>
	<li>若需同时分析蛋白质定位，则在室温下用含 0.5% Triton-X100 的 PBS 处理细胞 5 分钟进行透化。PBS 冲洗三次后，依次与一抗和二抗孵育，最后用 PBS 洗涤，清水短暂冲洗，再置于含 DAPI 的封片剂中封片。</li>
</ol>
5. 显微镜观察
<ol>
	<li>若贴片后未立即成像，请将载玻片存放于 4 °C 直至成像。</li>
	<li>使用配备浸油物镜（60X 或 100x/1.4NA）的高端荧光显微系统采集图像。</li>
	<li>一旦识别到显微注射的细胞，对每个样本以 200 nm 的 z 步长采集 20 个 z 层切片，并进行数学去卷积处理；随后展示最大投影图像或单个 z 层堆栈图像。</li>
	<li>为定量荧光信号，在coilin免疫染色所识别的Cajal体周围绘制感兴趣区域（ROI），测量coilin定义的ROI内snRNA信号的强度；随后在核质中随机位置设置ROI，测定snRNA荧光强度，并计算Cajal体内与核质中RNA信号的比值。</li>
</ol>

<ol><li>Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+truncated+forms+of+U1+snRNA+reveals+a+novel+RNA+degradation+pathway+during+snRNP+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of truncated forms of U1 snRNA reveals a novel RNA degradation pathway during snRNP biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 42 (4), 2708-2724 (2014).</li>
<li>Stanek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+bodies+and+snRNPs+-+friends+with+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Cajal bodies and snRNPs - friends with benefits.</a> RNA Biology. 14 (6), 671-679 (2017).</li>
<li>Stanek, D., Fox, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+bodies%3A+news+insights+into+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curentr+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear bodies: news insights into structure and function.</a> Curentr Opinion in Cell Biology. 46, 94-101 (2017).</li>
<li>Novotny, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SART3-Dependent+Accumulation+of+Incomplete+Spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SART3-Dependent Accumulation of Incomplete Spliceosomal snRNPs in Cajal Bodies.</a> Cell Reports. 10, 429-440 (2015).</li>
<li>Roithova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sm-core+mediates+the+retention+of+partially-assembled+spliceosomal+snRNPs+in+Cajal+bodies+until+their+full+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Sm-core mediates the retention of partially-assembled spliceosomal snRNPs in Cajal bodies until their full maturation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (7), 3774-3790 (2018).</li>
<li>Fischer, U., Sumpter, V., Sekine, M., Satoh, T., Luhrmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleo-cytoplasmic+transport+of+U+snRNPs%3A+definition+of+a+nuclear+location+signal+in+the+Sm+core+domain+that+binds+a+transport+receptor+independently+of+the+m3G+cap%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Nucleo-cytoplasmic transport of U snRNPs: definition of a nuclear location signal in the Sm core domain that binds a transport receptor independently of the m3G cap.</a> EMBO Journal. 12 (2), 573-583 (1993).</li>
<li>Shukla, S., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+control+of+assembly-defective+U1+snRNAs+by+decapping+and+5%27-to-3%27+exonucleolytic+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quality control of assembly-defective U1 snRNAs by decapping and 5'-to-3' exonucleolytic digestion.</a> Proceeding of the National Academy of U S A. 111 (32), E3277-E3286 (2014).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+message+clear%3A+visualizing+mRNA+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Making the message clear: visualizing mRNA localization.</a> Trends in Cell Biology. 20 (7), 380-390 (2010).</li>
<li>Klingauf, M., Stanek, D., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+U4%2FU6+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle+association+in+Cajal+bodies+predicted+by+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein particle association in Cajal bodies predicted by mathematical modeling.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (12), 4972-4981 (2006).</li>
<li>Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tRNA-linked+molecular+beacons+for+imaging+mRNAs+in+the+cytoplasm+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells.</a> Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们采用荧光标记snRNA的显微注射技术，以确定snRNA定位于核内卡哈尔体的关键序列。由于标记RNA的制备快速且相对简便（通过PCR制备DNA模板，随后进行体外转录），该方法可有效分析不同序列对RNA定位的贡献。在相对较短的时间内，我们已成功分析了U2 snRNA的十种不同的缺失或替换突变（参考文献5及未展示数据）。对于具有复杂生物合成途径的RNA，该方法还可用于检测其成熟所必需的序列。以snRNA为例，若缺失Sm结合序列（该序列是Sm环组装所必需的），会导致突变snRNA在细胞质中被隔离并降解7。另一优势在于，可同时注射两种不同标记的RNA，并在同一细胞内直接比较其定位情况。然而，由于不同荧光染料可能影响RNA的行为，每种荧光染料在双标记实验前均需单独验证。已有研究表明，长度达数百个核苷酸的RNA可成功注射，并在多种模式系统中检测其定位（详见参考文献8的综述）。对于较长RNA，其限制步骤通常在于全长RNA的体外合成。此外，也可注射已预先与蛋白质组装的RNA，以检测单个蛋白质对RNP定位的影响...

