Name: 使用超低输入载波保持架进行转录启动站点映射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 了解SLIC-CAGE技术用于基因调控研究中的转录起始位点高分辨率定位。该方法仅需10纳克总RNA即可生成测序文库，适用于微量组织活检和脆弱细胞类型的启动子分析。

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本工作获得了惠康基金会（The Wellcome Trust）资助（106954）以及医学研究理事会（MRC）核心资助（MC-A652-5QA10）的支持，授予 B. L.。N. C. 获得了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金（EMBO ALTF 1279-2016）的支持；E. P. 获得了英国医学研究理事会的支持；B. L. 获得了英国医学研究理事会（MC UP 1102/1）的支持。

<ol><li>Shiraki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+analysis+gene+expression+for+high-throughput+analysis+of+transcriptional+starting+point+and+identification+of+promoter+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15776-15781 (2003).</li>
<li>Haberle, V., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+architectures+and+developmental+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Promoter architectures and developmental gene regulation.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 57, 11-23 (2016).</li>
<li>Haberle, V., Stark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+core+promoters+and+the+functional+basis+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (10), 621-637 (2018).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Celniker, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+secrets+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unlocking the secrets of the genome.</a> Nature. 459 (7249), 927-930 (2009).</li>
<li>Consortium, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+promoter-level+mammalian+expression+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A promoter-level mammalian expression atlas.</a> Nature. 507 (7493), 462-470 (2014).</li>
<li>Boyd, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+enhancer+and+promoter+landscape+of+inflammatory+bowel+disease+from+human+colon+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterization of the enhancer and promoter landscape of inflammatory bowel disease from human colon biopsies.</a> Nature Communications. 9 (1), 1661(2018).</li>
<li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+comparative+analysis+of+5%27-end+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive comparative analysis of 5'-end RNA-sequencing methods.</a> Nature Methods. , (2018).</li>
<li>Cvetesic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLIC-CAGE%3A+high-resolution+transcription+start+site+mapping+using+nanogram-levels+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">SLIC-CAGE: high-resolution transcription start site mapping using nanogram-levels of total RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1943-1956 (2018).</li>
<li>Murata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+expressed+genes+using+CAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting expressed genes using CAGE.</a> Methods in Molecular Biology. 1164, 67-85 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9, 357(2012).</li>
<li>R Core Team. A language and environment for statistical computing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.R-project.org/">https://www.R-project.org/</a> (2017).</li>
