Name: 细针吸入检测血管外胰腺瘤寄生虫 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习细针穿刺技术用于从活体小鼠器官中采集锥虫样本，结合吉姆萨染色和免疫细胞化学方法进行诊断分析。该技术为兽医诊断寄生虫感染提供了微创、可重复采样的有效手段。

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本项目由科学技术基金会（Fundação para a Ciência e a Tecnologia，FCT）/科学、技术和高等教育部（Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior，MCTES）通过国家预算基金（参考编号：ID/BIM/50005/2019）资助。LMF 是科学技术基金会（IF/01050/2014）的研究员，其实验室还获得了欧洲研究理事会（ERC）的资助（项目 FatTryp，编号 771714）。本研究的发表也由科学技术基金会（FCT）/科学、技术和高等教育部（MCTES）通过国家预算基金资助的项目 UID/BIM/50005/2019&#160;提供经费&#160;支持。我们感谢 iMM 组织学与比较病理学实验室的 Andreia Pinto 在电子显微镜技术方面提供的专业协助，并感谢 Sandra Trindade、Tiago Rebelo 和 Henrique Machado（iMM）分享感染小鼠的组织样本。

本方案中的所有动物实验均按照欧盟法规进行，并已获得分子医学研究所（iMM）动物伦理委员会的批准（AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM）。iMM的动物设施符合葡萄牙关于实验动物使用的法律规定（法令第113/2013号），并遵循欧盟指令2010/63/EU以及欧洲实验动物科学协会联合会（FELASA）关于实验动物福利的指南与建议。
1. 小鼠雄性外生殖器寄生虫的吸取
注意：采用6至&#160;10周龄的野生型雄性C57BL/6J小鼠进行细针穿刺（FNA），通过腹腔注射200 µL含2,000个锥虫（T. brucei）的生理盐水建立感染，具体方法如前所述16。
<ol>
	<li>对雄性小鼠外生殖器进行细针穿刺抽吸（FNA）时，将小鼠置于超净工作台中，通过腹腔注射200 µL生理盐水配制的混合物（75 mg/kg 氯胺酮 + 1 mg/kg 美托咪啶）进行麻醉。
	<ol>
		<li>使用脚趾夹捏法确认麻醉效果。当腿部回缩反射消失后，将小鼠置于仰卧位（图2A）。</li>
		<li>仔细触诊睾丸，评估其大小及与表层皮肤的距离。用食指与中指或食指与拇指固定器官，将覆盖其上的皮肤紧绷地拉过目标区域以进一步固定。用酒精棉片清洁表面（图2A）。</li>
		<li>手持已组装的22 G针头和5 mL注射器，将针尖刺入目标区域，操作时始终保持推柄处于静止状态（图2B-C）。</li>
		<li>通过将注射器活塞回抽至4 mL至5 mL刻度处，进行2-3次抽吸。在器官内沿直线或多个不同切线方向调整针头位置，以提高获得代表性样本以及穿刺到附睾等较小结构的概率。确保操作轻柔，以尽量减少组织损伤（图2C-D）。</li>
		<li>释放负压后拔出针头。切勿在活塞仍处于回抽状态时重新插入针头，否则会导致抽吸物被吸入注射器筒内而难以回收（图2E）。拔针后，用无菌&#160;纱布敷料在穿刺部位施加压力以控制出血。</li>
		<li>将注射器与针头分离，吸入空气后重新连接针头，并轻柔地将针内内容物排出至载玻片上。针尖应非常接近甚至接触载玻片，以避免飞溅（图2F-I）。</li>
		<li>每个器官/动物至少再进行一次额外抽吸，以确保样本重复性。</li>
		<li>皮下注射200 µL生理盐水配制的1 mg/kg 阿替美唑以逆转麻醉，随后将动物放回原笼中恢复，并持续观察直至完全苏醒。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从抽吸物制备涂片
注意：整个操作过程中需佩戴手套，并确保针头和注射器的安全处置。
<ol>
	<li>两步拉片法
	<ol>
		<li>用非优势手拿起带有吸取液滴的载玻片，用拇指和食指夹住磨砂端（图3A）。</li>