RNA剪接是基因表达中的关键步骤之一，由一种称为剪接体的大型核糖核蛋白复合物催化完成。在整个剪接过程中，超过150种蛋白质和5种小核RNA（snRNA）会在不同阶段整合到剪接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA参与主要的GU-AG内含子的剪接。这些snRNA以预先形成的核小核糖核蛋白颗粒（snRNP）形式进入剪接体，每个snRNP包含snRNA、与snRNA结合的7种Sm蛋白（或与U6 snRNA结合的类似Sm蛋白）以及1至12种特异于该snRNP的蛋白质。
snRNP的组装包括细胞质和细胞核两个阶段。新转录的snRNA被输出至细胞质，在那里结合由七种Sm蛋白组成的环状结构。该Sm环随后作为信号，介导snRNA重新输入细胞核。未能与Sm蛋白结合的有缺陷snRNA则滞留在细胞质中1。新进入细胞核的snRNP首先出现在卡哈尔体（Cajal body）中，在此处与snRNP特异性蛋白结合并完成成熟过程（详见文献2,3综述）。我们近期研究表明，抑制snRNP最终成熟步骤会导致未成熟snRNP在卡哈尔体中被隔离4,5。我们提出一个模型，即snRNP的最终成熟过程受到质量监控机制的调控，该机制监测snRNP特异性蛋白的正确添加以及功能性snRNP的形成。然而，细胞如何区分正确组装的成熟颗粒与异常的未成熟颗粒，其分子机制仍不清楚。
为了确定snRNA中对snRNA在核内卡哈尔体（Cajal bodies）中靶向定位和富集至关重要的序列，我们决定采用荧光标记snRNA的显微注射技术。显微注射是首选方法，原因如下：1）该方法无需额外添加序列标签即可区分合成snRNA与其内源性对应物，这对于空间有限、难以插入额外标签序列的短RNA尤为重要；2）该方法可用于分析对snRNA生成过程至关重要的序列。例如，Sm序列对于Sm蛋白环的组装以及snRNP重新进入细胞核至关重要6。当snRNA在细胞内表达时，缺乏Sm序列的snRNA会在细胞质中被降解，无法进入细胞核和卡哈尔体7。然而，缺乏Sm序列的snRNA可直接显微注射至细胞核内，从而可检测Sm序列在snRNA定位于卡哈尔体过程中的潜在作用。
本文详细描述了一种我们曾用于确定snRNA序列以将snRNA靶向定位于卡哈尔体所需的微注射方法5。我们证明，Sm结合位点和SMN结合位点共同存在时，足以将snRNA以及多种短链非编码RNA定位至卡哈尔体。基于微注射实验及其他证据，我们提出，组装在Sm结合位点上的Sm蛋白环结构即为卡哈尔体的定位信号。

<table><tbody><tr><td>ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP</td><td>ThermoFisher</td><td>C11403</td><td>储存浓度 1 mM</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基 - 高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>含 4.5 g&amp;frasl;L D-葡萄糖、酚红和抗生素</td></tr><tr><td>FemtoJet express 显微注射仪</td><td>Eppendorf</td><td>5247000013</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td>显微注射针，内径 0.5 &amp;micro;m，外径 0.7 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Fluoromont G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>糖原</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>储存浓度 5 mg/mL</td></tr><tr><td>带网格的玻璃盖玻片</td><td>Ibidi</td><td>10817</td><td>带网格的盖玻片，无直接使用经验</td></tr><tr><td>InjectMan NI 2 显微操作器</td><td>Eppendorf</td><td>5181000017</td><td></td></tr><tr><td>m3-2,2,7G(5')ppp(5')G 三甲基化帽类似物</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-853-1</td><td>储存浓度 40 mM</td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 转录试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 12 mm，1 号</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>111520</td><td>用于常规实验</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 12 mm，1.5 号</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>117520</td><td>用于高分辨率成像</td></tr><tr><td>DeltaVision 显微镜</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>用于图像采集</td></tr><tr><td>DMI6000 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td>用于显微注射</td></tr><tr><td>32% 电镜级甲醛溶液</td><td>EMS</td><td>15714</td><td>溶于 PIPES，终浓度为 4%</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿 5:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>U2 扩增引物：正向：5&amp;rsquo;-TAATACGACT&lt;br /&gt;CACTATAGGGATCGCTTCT&lt;br /&gt;CGGCCTTTTGG,&lt;br/&gt; 反向：5&amp;acute; TGGTG&lt;br /&gt;CACCGTTCCTGGAGGT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>斜体部分为 T7 启动子序列</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>BioLab</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>储存浓度 40 mM</td></tr><tr><td>异硫氰酸四甲基罗丹明标记的葡聚糖（65–85 kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1162</td><td>溶于水，储存浓度 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Serva</td><td>37240</td><td>溶于水，储存浓度 10%</td></tr></tbody></table>