<li>Haberle, V., Forrest, A. R., Hayashizaki, Y., Carninci, P., Lenhard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAGEr%3A+precise+TSS+data+retrieval+and+high-resolution+promoterome+mining+for+integrative+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CAGEr: precise TSS data retrieval and high-resolution promoterome mining for integrative analyses.</a> Nucleic Acids Research. 43 (8), e51(2015).</li>
<li>Poulain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoCAGE%3A+A+Method+for+the+Analysis+of+Coding+and+Noncoding+5%27-Capped+Transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoCAGE: A Method for the Analysis of Coding and Noncoding 5'-Capped Transcriptomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1543, 57-109 (2017).</li>
<li>Schon, M. A., Kellner, M. J., Plotnikova, A., Hofmann, F., Nodine, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoPARE%3A+parallel+analysis+of+RNA+5%27+ends+from+low-input+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">NanoPARE: parallel analysis of RNA 5' ends from low-input RNA.</a> Genome Research. 28 (12), 1931-1942 (2018).</li>
</ol>

一种可降解的载体RNA/DNA专利已提交。

为了成功制备SLIC-CAGE文库，必须使用低吸附性枪头和离心管，以防止样品因吸附而损失。在涉及上清液回收的所有步骤中，建议完全回收全部样品体积。由于本实验流程包含多个步骤，持续的样品损失将导致文库构建失败。
如果尚未常规进行CAGE（nAnT-iCAGE），最好使用同一总RNA样本的不同上样量（10 ng、20 ng、50 ng、100 ng、200 ng）测试SLIC-CAGE，并与使用5 µg总RNA制备的nAnT-iCAGE文库进行比较。如果nAnT-iCAGE文库构建失败（每样本获得的DNA文库少于0.5–1 ng），则SLIC-CAGE很可能也无法成功，此时需要尽量减少样本损失。
确保获得高质量文库（不含未加帽的降解RNA或rRNA）的关键步骤是第7节中所述的加帽捕获（cap-trapping）。必须充分重悬链霉亲和素磁珠于洗涤缓冲液中，并在进入下一步洗涤或cDNA洗脱之前彻底去除洗涤缓冲液，这一点至关重要。
如果第一轮载体降解后的qPCR结果表明使用adaptor_f1和carrier_f1引物之间无差异，仍建议继续本实验方案。如果第二轮载体降解后，Ct值差异小于5，则建议进行第三轮载体降解。我们从未发现需要进行第三轮降解；若出现此情况，建议更换归巢内切酶的储存液。
如果最终获得的文库量不足以进行测序，可在本方案中增加额外的PCR扩增轮次。此时应设置尽可能少的扩增循环数，以获得足够测序用量的产物，同时需考虑到片段大小筛选过程中不可避免的样品损失。随后应使用SPRI磁珠进行纯化或片段大小筛选，直至所有小片段（&#60;200 bp）均被去除（如有需要，可采用0.6:1的磁珠与样品比例），并使用Picogreen对文库进行定量。
文库可采用单端或双端测序模式进行测序。使用双端测序可获得有关转录本异构体的信息。此外，由于反转录使用随机引物（TCT-N6，其中N6为随机六聚体）进行，因此测序得到的3’端信息可作为唯一的分子标识符（UMI），用于合并PCR重复序列。由于仅使用中等数量的PCR扩增循环（最多18个循环），先前研究发现使用UMI&#160;通常是不必要的。
由于该方案的核心依赖于 nAnT-iCAGE11，SLIC-CAGE 使用了八个条形码。因此，目前不支持对超过八个样本进行多重检测。此外，SLIC-CAGE 和 nAnT-iCAGE 均不适合捕获短于 200 bp 的 RNA，因为这些方案通过 AMPure XP 磁珠的尺寸排阻来去除接头序列和 PCR 产物，从而导致短片段丢失。
SLIC-CAGE 是目前唯一一种无偏倚、低输入量且具有单核苷酸分辨率的方法，可用于利用数纳克总RNA材料绘制转录起始位点。其他替代方法依赖于逆转录酶的模板转换活性来对带帽RNA进行条形码标记，而非采用加帽捕获技术（例如 NanoCAGE15 和 NanoPARE16）。由于存在模板转换现象，这些方法在转录起始位点（TSSs）检测中表现出序列特异性偏差，导致假阳性TSS数量增加，而真实TSS数量减少9,10。

基因表达的末端分析（Cap analysis of gene expression, CAGE）是一种用于在全基因组范围内以单核苷酸分辨率定位RNA聚合酶II转录起始位点（transcription start sites, TSSs）的方法1。其定量特性还支持以转录本5’端为中心的表达谱分析。TSSs周围区域（约起始位点上下游各40 bp）为核心启动子区，代表RNA聚合酶II和通用转录因子结合的物理位置（此前已有综述2,3）。精确的TSS位置信息可用于核心启动子的识别以及启动子动态变化的监测。此外，由于活跃的增强子表现出双向转录特征，CAGE数据也可用于增强子的发现及其动态变化的监测4。近年来，CAGE技术因其广泛的应用性以及在ENCODE5、modENCODE6和FANTOM项目7等高影响力研究计划中的应用而日益受到关注。此外，TSS信息在区分健康组织与病变组织方面也显示出重要价值，因为疾病特异性的TSS可作为诊断标志物使用8。
尽管目前已存在多种TSS定位方法（CAGE、RAMPAGE、STRT、nanoCAGE、nanoCAGE-XL、oligo-capping），但我们及其他研究者近期已证明，CAGE是捕获真实TSS、且假阳性数量最少的最无偏倚方法9,10。最近开发的CAGE实验流程nAnT-iCAGE11是目前TSS分析中最无偏倚的方案，因为它避免了使用限制性内切酶将片段切割为短标签，并且不依赖PCR扩增。然而，nAnT-iCAGE方案的一个局限性在于需要大量的起始材料（例如，每个样本需5 µg&#160;总RNA）。在回答某些具有重要生物学意义的问题时，往往难以获得如此大量的起始材料（例如，经FACS分选的细胞或早期胚胎阶段）。最后，即使nAnT-iCAGE实验成功，每个样本也仅能获得1–2 ng的DNA文库材料，从而限制了可实现的测序深度。