		<li>用优势手拿起另一张干净的载玻片（推片），将其横跨过带有液滴的第一张载玻片。将推片的光滑洁净边缘以约30°的角度置于标本载玻片上液滴的上方（图3B）。</li>
		<li>以一次轻柔、连续且稳定的动作向前滑动推片，形成一层薄薄的涂片（图3C）。</li>
		<li>将载玻片静置，使其材料完全且快速地自然风干（图3D）。切勿加热固定。用铅笔在载玻片的磨砂边缘做好标记。 
		注意：本方案可在该步骤暂停，涂片可长期保存，直至准备染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 涂片染色
注意：整个操作过程中需佩戴手套，并确保步骤 3.1.4 和 3.2.9 在通风橱内进行。
<ol>
	<li>吉姆萨染色方案
	<ol>
		<li>将空气干燥的涂片浸入盛有100%甲醇的考普林瓶中，固定5分钟（图3E）。</li>
		<li>将玻片转移至盛有20%吉姆萨溶液（用蒸馏水按1:5稀释）的考普林瓶中，染色30分钟；或使用10%吉姆萨溶液染色10分钟（图3F）。</li>
		<li>用自来水冲洗，再用纸巾轻轻吸干。</li>
		<li>将玻片水平放置，在涂片上滴加一滴非水性封片介质。将盖玻片的一边接触玻片，缓缓放下并轻压，以去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细针穿刺涂片的免疫细胞化学染色
	<ol>
		<li>将空气干燥的涂片在室温下用100%甲醇固定10分钟。</li>
		<li>将玻片放入盛有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的考普林瓶中洗涤5分钟，重复此步骤3次，每次均使用新鲜的1× PBS。</li>
		<li>从考普林瓶中取出玻片，擦去多余缓冲液，注意不要触碰涂片区域，并使用疏水笔在涂片周围画圈（材料表）。</li>
		<li>将玻片水平放置，向每个涂片上加入150 μL稀释的一抗溶液，在室温下孵育1小时。 
		注意：本实验所用一抗为未纯化的兔抗T. brucei VSG13抗原血清（可与多种T. brucei VSG发生交叉反应，实验室自制），用1× PBS按1:50,000稀释。通过以预免疫血清（材料表）替代相应的一抗进行阴性对照，以评估二抗的非特异性结合。</li>
		<li>将玻片放入盛有1× PBS的考普林瓶中洗涤5分钟，重复此步骤3次，每次均使用新鲜的1× PBS。</li>
		<li>将玻片水平放置，向每个涂片上加入150 μL市售的辣根过氧化物酶/DAB显色系统试剂，室温孵育30分钟（材料表）。</li>
		<li>用1× PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>将玻片浸入盛有哈里斯苏木精液的考普林瓶中进行复染。用自来水冲洗后，用纸巾轻轻吸干。</li>
		<li>将玻片水平放置，在涂片上滴加一滴非水性封片介质。将盖玻片的一边接触玻片，缓缓放下并轻压，以去除气泡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细针穿刺抽吸（FNA）是一种广泛用于人类和家养动物疾病诊断的方法。该技术经过多年标准化1,2，使用细口径针头从可触及的肿块或器官中抽吸细胞或液体1,3。随后通常将抽吸物涂布在玻璃载片上，染色后进行显微镜观察以获得诊断结果，但该技术也可用于获取细胞以用于其他目的4,5,6,7,8,9。
该操作快速（对于有经验的研究人员，每只小鼠&#60;5 分钟），并发症风险极低，与接受简单静脉穿刺时的风险相似。因此，对于可触及肿块的细针穿刺抽吸（FNA），仅在解剖位置敏感或需要对动物进行良好固定，以及对拟抽吸器官或肿块实现极佳稳定以获得最佳结果时，才需要麻醉。这在小型实验动物中较为常见，因为在无麻醉情况下，用一只手安全有效地固定小型啮齿类动物，同时用另一只手确保最佳穿刺区域通路，通常难以实现。短期麻醉在大多数情况下已足够，但对小鼠成功实施良好的FNA而言仍是必要的。良好的固定可最大程度地获取能够代表病灶细胞成分的抽吸物，同时最大限度地降低施加负压时针头尖端移出目标位置的风险。