利用显微注射技术分析人源hela细胞中剪接体snrna的定位

Analysis of Spliceosomal snRNA Localization in Human Hela Cells Using Microinjection

剪接体snRNA的生物合成是一个复杂的过程，涉及细胞核和细胞质两个阶段，最后一步发生在一种称为卡哈尔体（Cajal body）的核内结构中。然而，直到最近，指导snRNA定位于该核内结构的序列仍不明确。为了确定对snRNA在卡哈尔体中积累至关重要的序列，我们采用了荧光标记snRNA的显微注射技术，并随后观察其在细胞内的定位情况。首先，我们构建了snRNA的缺失突变体，制备了用于体外转录的DNA模板，并在含有与Alexa488偶联的UTP存在下转录生成snRNA。将标记后的snRNA与TRITC偶联的70 kDa葡聚糖混合，显微注射至人HeLa细胞的细胞核或细胞质中。细胞孵育1小时后固定，通过间接免疫荧光法显示卡哈尔体标志蛋白coilin，而snRNA以及作为核或细胞质注射标志的葡聚糖则直接通过荧光显微镜观察。该方法可高效、快速地检测各种序列对RNA细胞内定位的影响。在此，我们展示了Sm结合序列对于snRNA高效定位于卡哈尔体的重要性。

为了监测snRNA的定位以及Sm结合位点在卡哈尔体靶向中的作用，我们制备了含有T7启动子的DNA模板，该模板包含全长U2 snRNA或缺失形成Sm结合位点的七个核苷酸（AUUUUUG）的U2 snRNA。snRNA通过体外转录生成，经分离后与TRITC标记的70 kDa葡聚糖混合。我们将含有体外转录snRNA的混合物显微注射至HeLa细胞的细胞核或细胞质中。
先前的研究表明，Sm结合位点对于核输入是必需的6。为了检测Sm位点是否在snRNA向卡哈尔体（Cajal body）的富集过程中也起重要作用，我们将缺失Sm位点的snRNA直接显微注射到细胞核内（图1A），而将注射到细胞质中的样本作为对照（图1B）。作为阳性对照，我们显微注射了全长snRNA（图1C、D）。显微注射后，将细胞在CO2培养箱中孵育60分钟，随后固定细胞，并通过...

