Name: 将操纵的肿瘤相关中性粒细胞转移到肿瘤携带小鼠中,以研究其血管生成潜力在Vivo (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解通过NAMPT抑制剂FK866处理肿瘤相关中性粒细胞并过继转移至荷瘤小鼠的方法，用于评估其抗血管生成潜力及开发基于中性粒细胞的癌症免疫治疗新策略。

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本研究得到了德国癌症援助组织（Deutsche Krebshilfe，资助号：111647）和德国研究基金会（DFG，资助号：JA 2461/2-1）的资助。

所有涉及动物实验的操作均已获得德国北莱茵-威斯特法伦州自然、环境与消费者保护局（LANUV）以及蒂宾根行政区政府（Regierungspräsidium Tübingen）的批准。所有操作均须在无菌条件下（超净工作台内）进行，并使用无菌试剂和器械（注射器、剪刀、镊子、一次性手术刀片、培养皿）。
注意：该实验方案的整体流程如图1所示。
1. B16F10 黑色素瘤细胞系的制备
<ol>
	<li>使用完全伊格尔改良杜尔贝科培养基（IMDMc：IMDM + 10% 胎牛血清（FBS）+ 1% 青霉素-链霉素），培养支原体阴性细胞至90%汇合的单层（约每T75培养瓶10 × 106 个细胞）。</li>
	<li>移除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。加入6 mL含有蛋白水解酶和胶原酶活性的细胞解离溶液（见材料表），于37 °C孵育2分钟。</li>
	<li>轻轻敲击培养瓶，使残留贴壁细胞脱落。将细胞悬液收集至15 mL离心管中，在20 °C下以300 × g离心7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用1 mL PBS充分重悬，再加入14 mL PBS，于20 °C下以300 × g离心7分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用1 mL PBS重悬。</li>
	<li>计数细胞，并将其重悬于PBS中，调整浓度至3 × 106/mL（用于步骤2）或6 × 106/mL（用于步骤6），用于注射。细胞置于冰上保存，时间不超过30分钟。</li>
</ol>
2. 小鼠异基因肿瘤模型
<ol>
	<li>使用8至12周龄的雌性Ifnar1-/-小鼠10只，饲养于特定病原体阴性（SPF）条件下。 
	注意：在皮下肿瘤生长模型中优先选用雌性小鼠，因为雄性小鼠更具攻击性，容易抓伤肿瘤部位，从而影响肿瘤生长。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除小鼠侧 flank 部皮肤毛发，并用浸有70%乙醇的纱布对皮肤进行消毒。</li>
	<li>将制备好的B16F10黑色素瘤细胞以3 × 106/mL PBS浓度（见步骤1）吸入1 mL注射器中，使用0.4 × 19 mm针头，皮下注射100 μL细胞悬液。
	<ol>
		<li>每次注射前需充分混匀细胞悬液。应使用直径不小于0.4 mm的针头，以避免损伤肿瘤细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每笼最多饲养5只小鼠，使用游标卡尺监测肿瘤大小（长、宽、深）共14天。 
	注意：根据动物实验伦理规定，肿瘤直径不得超过15 mm，若小鼠肿瘤过大或出现坏死/溃破，应提前实施安乐死。</li>
	<li>第14天时，在CO2安乐死舱中处死小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇对皮肤进行消毒，在无菌培养皿中使用剪刀和镊子切除肿瘤组织，并将肿瘤置于50 mL离心管中，加入完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEMc：DMEM + 10% FBS + 1%青霉素-链霉素），冰上保存。</li>
</ol>
3. TAN 分离
<ol>
	<li>将肿瘤放入无菌的6孔板中，每孔放置5个肿瘤。用无菌剪刀将肿瘤切成2-3 mm大小的组织块。
	<ol>