为实现仅使用纳克级总RNA进行转录起始位点（TSS）分析，我们近期开发了超低输入载体CAGE（Super-low Input Carrier-CAGE）10 SLIC-CAGE， 图1）。SLIC-CAGE 仅需 10 ng 总 RNA 即可获得高复杂度的文库。本方案依赖于精心设计的合成 RNA 载体，将其添加至目标 RNA 中，使 RNA 总量达到 5 μg。该合成载体在长度分布上模拟目标 DNA 文库，以避免过量均质分子可能引起的潜在偏差。载体序列基于 大肠杆菌 亮氨酰-tRNA合成酶基因（表1）出于两个原因。第一，载体在最终文库中的任何残留，即使被测序，也不会比对到真核生物基因组上。第二，由于 E. coli 是一种嗜温物种，其看家基因已优化为适合SLIC-CAGE的温度范围。载体序列中还嵌入了归巢内切酶识别位点，以实现对来源于载体RNA分子的DNA的特异性降解。目标样本来源的文库则保持完整，因为归巢内切酶识别位点较长（I-CeuI = 27 bp；I-SceI = 18 bp），在真核生物基因组中出现的概率极低。在对载体进行特异性降解并通过排阻大小去除片段后，目标文库经PCR扩增即可用于下一代测序。根据起始RNA量（1–100 ng），预计需要进行13–18个PCR扩增循环。每个样本最终获得的DNA量为5–50 ng，足以支持深度测序。当仅使用1–2 ng总RNA时，仍可检测到真实的转录起始位点（TSSs）；然而，所构建的文库复杂度预计较低。最后，由于SLIC-CAGE基于nAnT-iCAGE实验流程11可实现在测序前对多达八个样本进行多重检测。

<table><tbody><tr><td>2-丙醇，Bioultra，分子生物学用，&amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59304-100ML-F</td><td>用于 RNAclean XP 纯化。</td></tr><tr><td>3' 连接子</td><td></td><td></td><td>序列见 Murata 等人 2014 年文献及本文手稿的补充表 1。3' 连接子的链退火方法见本实验方案的补充材料。</td></tr><tr><td>5' 连接子</td><td></td><td></td><td>序列见 Murata 等人 2014 年文献及本文手稿的补充表 1。5' 连接子的链退火方法见本实验方案的补充材料。</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP，60 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>用于 DNA 纯化</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP 试剂盒</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>用于 CAGE 步骤中 RNA 及 RNA:cDNA 杂交体的纯化。</td></tr><tr><td>Axygen 0.2 mL 聚丙烯 PCR 管条和圆顶盖管条</td><td>Axygen（可通过 Corning 购得）</td><td>PCR-0208-CP-C</td><td>或任何 8 管 PCR 管条（仅用于水和混合液）。</td></tr><tr><td>Axygen 1 x 8 管圆顶 PCR 盖</td><td>Axygen（可通过 Corning 购得）</td><td>PCR-02CP-C</td><td>PCR 板用盖。</td></tr><tr><td>Axygen 1.5 mL Maxymum Recovery Snaplock 微量离心管</td><td>Axygen（可通过 Corning 购得）</td><td>MCT-150-L-C</td><td>低吸附 1.5 mL 管，用于酶混合液或样品浓缩。</td></tr><tr><td>Axygen 96 孔无裙边 PCR 微孔板</td><td>Axygen（可通过 Corning 购得）</td><td>PCR-96-C</td><td>低吸附 PCR 板——必须用于本实验方案的所有步骤。注意，板应裁剪为每块含 2 x 8 孔，以便更清晰地观察样品。</td></tr><tr><td>Bioanalyzer（或 Tapestation）：RNA nano 和 HS DNA 试剂盒</td><td>Agilent</td><td></td><td>用于评估 RNA 质量、有效片段筛选及文库最终质量（也可使用 Tapestation）。</td></tr><tr><td>生物素（长臂）酰肼</td><td>Vector laboratories</td><td>SP-1100</td><td>生物素标记/标记</td></tr><tr><td>Cutsmart 缓冲液</td><td>NEB</td><td></td><td>限制性内切酶缓冲液</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0259S</td><td>第二链合成</td></tr><tr><td>DNA 连接试剂盒，Mighty Mix</td><td>Takara</td><td>6023</td><td>用于 5' 和 3'-连接子连接</td></tr><tr><td>dNTP 混合液（每种 10 mM）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427013</td><td>用于载体模板制备的 dNTP 混合液（或任何适用于 PCR 的 dNTP）。</td></tr><tr><td>Dynabeads M-270 链霉亲和素磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65305</td><td>帽捕获。请勿使用其他磁珠，因本实验所用缓冲液已针对此磁珠优化。</td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>用于 1.5 mL 管的磁力架——用于制备链霉亲和素磁珠。</td></tr><tr><td>DynaMag-96 侧裙磁力架</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12027</td><td>用于 PCR 板（96 孔板）的磁力架——与裁剪为 2 x 8 孔的板配合使用。</td></tr><tr><td>乙醇，BioUltra，分子生物学用，&amp;ge;99.8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51976-500ML-F</td><td>用于 AMPure 洗涤。任何适用于分子生物学的乙醇均可使用。