尽管该操作本身非常简单，但真空的协调施加与释放是最关键的步骤。针头插入后，需回抽注射器的活塞以产生可控的负压（抽吸），并且只有在松开活塞释放负压后，才能将针头从病灶中取出（图2）；否则，抽吸物会被吸入注射器筒内，难以回收。另一个非常重要的步骤是制备高质量的涂片。制备涂片的方法有多种，但无论采用何种方法，都应在材料放置到载玻片上后立即进行涂片。应轻柔地涂布生物材料，以避免细胞压碎的人工假象。使用盖玻片作为推片有助于防止此类假象。然而，涂片过程中施力过大可能会导致盖玻片破裂。高质量的涂片通常使大部分细胞呈单层分布，以便于光线透过。细胞成分不应过多地被困在血凝块中。
细针穿刺抽吸（FNA）的目的是从肿块、组织或器官中采集细胞。使用较大内径的针头有助于增加细胞含量，但可能伴随过多的血液污染；而使用较小针头采样则可获得质量更高但数量较少的标本。在本实验中，对实验性感染布氏锥虫（T. brucei）的小鼠，采用22号针头连接5 mL注射器经皮穿刺抽吸雄性外生殖结构。小鼠经麻醉后，一手固定睾丸，另一手进行穿刺并实施抽吸。我们获得了大量与生精细胞、精子、上皮细胞及间质细胞混合的锥虫，将其涂片后针对寄生虫表面蛋白（VSG）进行免疫染色（图4）。
由于细针穿刺抽吸是一种盲穿操作，无法观察到针尖位置以及靶器官或肿块，因此即使对同一病灶的多个区域进行多次取样，仍可能存在取样误差，导致结果呈阴性。这一点在临床环境中尤为重要，因为对于可疑病灶，即使细针穿刺细胞学检查（FNA）结果为阴性，也不能排除进一步检查的必要性；但在疾病动物模型中，这一问题的重要性较低。因此，该方法的主要局限性包括假阴性结果（较为常见）和较少出现的假阳性结果（例如由血液污染引起）。而在动物实验背景下，最重要的局限性在于无法获得组织结构信息17，而组织病理学检查则可提供此类信息，例如寄生虫分布模式、免疫细胞分布以及细胞间相互作用特征。尽管如此，FNA 的优势在于其为非终末性操作，可在同一动物体内进行多次重复取样，并且始终能够获得更佳保存的细胞形态（图5）。相比之下，从实验小鼠体内获取宿主细胞、免疫细胞或微生物的其他方法，则始终依赖于处死小鼠以采集目标肿块或器官。
据我们所知，关于细针穿刺抽吸术（FNA）在小型实验动物中应用的报道极少，其中一篇发表于1949年，描述了使用22 G针头穿刺抽吸骨髓以研究造血功能18；其余研究均将FNA与流式细胞术结合，用于定量肿瘤相关炎性细胞或内皮细胞7,19,20。我们的研究表明，该技术可进一步拓展应用于感染性疾病模型的诊断与研究，并可将细胞学分析与免疫细胞化学或电子显微镜等技术相结合。该方法在实验动物中的两个主要优势在于：（1）该操作为非终末性，即可在活体小鼠中进行；（2）由于其侵入性轻微，可在同一只动物身上进行多次连续穿刺抽吸。因此，每项研究所需的小鼠数量显著减少，且能够方便地分析临床疾病进展与疾病和/或病原体的细胞及分子特征演变之间的相关性，从而实现纵向研究。
关于使用细针穿刺（FNA）诊断感染性疾病的首篇报道，可能是Grieg和Gray在1904年发表的一项研究，该研究报道了对昏睡病患者淋巴结进行针吸，发现了活动性的锥虫12。如果我们在实验小鼠中的发现能够推广至牛群，即如果可通过FNA从雄性外生殖结构中轻松获取锥虫（Trypanosoma），那么可以预期，该技术将有助于兽医在农场现场诊断家畜的锥虫病。

细针穿刺抽吸（FNA）广泛应用于人类和家养动物癌症及非肿瘤性疾病的诊断。该技术经过多年已实现标准化，并在众多教科书中有所描述1,2。
该操作主要通过将细针连接至空注射器，利用负压经皮穿刺抽吸可触及的肿块、器官或积液，从而从病灶中抽取细胞或液体1,3。通常使用的针头规格为22至25G（G表示针头内径），使用较粗针头（大直径，例如21G）有助于提高细胞含量，但可能导致血液污染过多。针头长度需根据病灶深度选择，浅表病灶通常使用1英寸或1½英寸的针头。注射器通常为5至10 mL，较大的注射器可产生更高的负压，从而提高抽吸物的获取量。对于不可触及的深部病灶，也可在影像引导（如超声）下使用较长针头进行穿刺抽吸。获取的抽吸物可涂片后进行空气干燥、湿固定、染色，并在显微镜下观察以获得诊断结果3（图1）。
这是一种简单、经济、无痛且微创的技术，主要用于术前环境中对可触及的肿块进行诊断，同时也适用于淋巴结、甲状腺、前列腺甚至男性外生殖结构等器官。1除了作为诊断工具外，该技术还可用于收集细胞以用于其他目的，即细胞遗传学和电子显微镜（图1D），流式细胞术表征4,5,6,7，细胞培养的建立8. A&#160;临床实践中一个常见的例子是为体外受精进行的精子获取9.
