使用超低输入量载体CAGE进行转录起始位点定位

该方法有助于回答基因调控领域中的关键问题，因为它能够利用起始材料的极低用量来发现核心启动子和增强子。该技术的主要优势在于，仅需10纳克总RNA即可实现对RNA聚合酶II转录起始位点的无偏倚、全基因组范围、单核苷酸分辨率的定位分析。CAGE技术正被证明在揭示与疾病相关的转录起始位点方面具有重要价值，这些位点可用作诊断标志物。

SLIC-CAGE 将这些发现拓展至组织活检等样本量较小的研究。SLIC-CAGE 非常适用于对脆弱细胞类型进行深入且高分辨率的启动子分析，包括多种模式生物的早期胚胎发育阶段或胚胎组织。由于本实验方案包含多个步骤，因此在各步骤间转移样本时，务必尽可能回收全部材料，以最大限度地减少样本损失。

首先为每个模板制备PCR反应体系。根据论文中的说明，将缓冲液、dNTPs、特异性正向引物、含有合成载体基因的模板质粒以及融合聚合酶混合。通过移液操作混匀各试剂。

向每份10微升的反转录引物中加入90微升PCR混合液，并充分混匀。热循环条件请参见原文。对目标RNA进行反转录（RT）反应。

在总体积为10微升的反应体系中，加入1微升逆转录引物、10纳克RNA和4,990纳克载体混合物。通过移液器吹打混匀。将混合物在65摄氏度加热5分钟，然后立即置于冰上。

根据说明书配制反转录（RT）反应体系，将28微升反应体系加入10微升RNA中。用移液器吹打混匀管内液体。在PCR仪中进行反转录反应。

逆转录完成后，使用无DNase和RNase的SPRI磁珠纯化产物。按1.8:1的体积比将磁珠加入逆转录反应体系中，通过移液充分混匀。室温静置5分钟。

然后将磁珠置于磁力架上，静置5分钟使其分离。弃去上清液，并向磁珠中加入200 µL新配制的70%乙醇。不要混匀磁珠，也不要将磁珠从磁力架上取下，加完乙醇后应立即移除乙醇。

将离心管置于磁力架上，用P10移液器推出残留的液滴，彻底去除乙醇痕迹。立即加入42 µL水，上下吹打60次以洗脱样品，注意避免产生气泡。将离心管在37 °C下孵育5分钟（不加盖），然后将磁珠置于磁力架上分离。

然后，将上清液转移至一组新的离心管中，注意完全回收上清液，但避免磁珠的转移。RNase I 处理后，将 45 µL 样品与 105 µL 预先制备的链霉亲和素磁珠混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育期间，每 10 分钟用移液器吹打混匀一次样品。

然后，将磁珠置于磁力架上分离，并移除上清液。依次用缓冲液A、缓冲液B和缓冲液C洗涤磁珠。首先加入缓冲液A，将磁珠重悬于150 µL缓冲液中。在磁力架上分离2至3分钟，然后移除上清液。

将缓冲液 B 和 C 预热至 37 摄氏度，并重复洗涤步骤。为去除所有未加帽的 RNA，必须彻底洗涤链霉亲和素磁珠和管壁，并在加入下一种洗涤缓冲液之前完全去除上一步的洗涤缓冲液。为释放 cDNA，将磁珠重悬于 35 µL 1X RNase I 缓冲液中，在 95 摄氏度孵育 5 分钟。

孵育后立即将珠子置于冰上两分钟。将珠子置于磁力架上分离，然后将上清液转移至一组新离心管中。用30 µL 1× RNase I缓冲液重悬珠子，再置于磁力架上分离。

将上清液与先前收集的上清液合并，总体积约为65微升。进行qPCR以确定目标文库扩增的PCR循环数。配制qPCR主混合液，用于扩增来自载体的完整DNA文库。

根据文稿说明设置热循环条件，并扩增已制备的样品。SLIC-CAGE 实验方案可从纳克级起始 RNA 材料中获得适用于测序的文库。最终文库中的片段长度范围为 200 至 2,000 个碱基对。

较短的片段是PCR产物中的人工产物，可能会在后续测序过程中引发问题。可进行额外的片段大小筛选步骤以去除这些片段。与NanoCAGE相比，SLIC-CAGE在转录起始位点鉴定方面表现出显著更优的性能，这一点在对不同量的酿酒酵母（S.cerevisiae）总RNA进行两种技术的受试者工作特征曲线分析中得以体现。

在执行本实验方案时，需注意样本损失可能导致文库复杂度降低。为防止此情况，必须使用低吸附的移液器吸头和离心管。此前，若无SLIC-CAGE技术，各类细胞类型的启动子分析均无法实现。

这包括对多种模式生物的胚胎发育阶段或胚胎组织进行分析。