</td></tr><tr><td>核酸外切酶 I (&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;)</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td>残留引物降解</td></tr><tr><td>凝胶上样染料，紫色（6x），无 SDS</td><td>NEB</td><td>B7025S</td><td>琼脂糖凝胶上样染料</td></tr><tr><td>HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td>用于载体体外转录的试剂盒</td></tr><tr><td>水平电泳装置</td><td></td><td></td><td>从琼脂糖凝胶中纯化载体 DNA 模板</td></tr><tr><td>I-Ceu</td><td>NEB</td><td>R0699S</td><td>用于载体降解的归巢核酸内切酶。</td></tr><tr><td>I-SceI</td><td>NEB</td><td>R0694S</td><td>用于载体降解的归巢核酸内切酶。</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HS ReadyMix（2x）</td><td>Kapa Biosystems（由 Roche 提供）</td><td>KK2601</td><td>用于目标文库扩增的 PCR 混合液</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST qPCR 试剂盒（通用型）2x</td><td>Kapa Biosystems（由 Roche 提供）</td><td>KK4600</td><td>qPCR 混合液，用于评估降解效率及所需 PCR 扩增循环数</td></tr><tr><td>微量移液器及多通道微量移液器（0.1-10 &amp;micro;L，1-20 &amp;micro;L，20-200 &amp;micro;L）</td><td>Gilson</td><td></td><td>推荐使用 Gilson 配合低吸附 Sorenson 吸头。其他移液器可能不兼容。不同品牌的低吸附吸头质量可能不一，可能导致样品损失增加。</td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td></td><td></td><td>用于最终文库的 Picogreen 浓度测定。使用微孔板可实现小体积测量并减少样品浪费。</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9937</td><td>或任何无核酸酶（DNase 和 RNase）的水</td></tr><tr><td>PCR 热循环仪</td><td></td><td></td><td>用于孵育步骤和 PCR 扩增</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td>用于载体模板扩增的 DNA 聚合酶（或任何高保真聚合酶）</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶提取试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>从琼脂糖凝胶中纯化载体 PCR 模板。</td></tr><tr><td>qPCR 仪</td><td></td><td></td><td>用于确定 PCR 扩增循环数及载体降解程度</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P11495</td><td>用于测定最终文库浓度——推荐使用，因在我们实验中其比 Qubit 更准确且可重复性更高。</td></tr><tr><td>Quick-Load 紫色 100 bp DNA 标准物</td><td>NEB</td><td>N0551S</td><td>DNA 标准物</td></tr><tr><td>Quick-Load 紫色 1 kb Plus DNA 标准物</td><td>NEB</td><td>N0550S</td><td>DNA 标准物</td></tr><tr><td>核糖核酸酶 H</td><td>Takara</td><td>2150A</td><td>帽捕获后 RNA 的消化。</td></tr><tr><td>RNase ONE 核糖核酸酶</td><td>Promega</td><td>M4261</td><td>降解未被 cDNA 保护的单链 RNA。</td></tr><tr><td>无 RNase DNase 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>体外转录后去除载体 DNA 模板。</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于体外转录或加帽后载体 RNA 的纯化</td></tr><tr><td>乙酸钠，1 M，水溶液，pH 4.5，无 RNase</td><td>VWR</td><td>AAJ63669-AK</td><td>或任何无核酸酶（DNase 和 RNase）的溶液</td></tr><tr><td>乙酸钠，1 M，水溶液，pH 6.0，无 RNase</td><td></td><td></td><td>或任何无核酸酶（DNase 和 RNase）的溶液</td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td>邻二醇氧化</td></tr><tr><td>Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MicroReach Guard，体积范围 10 &amp;mu;L，带刻度</td><td>Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）</td><td>Z719390-960EA</td><td>低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。</td></tr><tr><td>Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MultiGuard，体积范围 1,000 &amp;mu;L，带刻度</td><td>Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）</td><td>Z719463-1000EA</td><td>低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。</td></tr><tr><td>Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MultiGuard，体积范围 20 &amp;mu;L，带刻度</td><td>Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）</td><td>Z719412-960EA</td><td>低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。