可在同一病灶内反复抽吸数次，以获得多张涂片。对于异质性病灶，例如同时存在实性区域和囊性空间的情况，必须从各个区域分别抽吸细胞。细针穿刺活检（FNA）所获取的标本通常细胞含量丰富，大多数情况下无需进行组织活检即可完成疾病诊断。此外，还可对FNA获得的涂片进行特殊染色、免疫荧光、免疫细胞化学&#160;（图1D）以及分子检测等分析，例如在仅靠形态学无法识别病原体时用于确定感染性病原体10。FNA的一般应用范围以及所需设备和耗材的简要概述分别总结于表1和表2中。
关于使用穿刺针进行诊断的首份报告见于阿拉伯医学的早期文献，但现代穿刺抽吸技术是在20世纪初才得以应用11。值得注意的是，可能最早提出将细针穿刺抽吸（FNA）用于感染性疾病诊断的报告是一项1904年的研究，Grieg和Gray报道了对昏睡病患者淋巴结进行穿刺抽吸后，在样本中发现了活动的锥虫12。作者指出，无论是在早期还是进展期病例中均能检测到锥虫，且其密度高于血涂片中的检出率，而血涂片中此类病原体往往极为罕见12。
目前对牛锥虫病的诊断依赖于在血液、淋巴液中直接观察寄生虫，或采用免疫学诊断技术13,14,15。我们先前已证实，在小鼠的实验性Trypanosoma感染中，布氏锥虫（T. brucei）对脂肪组织具有显著的趋向性16，同时也趋向于某些雄性外部生殖结构，特别是附睾17。这些组织的间质中可大量积聚寄生虫16。
以下方案详细描述了在活体小鼠中进行细针穿刺抽吸（FNA）的技术操作步骤，旨在获取存在于雄性外生殖结构（睾丸、附睾及附睾脂肪）中的锥虫，随后进行常规细胞学检查以及针对特定寄生虫蛋白（VSG）的免疫染色16,17。穿刺操作在感染后第6天进行，所遵循的安全操作规程为实验动物常规操作中普遍采用的标准。对于存在免疫缺陷的动物，还需采取额外防护措施（穿戴经蒸汽灭菌的防护服、口罩、头帽、无菌手套，并始终确保无菌操作），以降低意外接触机会性病原体的风险。

<table><tbody><tr><td>阿替美唑（ANTISEDAN 10 mL）</td><td>Bio 2</td><td>7418046</td><td>麻醉逆转</td></tr><tr><td>盖玻片（24 × 60，No.1）</td><td>VWR</td><td>631-0664</td><td>涂片制备</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>Entellan（500 mL）</td><td>VWR</td><td>1.07961.0500</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>Envision Flex 抗体稀释液</td><td>Dako</td><td>8006</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>EnVision Flex HRP 标记二抗（抗兔）</td><td>Dako</td><td>K4010</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>Envision Flex 洗涤缓冲液</td><td>Dako</td><td>K8007</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Atom Scientific Ltd</td><td>RRSPSS-A</td><td>涂片染色</td></tr><tr><td>载玻片（Superfrost Plus）</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>涂片制备</td></tr><tr><td>哈里斯苏木精染液</td><td>Bio-optica</td><td>05-06004E</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>过氧化氢溶液</td><td>Sigma</td><td>H1009-500ML</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>皮下注射针头 Microlance 3（23 G）</td><td>Henry Schein</td><td>902-8001</td><td>穿刺抽吸技术</td></tr><tr><td>氯胺酮（IMALGENE 1,000-10 mL）</td><td>Bio 2</td><td>7410928</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>美托咪啶（DOMITOR 10 mL）</td><td>Bio 2</td><td>7418335</td><td>麻醉</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>1.06009.2511</td><td>涂片固定剂</td></tr><tr><td>防扩散笔（Pap pen）</td><td>Merck</td><td>Z377821-1EA</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>无血清蛋白阻断剂</td><td>Dako</td><td>X0909</td><td>免疫细胞化学</td></tr><tr><td>注射器（5 mL，10 mL）</td><td>Henry Schein</td><td>900-3311, 900-3304</td><td>穿刺抽吸技术</td></tr></tbody></table>

