从E14-E16斯普拉格·道利大鼠胚胎分离的混合原发希马和皮质神经元生成神经球

这里介绍的是一个协议，用于从高密度镀电神经元中神经祖细胞中富集的神经球的自发生成。在同一实验中，当神经元以较低的密度被镀层时，该协议也会导致长期原发性大鼠神经元培养。

该程序的总体目标是演示从E14-E16 Sprague Dawley大鼠胚胎分离出的混合原生海马和皮质神经元中神经球的发展，以便为研究各种神经治疗引线的影响提供一个稳健且低成本的平台。如您了解，大脑是一个复杂的神经元网络，与大量的支持细胞相关。为了理解大脑功能，大多数研究通常是从体外实验中重新发起的，其中涉及商业上可用的神经谱系衍生细胞系。

然而，这种细胞系是转化的细胞系，它们患有基因和表型变异。要解决这个问题，初级神经元培养是合适的方法。在这里，我们演示了一个简单且经济高效的培养初级神经元的协议，并构建了一个强大的筛选平台，用于各种神经治疗。

该协议的主要优点是，只要调节细胞电镀密度，我们就可以展示两个对比鲜明的神经元培养平台，其中低密度导致长时间的原发神经元培养，而高密度产生自发的神经球。拿两个24孔板。一个用于高密度，另一个用于低密度电镀。

在 24 孔板中转移 12 mm 的无菌玻璃盖玻片。将 300 微升的 PDL 溶液倒入每个孔中，使其完全覆盖整个盖玻片的表面。在去压水中以0.1毫克/mL的浓度准备PDL溶液。

用铝箔包裹板，防止干燥，并将其放在 CO2 培养箱中过夜。第二天，在电镀之前，先吸进 PDL 解决方案。用无菌水正确清洗两到三次。

然后添加电镀介质，并将板返回到培养箱，直到电镀。牺牲一只E14-E16正时怀孕的Sprague-Dawley大鼠，用无菌钳子和一双钝端剪刀在腹部区域做一个V形切口。取出所有胎儿，用冷的HSS溶液小心地将它们放在培养盘上。

将胚胎从胚胎囊中拿出来，在新鲜、寒冷的HBVS中，在单独的培养皿中仔细清洗。用无菌剪刀斩首头部。用冷 HBSS 转移无菌 90 mm 培养板中的头。

在立体显微镜下，用无菌锯齿钳将头部从鼻子区域握住，然后通过切开皮肤和头骨来将大脑切开。通过持有脑干，从半球和中脑中去除所有的脑筋。小心地去除完整的半球，类似于包含海马和皮层的蘑菇帽。

在含有10 mL分离介质的15 mL锥形管中收集含有皮层和完整海马的半球。让收集的组织安定下来，吸气分离介质，留下百分之五到百分之十的介质。再次，添加 10 mL 的新鲜分离介质，并重复此步骤两次。

添加 4.5 mL 分离介质和 0.5 mL 的 trypsin-EDTA 溶液。在37摄氏度的培养箱中保持20分钟，以便进行消化。连续吸气介质，用10 mL的分离介质和电镀介质进行洗涤。

在2.5 mL的电镀介质中重新暂停。将 90 mm 无菌盘放在盘子的倒置盖上，倒入 90 mm 无菌盘的底座中。使用1000微升移液器尖端将消化的组织放在菜的角底，以占用最少的体积。

通过70微米细胞过滤器，通过获得的细胞悬浮液，不包括任何组织块。使用 trypan 蓝色染料排除确定可行细胞的密度，并计算自动细胞计数器中的细胞数。将获得的电池数量稀释，使1.5至10的功率为每mL5个细胞，用于高密度电镀，将每mL20，000个细胞用于在含有30 mL电镀介质的两个独立管中进行低密度电镀。

吸气先前添加的电镀介质和板500微升的细胞分散在每一个井的电镀介质。之后，将盘子返回孵化器四小时。电镀后四小时，检查细胞在显微镜下粘附。

经过四个小时的电镀后，在高密度和低密度板中，神经元表现出良好的粘附性。用500微升的新鲜维护介质代替每井的培养剂，并在37摄氏度的培养箱中孵化。我们必须培养这些在高密度和低密度下镀的神经元。

虽然低密度镀层神经元可用于长期培养，长达30天，通过改变维持介质每周两次，高密度镀层神经元开始自发产生神经球，这一天后，我们保持在超低附着板。经过24小时的电镀后，观察到高密度和低密度镀层神经元都表现出健康的形态。此处显示低密度镀层神经元的相位对比度图像，培养约七天。

神经元显示健康的形态，可以保持长达30天与更有力的路由和互连。这里的条形图显示了低密度镀层神经元的大约 90% 的生存能力，即使经过 30 天的培养，由 MTT 测定确定。这里的初级神经元的特点是免疫，用Tuj 1，分化神经元的标记，和tau，神经元轴突的标记。

非神经元标记GFAP中无染色证实神经元的纯度，而84中对利戈多细胞没有染色。在所有表征研究中，核都沾染了霍赫斯特33258。在这里，低密度种子细胞已经染色的天体细胞标记GFAP和神经元标记Tuj 1，以检查培养物的纯度长达7天。

据观察，该协议支持神经元比星细胞的优待生长，通过定量分析表明。核已经沾染了霍赫斯特 33258 。同样，在高密度种子细胞中，星细胞被Tuj 1染色与GFAP和神经元。

在这里，在定量分析中，观察到约17%的星细胞，而83%的神经元。核已经沾满了霍赫斯特 33258 。七天后，在高密度神经元中自发形成多个神经球。

在培养的第八天到第十天左右，在高密度镀层神经元中，神经球开始形成由径向胶质线延伸组成的大投影和桥梁。黑色箭头表示两个新形成的神经球之间的桥梁。活细胞和死细胞测定在神经球上进行了15天。

在密集的钙素 AM 染色中，绝对没有碘化染色，表明神经球在培养中几乎 100% 的生存能力。这里的线图表示神经球大小的扩展，天数的流逝。这种过度染色的神经球图像表明，通过NPC标记内丁和Tuj 1的表达增加，神经祖细胞的丰富种群。

这里的神经球显示大量的星形细胞，以GFAP的强烈表达为标志，伴随着神经元标记Tuj 1的更高表达。核已经沾满了霍赫斯特 33258 。因此，我认为我们的协议是相当令人兴奋和有趣的，考虑到一个事实，即从一个单一的策略，我们能够得到两个平台:一个二D和一个3-D。

这将是一个很好的平台，筛选不同的神经治疗轨道。所以我想它真的对所有神经科学家都很有用。另一个重要方面是，我们选择的神经球是非常丰富的神经祖细胞，NPC。

它们可以用来将它们区分成神经元和非神经元血统。所以，我觉得如果，真的，人们可以掌握这个技术，从这个视频的帮助，这将是真正有用的每个人。谢谢。