</td></tr><tr><td>Sorenson 低吸附气溶胶屏障吸头，MultiGuard，体积范围 200 &amp;mu;L，带刻度</td><td>Sorenson（可通过 SIGMA-ALDRICH 购得）</td><td>Z719447-960EA</td><td>低吸附吸头——推荐在整个实验流程中使用，以最大限度减少样品损失。</td></tr><tr><td>SpeedVac 真空浓缩仪</td><td></td><td></td><td>在多个步骤中浓缩样品至较小体积</td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td>用于逆转录（第一轮 CAGE 步骤）</td></tr><tr><td>海藻糖/山梨醇溶液</td><td></td><td></td><td>制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。</td></tr><tr><td>Tris-HCl，1 M 水溶液，pH 8.5</td><td></td><td></td><td>1 M 溶液，无 DNase 和 RNase</td></tr><tr><td>tRNA（20 mg/mL）</td><td></td><td></td><td>tRNA 溶液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。</td></tr><tr><td>UltraPure 低熔点琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16520050</td><td>或任何合适的纯低熔点琼脂糖。</td></tr><tr><td>USB 虾碱性磷酸酶（SAP）</td><td>Applied Biosystems（由 ThermoFisher Scientific 提供）</td><td>78390500UN</td><td></td></tr><tr><td>USER 酶</td><td>NEB</td><td>M5505S</td><td>降解 3' 连接子上链，尿嘧啶特异性切除试剂/酶</td></tr><tr><td>痘苗病毒加帽系统</td><td>NEB</td><td>M2080S</td><td>用于载体分子体外加帽的酶试剂盒</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 A</td><td></td><td></td><td>帽捕获洗涤液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 B</td><td></td><td></td><td>帽捕获洗涤液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。</td></tr><tr><td>洗涤缓冲液 C</td><td></td><td></td><td>帽捕获洗涤液。制备方法见 Murata 等人 2014 年文献。</td></tr></tbody></table>

使用超低输入量载体cage进行转录起始位点定位

Transcription Start Site Mapping Using Super-low Input Carrier-CAGE

基因表达的帽子分析（Cap analysis of gene expression, CAGE）是一种用于单核苷酸分辨率检测RNA聚合酶II转录起始位点（transcription start sites, TSSs）的方法。准确检测TSSs有助于核心启动子的识别与发现。此外，通过双向转录起始的特征还可检测活跃的增强子。本文描述了一种超低起始量载体-CAGE（super-low input carrier-CAGE, SLIC-CAGE）实验方案。该SLIC-CAGE方法通过向目标样本中添加体外转录的RNA载体混合物，人为增加RNA总量，从而最大限度减少RNA损失，使得仅需纳克级总RNA（即数千个细胞）即可完成文库构建。该载体模拟了目标DNA文库片段的长度分布，避免了均一载体丰度过高可能带来的偏差。在实验流程的最后阶段，利用归巢核酸内切酶降解去除载体，同时扩增目标文库。目标样本文库可免于降解，因为归巢核酸内切酶的识别位点较长（18至27 bp），在真核生物基因组中自然出现的概率极低。最终获得可用于高通量测序的DNA文库。从实验开始到测序前的所有步骤可在6天内完成。载体的制备需一整天工作时间，但可批量制备后于-80 °C冷冻保存。测序后，可对读段进行分析以获得全基因组范围内单核苷酸分辨率的TSSs。这些TSSs可用于核心启动子或增强子的发现，从而揭示基因调控机制。当数据按启动子聚合后，还可用于5’端为中心的表达谱分析。

本报告描述了从纳克级起始总RNA材料制备可用于测序的文库的完整SLIC-CAGE实验流程（图1）。为获得合成RNA载体混合物，首先需要制备PCR载体模板，并通过凝胶纯化去除PCR副产物（图2A）。每个PCR模板（共十个）使用相同的正向引物和不同的反向引物进行扩增（Table 2），从而产生不同长度的PCR模板，以实现合成RNA载体的大小多样性。纯化后的PCR模板用于体外转录生成载体RNA分子。若模板经过凝胶纯化，则预期每条反应仅产生一条RNA载体条带（参见图2B中代表性凝胶分析结果）。载体的制备可根据需要进行放大，制备完成后混合并分装，于-80 °C冷冻保存以备后续使用。
使用推荐的最低总RNA样本量（10 ng）并结合16-18个PCR扩增循环，即可获得高复杂度的SLIC-CAGE文库。扩增最终文库所需的PCR循环数很大程度上取决于所用总RNA输入量（预期循环数见表4）。
在第一轮降解后，qPCR 结果（步骤 17）中使用 adaptor_f1 或 carrier_f1 引物所获得的 Ct 值之间的预期差异为 1-2，其中使用 adaptor_f1 获得的 Ct 值低于使用 carrier_f1 获得的 Ct 值。
最终文库中片段长度的分布范围为 200-2,000 bp，平均片段大小为 700-900 bp（基于使用 Bioanalyzer 软件进行的区域分析，图 4B、D）。如 图 4A、C 所示，较短的片段需通过额外的尺寸排阻步骤去除（步骤 20-21）。这些短片段属于 PCR 扩增过程中的副产物，并非目标文库。需注意，较短的片段在测序流式池中的簇生成效率更高，可能导致测序问题。
每个样本预期获得的文库材料量为 5–50 ng。显著偏低的产量提示在实验过程中可能发生样本损失。如果所获得的低产量仍足以用于测序（文库混合后需要 2–3 ng），则文库可能复杂度较低（见下文）。
根据测序仪器的不同，加载到流动池中的文库量可能需要优化。使用Illumina HiSeq 2500时，加载8-12 pM的SLIC-CAGE文库，平均可获得1.5亿至2亿条读长， &gt;80%的读段通过Q30质量评分阈值。