通过细针穿刺检测血管外trypanosoma寄生虫

Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration

细针穿刺抽吸（FNA）是一种常规诊断操作，广泛应用于医学和兽医学实践中。该操作通过使用一种类似于常规静脉穿刺所用的细针，经皮穿刺从可触及的肿块、器官或积液（体腔内的液体积聚）中抽取细胞和/或微生物。FNA所获取的样本通常细胞含量丰富，收集到的抽吸物随后被涂片、空气干燥、湿固定、染色，并在显微镜下观察。在临床实践中，FNA是一项重要的诊断工具，可为合适的治疗管理提供指导。由于该方法操作简便、快速、创伤小，且对实验室设备和人力资源的需求有限，因此在兽医临床中被广泛应用，主要应用于家养动物，也用于农场动物。在动物模型研究中，FNA的优势在于可在同一动物个体上重复进行，从而通过在疾病发展过程中多次采集肿瘤及器官/组织中的细胞，实现纵向研究。除常规显微镜检查外，所获取的样本还可用于免疫细胞化学、电子显微镜、生化分析、流式细胞术、分子生物学或体外检测。已有研究利用FNA在感染小鼠的性腺中检测到原虫寄生虫Trypanosoma brucei，这为今后在牛群中开展相关诊断提供了可能。

采用连接5 mL注射器的22 G针头对感染T. brucei的小鼠外部雄性生殖器官进行细针穿刺抽吸（FNA）（图1A-C），并制备涂片用的玻璃载片。该方法操作简便，但获得理想结果依赖于若干关键步骤：通过全身麻醉实现小鼠的完全固定，以及在整个操作过程中保持器官的稳定（图2A-B）。抽吸操作进行2-3次，针头重新定位1-2次，以确保对较小器官和组织（如附睾及附睾脂肪）进行具有代表性的取样。在将针头退出体外前需先释放负压。针管腔内及针座中所含的抽吸物（约20 µL）用于制备2张涂片（图3A-C）。若在未释放负压的情况下拔出针头，则样本会被吸入注射器内而无法回收。该过程对每对器官成功重复两次。涂片干燥后，进行湿固定，并开展针对锥虫表面蛋白的免疫细胞化学染色。
高质量的涂片（图4A-C）表现为细胞呈单层分布且细胞密度良好，宿主细胞形态结构保存完整，能够识别其组织来源及彼此之间的相对比例。寄生虫经免疫染色后清晰可辨，易于识别和计数（图4B）。此外，还展示了一例感染小鼠腹腔积液的细针穿刺样本，经吉姆萨染色后用于直接观察和诊断（图3D-F 和 图4C）。
FNA 结果不佳或呈阴性可能由多种原因导致：（1）涂片上表达的 FNA 样本量过少，不能充分代表原始样本；（2）单张涂片上表达的 FNA 样本量过多，导致涂片过厚，影响细胞学评估；（3）制作涂片时施加压力过大，导致细胞破裂，出现大量裸核和 DNA 拖尾现象（压碎样人工假象）；或（4）制作涂片时施加压力不足，细胞未能充分分散，形成分层堆积，妨碍对细胞形态特征的评估（图 5）。
当我们比较细针穿刺细胞病理学与组织病理学，即细胞分析与组织分析时，前者的优势在于细胞形态保存得更好，细胞的相对比例和计数也更易于评估（图6）。此外，免疫细胞化学比免疫组织化学更简单、快速且易于优化，后者通常在福尔马林固定和石蜡包埋的组织上进行。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td>应用</td>
			<td>优点</td>
			<td>局限性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可触及的肿块</td>
			<td>常规显微镜检查、诊断</td>
			<td>操作简单、快速</td>
			<td>无法获取组织结构信息</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>器官</td>
			<td>免疫组织化学</td>
			<td>成本低</td>
			<td rowspan="4">盲穿抽吸（针头可能切线方向错过靶区；抽吸可能获取坏死、囊性或出血区域）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>积液</td>
			<td>流式细胞术</td>
			<td>可从多个位点取样</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>细胞遗传学</td>
			<td>细胞形态保存良好</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>电子显微镜</td>
			<td>无并发症</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PCR 及其他分子技术</td>
