从E14-E16天Sprague Dawley大鼠胚胎分离的原代海马和皮层神经元混合培养中生成神经球

本实验的总体目标是展示如何从 E14-E16 期 Sprague Dawley 大鼠胚胎中分离的混合原代海马和皮层神经元培养生成神经球，从而为研究各种神经治疗候选药物的作用提供一个稳健且低成本的平台。众所周知，大脑是由神经元与大量支持细胞相互连接构成的复杂网络。为了理解大脑功能，大多数研究通常需从体外实验重新开始，而这些实验通常依赖于商业化的神经谱系来源的细胞系。

然而，这些细胞系属于转化细胞系，存在基因型和表型变异的问题。为解决这些问题，原代神经元培养是较为合适的方法。本文介绍了一种简单且经济高效的原代神经元培养方案，并建立了用于多种神经治疗药物筛选的稳定平台。

本方案的主要优势在于，仅通过调节细胞接种密度，即可展示两种截然不同的神经元培养平台：低密度接种可实现原代神经元的长期培养，而高密度接种则可自发形成神经球。取两个24孔板，一个用于高密度接种，另一个用于低密度接种。

将12 mm的无菌玻璃盖玻片放入24孔板中。每孔加入300 µL多聚赖氨酸（PDL）溶液，确保溶液完全覆盖整个盖玻片表面。用去离子水配制浓度为0.1 mg/mL的PDL溶液。

用铝箔包裹培养板以防止干燥，并在CO2培养箱中过夜孵育。次日，在接种细胞前，吸除PDL溶液，用无菌水彻底清洗两到三次。

然后加入铺板培养基，将培养板放回培养箱中直至铺板。处死一只经定时怀孕的E14-E16天的Sprague-Dawley大鼠，使用无菌镊子和一把钝头剪刀在腹部区域做V形切口。取出所有胎鼠，并将其小心放置于含有冷HBSS溶液的培养皿中。

从胚胎囊中取出胚胎，于另一培养皿中用新鲜的冷HBSS小心清洗。使用无菌剪刀去除头部。将头部转移至含有冷HBSS的无菌90 mm培养皿中。

在体视显微镜下，用无菌锯齿镊夹住小鼠吻部固定头部，剪开皮肤和颅骨取出脑组织。夹住脑干，去除大脑半球和中脑上的所有脑膜。小心分离出完整的脑半球，其形状类似蘑菇盖，包含海马和大脑皮层。

将含有皮层和完整海马的脑半球收集到含有10 mL解离培养基的15 mL锥形管中。让收集的组织自然沉降，吸除解离培养基，保留5%至10%的培养基。再次加入10 mL新鲜解离培养基，重复此步骤两次。

加入4.5 mL解离培养基和0.5 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。置于37°C培养箱中孵育20分钟，以进行消化。随后吸除培养基，并依次用10 mL解离培养基和铺板培养基洗涤。

用2.5 mL铺板培养基重悬细胞。将一个90 mm无菌培养皿倒扣在另一个90 mm无菌培养皿的底部上方，将细胞悬液倒入底部培养皿中。使用1000微升移液器枪头，在培养皿底部的一角滴加消化后的组织，使其占据最小体积。

将获得的细胞悬液通过70微米细胞滤筛，以去除任何组织碎片。使用台盼蓝染色排除法测定活细胞密度，并用自动细胞计数仪计数细胞数量。将所获得的细胞按以下方式稀释：在两个分别含有30 mL铺板培养基的试管中，高密度铺板为每毫升1.5 × 10⁵个细胞，低密度铺板为每毫升20,000个细胞。

吸弃先前加入的铺板培养基，每孔加入500微升用铺板培养基重悬的细胞。随后将培养板放回培养箱中孵育4小时。铺板后4小时，在显微镜下观察细胞贴壁情况。

接种四小时后，高密度和低密度培养板中的神经元均表现出良好的贴壁状态。将每孔中的培养基更换为500微升新鲜的维持培养基，并在37摄氏度的培养箱中继续培养。我们需要对这些高密度和低密度接种的神经元进行培养。

尽管低密度接种的神经元通过每周更换两次维持培养基可进行长达30天的长期培养，但高密度接种的神经元在接种后维持于超低吸附培养板中，数天后即开始自发形成神经球。接种24小时后，可观察到高密度和低密度接种的神经元均呈现健康的形态。此处展示的是培养约七天的低密度接种神经元的相差显微图像。

神经元表现出健康的形态，经过更活跃的轴突生长和相互连接，可维持长达30天。此处的柱状图显示，即使在培养30天后，低密度接种的神经元存活率仍约为90%，该结果由MTT法测定。这些原代神经元通过免疫荧光染色进行了表征，所用标记物包括Tuj 1（分化神经元的标志物）和tau（神经元轴突的标志物）。

通过检测星形胶质细胞的非神经元标志物 GFAP 和少突胶质细胞的 O4 均无染色，证实了神经元的纯度。在所有表征研究中，细胞核均使用 Hoechst 33258 进行染色。此处，低密度接种的细胞使用星形胶质细胞标志物 GFAP 和神经元标志物 Tuj 1 进行染色，以检测培养物在长达七天内的纯度。

通过定量分析可以观察到，该方案支持神经元相对于星形胶质细胞的优先生长。细胞核已用 Hoechst 33258 染色。同样，在高密度接种的细胞中，星形胶质细胞用 GFAP 染色，神经元用 Tuj 1 染色。

在此定量分析中，星形胶质细胞约占17%，而神经元占83%。细胞核经Hoechst 33258染色。七天后，可在高密度神经元中观察到自发形成的多个神经球。

培养约第8至第10天，在高密度接种的神经元中，神经球开始形成由放射状胶质样突起构成的大型突起和桥状结构。黑色箭头指示两个新形成的神经球之间的桥状连接。已对神经球进行长达15天的活细胞与死细胞检测。

密集的Calcein AM染色且完全无碘化丙啶染色，表明培养中的神经球存活率接近100%。此处的折线图显示，随着培养天数的增加，神经球的体积逐渐增大。该神经球的过染图像表明，神经前体细胞数量丰富，表现为神经前体细胞标志物Nestin和Tuj 1的表达显著增强。

此处的神经球显示出大量表达 GFAP 的星形胶质细胞，同时伴有更高水平的神经元标志物 Tuj 1 的表达。细胞核已用 Hoechst 33258 染色。因此，考虑到仅通过一种策略即可获得两种平台——一种二维平台和一种三维平台——我认为我们的实验方案非常令人兴奋且具有重要意义。

这将成为筛选不同神经治疗途径的一个极佳平台。因此，我认为它对所有神经科学家都具有非常非常重要的价值。另一个重要方面是，我们选用的神经球含有极为丰富的神经前体细胞（NPCs）。

并且可以利用它们分化为神经元和非神经元谱系。因此，我认为如果人们能够通过观看本视频掌握这项技术，将对每个人都非常非常有帮助。谢谢。