获得的测序读段随后被比对到参考基因组上（对于50 bp的读段，可使用Bowtie212，其默认参数允许每条种子序列（22 bp）无错配）。预期的比对效率取决于总RNA输入量，具体数值见表5。 uniquely mapped reads 可导入R图形化与统计计算环境13，并利用CAGEr（Bioconductor软件包14）进行处理。该软件包的示例文档易于操作，详细说明了比对数据的分析流程与处理步骤。一种简便的文库复杂度可视化质控方法是启动子宽度的分布情况，因为低复杂度文库会人为地呈现出较窄的启动子区域（图5A，由1 ng总RNA构建的SLIC-CAGE文库，详细信息参见先前发表的研究10）。然而，即使是低复杂度的SLIC-CAGE文库，也能用于准确识别真实的转录起始位点（CTSSs），其精度优于其他适用于低/中等输入量的TSS定位方法（图5B、C）。
<img alt="RNA 加工与分析流程图，包含 cDNA 合成、生物素标记和 PCR 扩增。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1: SLIC-CAGE 实验方案的各个步骤。 将样品 RNA 与 RNA 载体混合物混合，使总 RNA 量达到 5 µg。通过逆转录合成 cDNA，并使用高碘酸钠氧化 RNA 的帽子结构。氧化反应使得生物素酰肼能够与帽子结构连接，从而将生物素标记到帽子上。mRNA 的 3′ 端也会被高碘酸钠氧化，从而使生物素同时标记到 mRNA 的 3′ 末端。为了去除在 cDNA 合成不完全的 mRNA:cDNA 杂交体以及 mRNA 3′ 末端上的生物素，样品经 RNase I 处理。随后，通过链霉亲和素磁珠进行亲和纯化（帽捕获），富集那些延伸至 mRNA 5′ 端的 cDNA。在释放 cDNA 后，连接 5′ 和 3′ 接头。使用 I-SceI 和 I-CeuI 归巢内切酶降解来源于载体的文库分子，并利用 SPRI 磁珠去除这些片段。最后对文库进行 PCR 扩增。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于DNA分析的载体模板和体外转录产物的PCR电泳凝胶图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：载体PCR模板与载体体外转录产物的代表性凝胶分析。（A） 凝胶纯化前的载体PCR模板：第一孔为1 kbp DNA标记物，随后为载体PCR模板1、1-10。（B） 携带者体外转录产物：第一孔为1 kbp DNA标记物，随后为载体转录产物1-10。样品在上样前经95 °C加热5分钟以变性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA片段分析，电泳图谱；片段长度与荧光强度；基因测序。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：SLIC-CAGE在第一轮载体降解前的DNA质量（高灵敏度DNA芯片）检测结果代表性图谱。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA片段分析图；电泳；片段长度与荧光强度；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：PCR扩增后SLIC-CAGE文库的代表性DNA质量（高灵敏度DNA芯片）检测图谱。（A）需额外进行片段大小选择以去除短片段的SLIC-CAGE文库。（B）使用0.6x SPRI磁珠与样本比例进行片段大小选择后的SLIC-CAGE文库。（C）产量较低、需通过片段大小选择去除短片段的SLIC-CAGE文库。（D）使用0.6:1 SPRI磁珠与样本比例进行片段大小选择后，产量较低的SLIC-CAGE文库。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SLIC-CAGE 数据比较；纳米克范围内的四分位间距宽度、真阳性与假阳性CTSS的图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59805/59805fig5.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5： SLIC-CAGE 文库的验证。（A） 由 1、5 或 10 ng 的 S. cerevisiae 总RNA构建的SLIC-CAGE文库，以及由 5 µg 的 S. cerevisiae 总RNA构建的nAnT-iCAGE文库中标签簇四分位间距宽度的分布。1 ng SLIC-CAGE文库中大量窄宽度标签簇的存在表明其复杂度较低。（B）S. cerevisiae SLIC-CAGE文库中CTSS鉴定的ROC曲线。所有 S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSS被用作真实集合。（C）S. cerevisiae nanoCAGE文库中CTSS鉴定的ROC曲线。所有 S. cerevisiae nAnT-iCAGE CTSS被用作真实集合。ROC曲线的比较显示，SLIC-CAGE在CTSS鉴定方面显著优于nanoCAGE。数据来自ArrayExpress E-MTAB-6519。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/59805fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：载体合成基因序列。 紫色加粗斜体显示I-SceI位点，绿色显示I-CeuI识别位点。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/Table1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>载体 </td>
			<td colspan="2">反向引物 5’-3’</td>
			<td>PCR 产物长度 / bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r1: NNNNNNCTACGTGTCGCAGACGAATT</td>
			<td>1034</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r2: NNNNNNTATCCAGATCGTTGAGCTGC</td>
			<td>966</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r3: NNNNNNCACTGCGGGATCTCTTTACG</td>
			<td>889</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r4: NNNNNNGCCGTCGATAACTTGTTCGT</td>
			<td>821</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r5: NNNNNNAGTTGACCGCAGAAGTCTTC</td>
			<td>744</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r6: NNNNNNGTGAAGAATTTCTGTTCCCA</td>
			<td>676</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r7: NNNNNNCTCGCGGCTCCAGTCATAAC</td>