			<td>诊断准确性高</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>生化分析</td>
			<td>麻醉（用于固定）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>体外实验、细胞培养</td>
			<td>非终末性操作</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：细针穿刺的目标、一般应用、优点和局限性。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FNA 试剂盒</td>
			<td>抽吸针与注射器的典型结构</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>抽吸操作：</td>
			<td>针头部件：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 一次性塑料注射器（5 或 10 mL）（图 1B）</td>
			<td>斜面。 针头末端倾斜形成尖端，该倾斜面即为斜面。仅带斜面的针头适用于经皮穿刺抽吸。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. 规格为 22 至 25 G（直径）；长度为 0.75、1.0、1.5 英寸，具有标准斜面针尖边缘的针头（图 1A）</td>
			<td>针管。 针头的中空管状部分，其长度可根据病灶深度进行调整。针头的规格对应其内径，即针管内腔的直径（规格数值越大，针头越细）。使用较大内径的针头（小于 22 G）有助于提高细胞量，但可能导致医源性血液污染增加。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 麻醉（如必要）。FNA 相关的疼痛程度类似于静脉穿刺，但良好的抽吸操作需要受试对象保持充分固定，这一点在小型动物以及小而波动的病灶或器官中尤为重要。接受 FNA 的大鼠和小鼠应适当被动固定，必要时可给予镇静或轻度全身麻醉。</td>
			<td>针座。 针头的塑料部分，用于连接注射器；应为透明材质以便观察抽吸物。FNA 过程中获得的抽吸物应收集在针管内，当观察到抽吸物进入针座时，应立即停止抽吸。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FNA 涂片制备与判读：</td>
			<td>注射器部件：</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 带磨砂端的玻璃显微镜载玻片（图 1C）</td>
			<td>筒体/缸体。 注射器的中空部分。除非处理囊性病灶或积液，抽吸至筒体内的材料通常无法回收。FNA 细胞学检查的理想抽吸体积约为 5 μL，相当于平均填充针管和针座的抽吸物容量。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. 瑞氏型染色剂（如 Diff-Quik、吉姆萨染色）</td>
			<td>接口。 筒体末端用于连接针座的部分。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. 显微镜（明场）</td>
			<td>活塞。 注射器的可移动部分，一端为扁平圆盘或凸缘，另一端为橡胶密封圈。活塞插入筒体内，通过产生负压将细胞或液体吸入针头。一个密封良好的活塞以形成充分的负压，是获得足够抽吸物产量的必要条件。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：细针穿刺所需的设备和耗材。
<img alt="医疗工具图表；针头尺寸 A，注射器容量 B，载玻片堆叠 C，细胞染色 D，显微镜观察结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig01v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：细针穿刺所需的工具及结果。（A）用于细针穿刺（FNA）的理想针头直径为 22 至 25 G。（B）获取良好穿刺物的理想注射器容量为 5 至 10 mL。（C）清洁、干燥、无油脂的载玻片，带有磨砂标记区以便用铅笔书写，并根据需要预先包被（如用于免疫组织化学）。（D）经吉姆萨染色后观察到的锥虫示例（黑箭头），VSG 表面蛋白免疫染色阳性（白箭头），以及透射电子显微镜下的图像（黑块箭头）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig01v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细针穿刺过程示意图，显示注射器从啮齿类动物组织肿块中提取细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig02v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠雄性外生殖器官（睾丸、附睾及附睾脂肪）细针穿刺抽吸（FNA）示意图。