		<li>每份肿瘤加入1 mL dispase/collagenase D/DNase I溶液（DMEMc中含0.2 mg/0.2 mg/100 mg），进行消化。在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育，并每隔15分钟用10 mL无针头注射器混匀一次，共操作3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为去除未消化的纤维组织，将细胞通过100 µm滤网过滤至15 mL离心管中（每孔使用一个滤网，每管收集一孔滤液）。加入PBS至15 mL，于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>每管加入1 mL红细胞裂解缓冲液（含150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA，pH 7.3，20 °C）裂解红细胞。充分混匀后，将所有离心管中的液体合并至同一管中。2分钟后加入11 mL冰浴预冷（4 °C）的DMEMc终止反应。</li>
	<li>于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。用15 mL预冷的PBS重悬沉淀。再次于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL PBS重悬细胞沉淀。加入3 μL Fc阻断抗体（CD16/CD32，储存浓度0.5 mg/mL），冰上孵育15分钟。</li>
	<li>加入抗体：10 μL Ly6G-PE（储存浓度0.2 mg/mL）和10 μL CD11b-APC（储存浓度0.2 mg/mL）。再加入20 μL 6-二脒基-2-苯基吲哚活力染料（DAPI，储存浓度5 mg/mL），避光冰上孵育30分钟。 
	注：也可使用其他活力染料与荧光标记抗体的组合。</li>
	<li>加入PBS至15 mL，于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用DMEMc重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至约10 × 106/mL，并置于冰上保存。</li>
	<li>使用荧光激活细胞分选仪分选活的（DAPI阴性）CD11b+ Ly6Ghi中性粒细胞（分选门控策略见图2）。 
	注：保持细胞悬液管及收集分选后细胞所用的DMEMc管置于4 °C。推荐使用以下最佳分选参数：70 μm喷嘴，最大阈值速率为22,000事件/秒，流速为1-3。</li>
	<li>使用流式细胞仪检测分选后中性粒细胞的纯度，建议纯度应达到&#62;95%。</li>
	<li>将分选后的中性粒细胞于460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。用DMEMc重悬细胞，调整浓度至1 × 106/mL。 
	注：单个14天大小的B16F10肿瘤（直径约10 mm）中预期可获得的中性粒细胞数量约为3 × 104个。</li>
</ol>
4. 体外抑制 TANs 中的 NAMPT
<ol>
	<li>将FK866（NAMPT抑制剂）溶于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为100 mM的储备液。</li>
	<li>将分选后的中性粒细胞（步骤3.11）接种至96孔U型底培养板中的2个孔内（每孔1.5 × 105个中性粒细胞）。在干预孔中加入FK866（终浓度为100 nM），在对照孔中加入等体积含DMSO的DMEM完全培养基（DMEMc）。将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育2小时。</li>
	<li>以460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。每孔用200 μL PBS重悬细胞，重复洗涤2次。</li>
	<li>以460 × g、4 °C离心5分钟，弃去上清液。将细胞重悬于商用内皮细胞生长培养基中（添加4 µL/mL内皮细胞生长补充剂、0.1 ng/mL重组人表皮生长因子、1 ng/mL重组人碱性成纤维细胞生长因子、90 µg/mL肝素和1 µg/mL氢化可的松），调整细胞浓度至0.2 × 106 个细胞/mL（体积为0.75 mL），用于步骤5；或重悬于PBS中，调整细胞浓度至0.6 × 106 个细胞/mL（体积为0.25 mL），用于步骤6。</li>
</ol>
5. 使用主动脉环实验评估 TANs 的血管生成特性
<ol>
	<li>取雄性C57BL/6J（WT）小鼠的胸主动脉，清理后切成0.5 mm宽的环状组织。将所有主动脉环放入24孔板中，每孔加入1 mL含补充剂的内皮细胞生长培养基。在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育过夜。 