			<td>599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r8: NNNNNNTATACGCGATGTTGTCGTAC</td>
			<td>531</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r9: NNNNNNACCGCCGCGCCTTCCGCAGG</td>
			<td>454</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td colspan="2">PCR_N6_r10: NNNNNNCAGGACGTTTTTGCCCAGCA</td>
			<td>386</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="2">* 所有载体模板使用相同的正向引物。下划线部分为 T7 启动子序列。PCR_GN5_f1: TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：载体模板扩增所用引物。 所有载体模板的正向引物均相同。下划线部分为T7启动子序列。PCR_GN5_f1：TAATACGACTCACTATAGNNNNNCAGCGTTCGCTA。通过使用不同的反向引物，可生成不同长度的PCR模板，从而产生相应不同长度的载体RNA。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>载体</td>
			<td>长度</td>
			<td>未加帽/µg</td>
			<td>加帽/µg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>1034</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>966</td>
			<td>8.36</td>
			<td>0.95</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>889</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>821</td>
			<td>6.6</td>
			<td>0.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>744</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>676</td>
			<td>3.08</td>
			<td>0.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>599</td>
			<td>4.4</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>531</td>
			<td>3.96</td>
			<td>0.45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>454</td>
			<td>2.64</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>386</td>
			<td>2.2</td>
			<td>0.25</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：RNA 载体混合物。 载体混合物总重为 49 µg，其中 0.3–1 kbp 片段：未加帽的为 44 µg，加帽的为 5 µg。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>总RNA输入量 /ng</td>
			<td>PCR循环数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ng</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ng</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ng</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ng</td>
			<td>15-16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ng</td>
			<td>14-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ng</td>
			<td>13-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ng</td>
			<td>12-14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4： PCR循环次数与样品总RNA投入量的关系。 循环次数的估算基于使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）和小鼠（Mus musculus）总RNA进行的实验。 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>总RNA输入量/ng</td>
			<td>总体比对率/%</td>
			<td>唯一比对率/%</td>
			<td>载体占比/%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ng</td>
			<td>30</td>
			<td>20-30</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ng</td>
			<td>60</td>
			<td>20-50</td>
			<td>10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ng</td>
			<td>60-70</td>
			<td>40-60</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ng</td>
			<td>65-80</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ng</td>
			<td>70-85</td>
			<td>40-70</td>
			<td>0-2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表5：预期的比对效率及其对总RNA投入量的依赖性。 所列数据为近似值，基于使用 Saccharomyces cerevisiae 和 Mus musculus 总RNA进行的实验结果。
