链球菌中高分子质量蛋白的纯化

这里描述的是一个简单的方法，用于纯化链球菌中的基因产物。该技术在蛋白质，特别是膜蛋白和高分子质量蛋白的纯化方面可能有利，可用于其他各种细菌物种。

这种方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如，在E.Coli中难以表达的基因产品如何净化。该技术的主要优点是，除了PCR，没有酶反应是载体，可用于蛋白质纯化的常见应用。虽然这种方法可以提供对链球菌突变体中蛋白质纯化的见解，但它也可以是其他微生物物种的一种信息。

演示这个程序的将是山下博士，一个来自我们实验室的研究生。在从链球菌突变体中提取底像设计和基因组DNA提取后，使用野生型链球菌和GFC破坏链球菌突变体基因组作为PCR模板执行第一个PCR。使用准备好的 gtfC 前进和反向底因和 spc r 转发和反向底因放大含有 gtfC 基因下游部分的区域和那些含有物种霉素抗性基因的区域。

然后，电泳每个PCR产品在1%的阿加罗斯凝胶。使用凝胶频化器将所需的DNA片段从凝胶中切入约1000个碱基对和2000个碱基对，切入微离心管。在每个管中加入500微升的溶解缓冲液，并在56摄氏度下孵育10分钟，溶解凝胶片。

使用硅膜基凝胶提取法净化碎片。使用第一个 PCR 的产品作为 PCR 模板使用嵌套前进和嵌套反向底像执行第二个 PCR。当第二个 PCR 产品无法通过电泳进行确认时，应设计另一个嵌套底像对。

电泳中五微升的PCR混合物在阿加罗斯凝胶上。确认通过溴化乙基凝胶染色图像生成约3，000个碱基对的适当安培，然后根据手稿进行。现在，将浓缩第二PCR产品的5微升混合到50微升的冰冷、称职的野生链球菌突变细胞中，以前冷冻过。

将混合物加入电穿孔盒中，并将蛋黄酱放入电穿孔装置的保素室。给细胞一个1.8千伏、600欧姆和10微法拉的电脉冲，2.5毫秒。将500微升的脑心输液汤加入到库子中。

立即将悬浮液的10至100微升扩散到含有斑点霉素的脑心输液螺旋板上。在37摄氏度下孵育板，直到菌落生长到足以被拾起。根据手稿，在产生链球菌突变多石丁编码序列后，结合菌株和夜间接种无斑点霉素，在4摄氏度的10000倍g下将细菌培养悬浮液分离20分钟。

将文化上一层酒转移到三升玻璃烧杯中。要浓缩培养物上清液中的蛋白质，请将两升上清液放在磁搅拌器上，然后开始剧烈搅拌。加入1，122克硫酸铵，让沉淀物在4小时或夜间在4摄氏度下剧烈搅拌。下一个。

将硫酸铵沉淀溶液在15，000倍g下离心，在4摄氏度下20分钟。去位。用铲子，收集沉淀物，并转移到200毫升的玻璃烧杯。

将颗粒重新在 35 毫升的结合缓冲液中。然后，将悬浮液的每个约25毫升转移到再生的纤维素透析管中。将透析管放入 2.5 升搅拌器上的搅拌器中，在 4 摄氏度下进行回旋，以将悬浮液进行透析。

两小时后更换透析溶液，并通宵继续透析。接下来，将管材中的透析悬浮液转移到离心管，并在4摄氏度下以2万次g将管以2万次g放置，10分钟。使用分部过滤设备，将上清液倒入 0.2 微米膜过滤器进行过滤。

将滤金物转移到 75 毫升的烧瓶中。要将多石丁标记的 gtfSI 从过滤的悬架中分馏，请先准备固定金属亲和力色谱。根据手稿平衡树脂后，关闭霍夫曼捏公鸡。

将过滤的悬浮液的五毫升加入柱中，以制造泥浆。然后，将所有浆料转移到剩余的过滤悬浮液中，并在4摄氏度下轻轻旋转混合物30分钟。将混合物重新加载到列中。

打开霍夫曼捏公鸡，以去除重力流的悬架。用20毫升的结合缓冲液清洗IMAC树脂，然后洗洗20毫升的洗脱缓冲液，以获得重组的gtfSI。之后，将埃卢酸盐装入离心超滤管中，将溶液以2000倍g离心，1至5分钟，使溶液浓缩。

清空滤液容器，并将 15 毫升的存储缓冲液添加到管中。再次离心样品，再重复两次。重组 gtfSI 溶液最终浓缩到大约 1 毫升。

将浓缩物转移到微离心管中，并在摄氏四度时储存。继续执行其余功能恢复协议。在此协议中，agarose凝胶电泳显示，来自第一PCR和第二PCR的每个安培量的大小与预测尺寸相对应。

链球菌突变菌落被第二个PCR产品转化，并镀在含有斑点霉素的脑心输液螺旋板上。在阿加罗斯凝胶上运行的殖民地PCR产品表明，每个安培量都具有预测尺寸。SDS-PAGE 将用固定金属亲和力色谱纯化的蛋白质作为单一波段进行观察。

使用抗多晶石丁抗体进行的西方印迹证实，观测带是预期的160千吨多石丁标记蛋白。蔗糖衍生的生物膜形成能力只见链球菌突变野生型和链球菌突变体 His-gtfC，在管壁上形成附着生物膜，存在1%蔗糖。这在链球菌三角洲gtfC中未观察到。

然而，25微克的重组gtfSI的加入恢复了链球菌三角洲gthFC的粘附生物膜形成能力。由于此方法的成功取决于第二次 PCR 扩增，因此第二个 PCR 产品必须通过电泳进行确认。这种方法获得的组蛋白类型蛋白也与功能性酸（如蛋白质-蛋白质相互作用）有关。

该技术在发展之后，结合基因破坏，为微生物学领域的研究人员探索基因功能铺平了道路。