（A）固定动物后，拿起预先组装好的穿刺器械。（B-C）将针尖插入目标器官。（D）通过将注射器活塞回拉至1 mL至2 mL刻度处，反复抽吸3-4次以产生负压。在抽吸过程中，也可将针尖在目标组织内前后移动，以收集足够的样本材料。（E）先释放负压，然后再拔出针头。（F）将针头从注射器上取下，（G）向后拉动活塞。（H）重新安装针头。（I）迅速推动活塞，将样本材料喷射到载玻片上。为避免飞溅，应使针尖非常靠近甚至接触载玻片表面。吸取物液滴应置于磨砂标记区边缘约1 cm处。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig02v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色过程示意图；步骤 A-F：准备、加盖玻片、干燥、添加试剂、孵育。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig03v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：涂片制备与染色。（A）用拇指和食指夹住载玻片的一端（磨砂面）。（B）将另一张载玻片（推片）的干净光滑边缘置于标本载玻片上液滴前方。（C）以适中速度向前推动推片一次，形成一层薄膜。（D）让载玻片自然晾干，并用铅笔在磨砂端标记。（E）完全干燥后，用甲醇固定 5 分钟。（F）用 20% 吉姆萨染液染色 30 分钟（或 10% 吉姆萨染液染色 10 分钟）。用清水轻轻冲洗，彻底干燥后浸入二甲苯，再用水不溶性封片剂封片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠感染布氏锥虫的组织学切片 A-C；组织切片显示细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig04v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：小鼠感染后经外部雄性生殖结构细针穿刺抽吸所得涂片的显微照片 T. brucei (A) 优质直接涂片的大体外观：将标本从磨砂边缘（黑点）起约1 cm处开始推片，涂布至距玻片边缘0.5 cm处停止（平行线所示）。B) 对感染第6天采集的雄性小鼠外生殖器细针穿刺抽吸物涂片进行寄生虫表面蛋白（VSG）免疫细胞化学染色。可见大量寄生虫（箭头所示）与小鼠生殖细胞（箭头所示）混合存在。DAB显色，苏木精复染。原始放大倍数：40×（比例尺 = 50 μm). (C) 对感染第21天腹膜渗出液经细针穿刺（FNA）后制备的涂片进行吉姆萨染色，显示大量寄生虫（箭头所示）与宿主（小鼠）细胞混合存在，此处的宿主细胞包括炎性细胞、巨噬细胞（箭头）和淋巴细胞。原始放大倍数：40×（比例尺 = 50 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig04v4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像；组织学染色；组织样本；细胞结构分析；可见比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig05v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：质量差的细针穿刺涂片。（A）细胞含量过少的涂片，未能充分代表肿块或器官的细胞组成。（B）过厚的涂片。（C）挤压假象，表现为细胞破裂、裸核及DNA条纹。（D）细胞聚集体和分层排列的细胞层。DAB复染，苏木精为对比染色剂。原始放大倍数：20x（比例尺 = 100 μm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig05v4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="组织学比较：肝脏和睾丸组织切片，箭头标记的细胞；显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59798/59798fig06v4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6小鼠感染后附睾细胞学与组织学的比较 T. brucei (A) 细针穿刺涂片的显微照片以及 (Ba 4 μm 石蜡切片，相同放大倍数下（20倍原始放大倍数，比例尺 = 100 μm），均对寄生虫表面蛋白（VSG）进行免疫染色。涂片显示大量寄生虫（箭头所示），细胞形态保存良好，与中等数量的生精细胞及少量精子混合存在（箭头）。组织学切片显示组织结构保存良好，由含有管腔内精子的附睾管组成（箭头），并可见大量寄生虫浸润并扩张附睾间质（箭头所示）。DAB显色，苏木精复染。原始放大倍数：20×（比例尺 = 100 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59798/59798fig06v4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