补充表1：引物序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable1.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
补充表2：5’和3’接头的退火。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable2.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。</a>
补充表3：5’接头退火。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable3.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
补充表 4：5’ 连接子混合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable4.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
补充表5：5’接头稀释。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable5.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。</a>
补充表6：3’接头退火。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable6.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
补充表7：3’接头稀释液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable7.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
补充表 8：标准品系列稀释液的制备。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59805/supptable8.pdf" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>

基因表达的末端分析（Cap Analysis of Gene Expression, CAGE）是一种在全基因组范围内对mRNA 5’端进行定量作图的方法，可单核苷酸分辨率地捕获RNA聚合酶II的转录起始位点。本文描述了一种低起始量（SLIC-CAGE）建库方案，仅需纳克级总量RNA即可生成高质量文库。

使用超低输入量载体CAGE进行转录起始位点定位

基因表达的帽子分析（Cap analysis of gene expression, CAGE）是一种用于单核苷酸分辨率下检测RNA聚合酶II转录起始位点（TSSs）的方法。

该方法有助于回答基因调控领域中的关键问题，因为它能够利用起始材料的极低用量来发现核心启动子和增强子。该技术的主要优势在于，仅需10纳克总RNA即可实现对RNA聚合酶II转录起始位点的无偏倚、全基因组范围、单核苷酸分辨率的定位分析。CAGE技术正被证明在揭示与疾病相关的转录起始位点方面具有重要价值，这些位点可用作诊断标志物。SLIC-CAGE 将这些发现拓展至组织活检等样本量较小的研究。SLIC-CAGE 非常适用于对脆弱细胞类型进行深入且高分辨率的启动子分析，包括多种模式生物的早期胚胎发育阶段或胚胎组织。由于本实验方案包含多个步骤，因此在各步骤间转移样本时，务必尽可能回收全部材料，以最大限度地减少样本损失。首先为每个模板制备PCR反应体系。根据论文中的说明，将缓冲液、dNTPs、特异性正向引物、含有合成载体基因的模板质粒以及融合聚合酶混合。通过移液操作混匀各试剂。向每份10微升的反转录引物中加入90微升PCR混合液，并充分混匀。热循环条件请参见原文。对目标RNA进行反转录（RT）反应。在总体积为10微升的反应体系中，加入1微升逆转录引物、10纳克RNA和4,990纳克载体混合物。通过移液器吹打混匀。将混合物在65摄氏度加热5分钟，然后立即置于冰上。根据说明书配制反转录（RT）反应体系，将28微升反应体系加入10微升RNA中。用移液器吹打混匀管内液体。在PCR仪中进行反转录反应。逆转录完成后，使用无DNase和RNase的SPRI磁珠纯化产物。按1.8:1的体积比将磁珠加入逆转录反应体系中，通过移液充分混匀。室温静置5分钟。然后将磁珠置于磁力架上，静置5分钟使其分离。弃去上清液，并向磁珠中加入200 µL新配制的70%乙醇。不要混匀磁珠，也不要将磁珠从磁力架上取下，加完乙醇后应立即移除乙醇。将离心管置于磁力架上，用P10移液器推出残留的液滴，彻底去除乙醇痕迹。立即加入42 µL水，上下吹打60次以洗脱样品，注意避免产生气泡。将离心管在37 °C下孵育5分钟（不加盖），然后将磁珠置于磁力架上分离。然后，将上清液转移至一组新的离心管中，注意完全回收上清液，但避免磁珠的转移。RNase I 处理后，将 45 µL 样品与 105 µL 预先制备的链霉亲和素磁珠混合，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。孵育期间，每 10 分钟用移液器吹打混匀一次样品。然后，将磁珠置于磁力架上分离，并移除上清液。依次用缓冲液A、缓冲液B和缓冲液C洗涤磁珠。首先加入缓冲液A，将磁珠重悬于150 µL缓冲液中。在磁力架上分离2至3分钟，然后移除上清液。将缓冲液 B 和 C 预热至 37 摄氏度，并重复洗涤步骤。为去除所有未加帽的 RNA，必须彻底洗涤链霉亲和素磁珠和管壁，并在加入下一种洗涤缓冲液之前完全去除上一步的洗涤缓冲液。为释放 cDNA，将磁珠重悬于 35 µL 1X RNase I 缓冲液中，在 95 摄氏度孵育 5 分钟。孵育后立即将珠子置于冰上两分钟。将珠子置于磁力架上分离，然后将上清液转移至一组新离心管中。用30 µL 1× RNase I缓冲液重悬珠子，再置于磁力架上分离。将上清液与先前收集的上清液合并，总体积约为65微升。进行qPCR以确定目标文库扩增的PCR循环数。配制qPCR主混合液，用于扩增来自载体的完整DNA文库。根据文稿说明设置热循环条件，并扩增已制备的样品。SLIC-CAGE 实验方案可从纳克级起始 RNA 材料中获得适用于测序的文库。最终文库中的片段长度范围为 200 至 2,000 个碱基对。较短的片段是PCR产物中的人工产物，可能会在后续测序过程中引发问题。可进行额外的片段大小筛选步骤以去除这些片段。与NanoCAGE相比，SLIC-CAGE在转录起始位点鉴定方面表现出显著更优的性能，这一点在对不同量的酿酒酵母（S.cerevisiae）总RNA进行两种技术的受试者工作特征曲线分析中得以体现。在执行本实验方案时，需注意样本损失可能导致文库复杂度降低。为防止此情况，必须使用低吸附的移液器吸头和离心管。此前，若无SLIC-CAGE技术，各类细胞类型的启动子分析均无法实现。这包括对多种模式生物的胚胎发育阶段或胚胎组织进行分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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