剪接体snRNA的生成是一个涉及多种细胞区室的复杂过程。在此，我们采用荧光标记的snRNA显微注射技术，以监测其在细胞内的转运过程。

利用显微注射技术分析人源HeLa细胞中剪接体snRNA的定位

剪接体snRNA的生成是一个复杂的过程，涉及细胞核和细胞质两个阶段，最后一步发生在细胞核内的一个特定区域……

在此，我们采用荧光标记RNA的显微注射技术，以检测短核RNA定位于核内称为卡哈尔体（Cajal bodies）的核结构所必需的RNA序列。该技术具有两个主要优势。首先，该方法适用于其他方法难以标记和追踪的短RNA。其次，它能够快速筛选不同的序列并检测其在RNA定位中的作用。显微注射前一天，将HeLa细胞或其他贴壁细胞接种于12毫米的盖玻片上，使其在显微注射时达到50%的汇合度。开始时，将准备好的盖玻片放入培养皿中央，加入细胞和2毫米的培养基。第二天，将含有细胞的培养皿放置在显微镜载物台上。使用微加载器将三微升的snRNA混合物吸入针头中，并将针头以相对于培养皿表面45度的角度安装到显微注射仪的针 holder 中。使用10倍长工作距离物镜寻找针头。首先，将显微注射仪的速度调至粗调档，降低针头直至其接触培养基。通过显微镜双目镜观察，找到针头接触培养基时产生的亮斑。将速度切换至细调档，并在显微镜下继续缓慢降低针头，直至观察到针尖末端。将针移动到视野中央，切换至40倍长工作距离物镜。随后选择细胞，并将针移至细胞上方。设置细胞接触所需的压强和时间。将针头向下移动进入细胞，然后设定显微操作仪的下限位置。设定下限是本实验方案中最关键的步骤。由于盖玻片表面并非完全平整，且每个细胞的情况各不相同，因此在注射过程中需要多次重新设定下限位置。接下来，将针头移回细胞上方，按下显微注射仪操纵杆上的注射按钮。针头将自动进入细胞内，到达预设位置后注入RNA混合物。操作完成后，按下注射仪上的菜单按钮，从持针器中取出针头。然后在关闭注射器和显微操作仪之前，将管路从注射器上断开。显微注射后，将细胞放回二氧化碳培养箱中，在37摄氏度下孵育1小时。接着在室温下用PBS洗涤细胞三次。用 pH 6.9 的 0.1 摩尔 Pipes 缓冲液中含 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。随后用室温 PBS 洗涤细胞三次。若仅分析 snRNA 定位，则用清水短暂漂洗细胞，并用含 DAPI 的封片剂封片。如果需要进行额外的蛋白质定位，用含0.5% Triton X-100的PBS在室温下对细胞透化处理5分钟。用PBS冲洗细胞三次，然后按照文本方案中所述，使用相应的一抗和二抗进行染色。接着用PBS冲洗三次，再用纯水冲洗一次。此后，将细胞置于含 DAPI 的封片剂中封片。准备成像时，使用配备浸油物镜的高端荧光显微系统采集图像。确定显微注射的细胞后，对每个样本采集 20 个 Z 轴切片，Z 轴步长为 200 纳米，并进行数学去卷积处理。为了定量荧光信号，首先在 ImageJ 中打开显微镜图像，并将各通道拆分为独立窗口。使用窗口同步工具使各窗口同步。接着，围绕由 coilin 免疫染色鉴定的 Cajal 小体绘制感兴趣区域。测量coilin定义的ROI中snRNA信号的强度。在核质中随机放置ROI，测定snRNA荧光的强度。保存测量值，并计算Cajal小体与核质中RNA信号的比值。在本研究中，通过显微注射荧光标记的snRNA，以监测其在细胞内的转运过程。为了检测SM位点是否对 Cajal 小体的聚集具有重要性，将缺乏SM位点的snRNA直接显微注射到细胞核内。将RNA注射至细胞质作为对照，而全长snRNA的显微注射则作为阳性对照。孵育后，对显微注射的细胞进行固定，并通过间接免疫荧光法检测 Cajal 小体标记蛋白 coilin。全长 snRNA 在细胞核和细胞质注射后均积累于 Cajal 小体中。相比之下，缺乏 SM 位点的 snRNA 在注射到细胞质后仍滞留在细胞质中；而将缺乏 SM 位点的 snRNA 注射到细胞核内则表明，SM 结合序列对 snRNA 定位于 Cajal 小体至关重要，因为该 snRNA 虽保留在细胞核内，但无法在 Cajal 小体中积累。有时仅向一个细胞区室进行显微注射会失败，导致70千道尔顿的葡聚糖出现在细胞核和细胞质中。这些细胞将被弃用，不再用于后续分析。尽管荧光标记的snRNA在注射前保存在负80摄氏度条件下，但仍可能发生RNA降解。注入细胞质后发生降解的snRNA不会被转运至细胞核，而是滞留在细胞质中。此类snRNA应予以弃用，并重新合成新的snRNA。针对特定细胞类型，正确调节注射压力和补偿压力至关重要。如前所述，设定正确的细胞注射下限对于一次成功的显微注射至关重要。请务必注意，RNA 提取过程中使用的苯酚-氯仿具有危险性，显微注射针为锐利物品。在操作这些材料时应格外小心。

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神经科学

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本方案描述了一种微型基因报告基因检测方法，用于监测5´剪接位点突变对剪接的影响，并开发了用于挽救突变所致剪接抑制的抑制性U1 snRNA。将报告基因和抑制性U1...

基于报告基因的细胞检测法用于监测剪接效率

本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。...

低输入量细胞核分离及条形码抗体多重检测小鼠交感神经节用于单细胞核RNA测序

学习利用微注射技术在人HeLa细胞中追踪剪接体snRNA的核内定位机制。该方法通过荧光标记RNA分子，帮助研究人员解析Cajal小体中的RNA转运过程及其关键序列功能。

利用显微注射技术分析人源HeLa细胞中剪接体snRNA的定位

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