通过细针穿刺检测血管外Trypanosoma寄生虫

细针穿刺细胞学是一种经济、简便、快速且微创的技术，可用于从活体小鼠可触及器官的病灶中采集锥虫。由于细针穿刺为非终末性操作，可在同一动物体内随时间推移进行多次取样。若该发现可应用于牛，此方法将对兽医在农场环境中诊断牛锥虫病具有重要价值。

由本实验室的助理技术员 Ana Margarida Santos 演示涂片染色步骤。首先，通过脚趾挤压法确认麻醉效果。当腿部回缩反射消失时，将小鼠置于仰卧位。

仔细触诊睾丸，确定其大小以及与表层皮肤的距离，然后用食指和中指或食指与拇指将其固定。为进一步固定目标部位，需将表层皮肤紧绷拉伸，并用酒精棉片清洁表面。接着，将连接于5毫升注射器的23号针头的针尖刺入目标部位，确保注射器活塞处于静止状态。

为施加负压，将注射器活塞回抽至3到4毫米刻度处，重复两到三次。为提高获得代表性样本的概率，并更准确地靶向附睾等较小结构，可在器官内沿直线或多个不同切线方向调整针头位置。随后释放负压，拔出针头。

只有在松开活塞以释放负压后，才能拔出针头。否则，抽吸物会被吸入注射器内且无法回收。在穿刺部位用无菌纱布按压，以控制可能的出血。

将注射器与针头断开，并吸入空气。重新连接针头，将针头尖端非常靠近甚至接触载玻片，然后轻轻将针内液体排至载玻片上。为确保重复取样，每只动物每个器官至少再进行一次额外的抽吸操作。

在皮下注射200微升生理盐水配制的每千克1毫克阿替美唑以逆转麻醉后，将动物放回其原饲养笼中进行恢复。用非优势手捏住载玻片的磨砂端，拿起含有抽吸液滴的载玻片。用优势手取一张干净的推片，将其光滑洁净的边缘以约30度的角度置于第二张载玻片上液滴的上方。

为获得一层薄膜，用一次轻柔、连续且稳定的动作将载玻片向前推移。放置好载玻片，使样品迅速且完全地通过空气干燥。用铅笔在载玻片的磨砂边缘做好标记。

进行吉姆萨染色时，将风干的涂片浸入盛有100%甲醇的考普林瓶中，固定5分钟。随后将玻片转移至含有20%吉姆萨染液和蒸馏水的考普林瓶中，染色30分钟。用自来水冲洗玻片，再用纸巾轻轻吸干，彻底干燥。

将载玻片水平持握，向涂片上滴加数滴非水性封片介质。将盖玻片的一边接触载玻片，缓缓放下并轻压，以去除气泡。对于免疫细胞化学实验，将空气干燥的涂片在室温下用100%甲醇固定10分钟。

将玻片置于盛有1×PBS的考普林瓶中洗涤5分钟，每次使用新鲜的1×PBS，重复此步骤三次。从考普林瓶中取出玻片后，擦去多余的缓冲液，注意不要触碰涂片区域，并用水排斥笔在涂片周围画一圈。将玻片水平持握，向每个涂片上加入150微升稀释的一抗溶液，在室温下孵育1小时。

孵育后，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用 1×PBS 洗涤 5 分钟，重复此步骤 3 次，每次均使用新鲜的 1×PBS。将载玻片水平持握，向每张涂片上加入 150 微升市售的辣根过氧化物酶 DAB 显色系统试剂，室温孵育 30 分钟。再次用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。

然后将载玻片浸入盛有 Harris 苏木精液的 Coplin 染色缸中复染 10 秒。用自来水冲洗，再用纸巾轻轻吸干。将载玻片水平持握，向涂片上滴加数滴非水溶性封片介质。

将盖玻片的一边轻轻接触载玻片，缓慢放下并轻压，以去除任何气泡。高质量的涂片表现为细胞呈单层分布，密度适宜，形态学特征保存良好，能够识别其组织来源及各类细胞间的相对比例。此外，寄生虫可被有效免疫染色，易于识别和计数。

细针穿刺结果不佳或呈阴性，可能是由于取材过少，导致样本不能充分代表病灶或器官的真实情况。也可能由于单张载玻片上的材料过多，造成涂片过厚，从而影响细胞学评估。所谓的压碎伪影，是由于涂片时施加了过大的力量，导致细胞破裂，产生大量裸核和DNA条纹。

在涂片制备过程中，若施加的力度不足，细胞无法充分分散，导致形成分层结构，从而妨碍对细胞形态特征的评估。与组织病理学相比，细针穿刺细胞病理学具有细胞形态保存更佳、对细胞相对比例的评估及细胞计数更为准确的优势。免疫细胞化学技术比免疫组织化学更简单、快速，且更易于优化。

进行细针抽吸时，务必确保动物固定良好，待抽吸的器官或肿块保持稳定，并协调地施加和释放负压。为制备高质量的涂片，应在将样本置于载玻片上后立即进行推片操作，推片时用力应轻柔，避免细胞压碎产生人为假象。除常规显微镜检查和免疫细胞化学外，该样本还可用于电子显微镜、生化分析、流式细胞术、分子生物学检测，甚至体外实验。

该技术使我们能够证明细针穿刺可用于实验动物疾病的诊断与研究。我们成功诊断出锥虫寄生虫对外部雄性生殖器官的趋向性，并能够在感染过程中对该疾病进行表征。