细针穿刺抽吸是一种通过使用细针从病灶或器官中获取细胞的技术。抽吸所得的样本可涂片、染色后在显微镜下检查以用于诊断，或用于分子生物学、细胞计数或体外分析。该方法成本低、操作简便、速度快，且造成的创伤极小。

通过细针穿刺检测血管外Trypanosoma寄生虫

细针穿刺抽吸（Fine Needle Aspiration, FNA）是一种常规诊断操作，广泛应用于临床医学和兽医学实践中。该操作通过经皮穿刺……

细针穿刺细胞学是一种经济、简便、快速且微创的技术，可用于从活体小鼠可触及器官的病灶中采集锥虫。由于细针穿刺为非终末性操作，可在同一动物体内随时间推移进行多次取样。若该发现可应用于牛，此方法将对兽医在农场环境中诊断牛锥虫病具有重要价值。由本实验室的助理技术员 Ana Margarida Santos 演示涂片染色步骤。首先，通过脚趾挤压法确认麻醉效果。当腿部回缩反射消失时，将小鼠置于仰卧位。仔细触诊睾丸，确定其大小以及与表层皮肤的距离，然后用食指和中指或食指与拇指将其固定。为进一步固定目标部位，需将表层皮肤紧绷拉伸，并用酒精棉片清洁表面。接着，将连接于5毫升注射器的23号针头的针尖刺入目标部位，确保注射器活塞处于静止状态。为施加负压，将注射器活塞回抽至3到4毫米刻度处，重复两到三次。为提高获得代表性样本的概率，并更准确地靶向附睾等较小结构，可在器官内沿直线或多个不同切线方向调整针头位置。随后释放负压，拔出针头。只有在松开活塞以释放负压后，才能拔出针头。否则，抽吸物会被吸入注射器内且无法回收。在穿刺部位用无菌纱布按压，以控制可能的出血。将注射器与针头断开，并吸入空气。重新连接针头，将针头尖端非常靠近甚至接触载玻片，然后轻轻将针内液体排至载玻片上。为确保重复取样，每只动物每个器官至少再进行一次额外的抽吸操作。在皮下注射200微升生理盐水配制的每千克1毫克阿替美唑以逆转麻醉后，将动物放回其原饲养笼中进行恢复。用非优势手捏住载玻片的磨砂端，拿起含有抽吸液滴的载玻片。用优势手取一张干净的推片，将其光滑洁净的边缘以约30度的角度置于第二张载玻片上液滴的上方。为获得一层薄膜，用一次轻柔、连续且稳定的动作将载玻片向前推移。放置好载玻片，使样品迅速且完全地通过空气干燥。用铅笔在载玻片的磨砂边缘做好标记。进行吉姆萨染色时，将风干的涂片浸入盛有100%甲醇的考普林瓶中，固定5分钟。随后将玻片转移至含有20%吉姆萨染液和蒸馏水的考普林瓶中，染色30分钟。用自来水冲洗玻片，再用纸巾轻轻吸干，彻底干燥。将载玻片水平持握，向涂片上滴加数滴非水性封片介质。将盖玻片的一边接触载玻片，缓缓放下并轻压，以去除气泡。对于免疫细胞化学实验，将空气干燥的涂片在室温下用100%甲醇固定10分钟。将玻片置于盛有1×PBS的考普林瓶中洗涤5分钟，每次使用新鲜的1×PBS，重复此步骤三次。从考普林瓶中取出玻片后，擦去多余的缓冲液，注意不要触碰涂片区域，并用水排斥笔在涂片周围画一圈。将玻片水平持握，向每个涂片上加入150微升稀释的一抗溶液，在室温下孵育1小时。孵育后，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用 1×PBS 洗涤 5 分钟，重复此步骤 3 次，每次均使用新鲜的 1×PBS。将载玻片水平持握，向每张涂片上加入 150 微升市售的辣根过氧化物酶 DAB 显色系统试剂，室温孵育 30 分钟。再次用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。然后将载玻片浸入盛有 Harris 苏木精液的 Coplin 染色缸中复染 10 秒。用自来水冲洗，再用纸巾轻轻吸干。将载玻片水平持握，向涂片上滴加数滴非水溶性封片介质。将盖玻片的一边轻轻接触载玻片，缓慢放下并轻压，以去除任何气泡。高质量的涂片表现为细胞呈单层分布，密度适宜，形态学特征保存良好，能够识别其组织来源及各类细胞间的相对比例。此外，寄生虫可被有效免疫染色，易于识别和计数。细针穿刺结果不佳或呈阴性，可能是由于取材过少，导致样本不能充分代表病灶或器官的真实情况。也可能由于单张载玻片上的材料过多，造成涂片过厚，从而影响细胞学评估。所谓的压碎伪影，是由于涂片时施加了过大的力量，导致细胞破裂，产生大量裸核和DNA条纹。在涂片制备过程中，若施加的力度不足，细胞无法充分分散，导致形成分层结构，从而妨碍对细胞形态特征的评估。与组织病理学相比，细针穿刺细胞病理学具有细胞形态保存更佳、对细胞相对比例的评估及细胞计数更为准确的优势。免疫细胞化学技术比免疫组织化学更简单、快速，且更易于优化。进行细针抽吸时，务必确保动物固定良好，待抽吸的器官或肿块保持稳定，并协调地施加和释放负压。为制备高质量的涂片，应在将样本置于载玻片上后立即进行推片操作，推片时用力应轻柔，避免细胞压碎产生人为假象。除常规显微镜检查和免疫细胞化学外，该样本还可用于电子显微镜、生化分析、流式细胞术、分子生物学检测，甚至体外实验。该技术使我们能够证明细针穿刺可用于实验动物疾病的诊断与研究。我们成功诊断出锥虫寄生虫对外部雄性生殖器官的趋向性，并能够在感染过程中对该疾病进行表征。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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