	注意：建议使用年轻（小于8周龄）雄性小鼠进行主动脉分离，因其可产生更强的血管生成反应15。</li>
	<li>向96孔平底板的各孔中加入50 µL溶解的基底膜基质，于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中静置30分钟，使基质凝固聚合。每种实验条件至少准备3个孔。</li>
	<li>将主动脉环置于已固化的基质层表面，每孔中央放置一个主动脉环，通过此方式将主动脉环包埋于溶解的基底膜基质中。再向每孔加入50 µL溶解的基底膜基质，完全覆盖主动脉环。
	<ol>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中继续孵育30分钟，使第二层基质完成聚合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每孔加入150 μL含补充剂的内皮细胞生长培养基，并接种2×104个 Ifnar1-/- TANs（对照组和FK866处理组）（见步骤4.4）。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育14天。</li>
	<li>使用标准相差显微镜进行成像，并评估内皮细胞分支情况。可利用专为科学图像设计的图像处理程序，自动定量分析血管形态学和空间参数，包括分支指数。 
	注意：代表性结果见图3。</li>
</ol>
6. 在同种异体肿瘤模型中过继性转移经处理的中性粒细胞
<ol>
	<li>将B16F10黑色素瘤细胞（步骤1.6）用PBS配制成浓度为6 × 106 个细胞/mL的悬液。</li>
	<li>准备两种中性粒细胞：FK866处理的中性粒细胞和对照未处理的中性粒细胞（步骤4.4），用PBS配制成浓度为6 × 105 个细胞/mL的悬液。将中性粒细胞与B16F10黑色素瘤细胞混合（最终中性粒细胞与肿瘤细胞比例为1:10），得到两种细胞混合物。</li>
	<li>取10只8–12周龄的雌性野生型小鼠，每组5只。使用电动剃毛器剃除小鼠侧腹部皮肤毛发，并用70%乙醇消毒。</li>
	<li>使用胰岛素注射器和直径0.4 mm的针头，将100 µL细胞悬液（步骤6.2）皮下注射至两组小鼠。将同组的1–5只小鼠饲养于同一笼中。</li>
	<li>第2天，准备两种中性粒细胞：FK866处理的中性粒细胞和对照未处理的中性粒细胞（步骤4.4），用PBS配制成浓度为6 × 105 个细胞/mL的悬液。使用胰岛素注射器和直径0.4 mm的针头，将100 µL细胞悬液（步骤6.4）经尾静脉注射至两组小鼠体内。注射后将小鼠放回笼中。</li>
</ol>
7. 肿瘤生长测量、组织学检查
<ol>
	<li>每隔一天监测一次肿瘤生长情况。使用游标卡尺测量肿瘤尺寸，并利用公式 V=4/3*π*(h*w2)/8（h=高度，w=宽度，深度=宽度）。</li>
	<li>在第14天处死小鼠2 腔室。取出肿瘤并称量肿瘤重量。</li>
	<li>将肿瘤置于液氮中用最佳切割温度包埋剂速冻，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>将样本在 -20 °C 条件下解冻，并使用冷冻切片机制备 5 μm 切片。将冷冻切片在 20 °C 下干燥 30 分钟。用 -20 °C 的冷丙酮固定切片 2 分钟，随后在 20 °C 下再干燥 30 分钟。</li>
	<li>用Fc阻断抗体（CD16/CD32，储存浓度0.5 mg/mL，1:500稀释）在PBS中于20 °C封闭1小时。</li>
	<li>使用兔抗小鼠Laminin gamma抗体（PBS中1:1500稀释，200 µL）在20 °C孵育1小时。用PBS洗涤三次。</li>
	<li>使用二抗山羊抗兔抗体（储存液 0.5 mg/mL，PBS 中 1:400 稀释）、抗小鼠 αSMA 抗体（PBS 中 1:500 稀释）以及 2 µL DAPI（储存液 5 mg/mL，PBS 中 1:100 稀释），加入抗体溶液至终体积为 200 µL 进行染色。于 20 °C 避光孵育 1 小时。用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>在20 °C避光条件下干燥载玻片20分钟。使用无水封片剂封片，并加盖盖玻片。在37 °C下干燥1小时。</li>
	<li>进行显微镜检查。通过计数层粘连蛋白标记的血管总数（可选面积）来量化血管化程度。+ 血管以及SMA的数量（面积）+ 发育中的血管 
	注意：为了进行图像分析，应在相同条件下（光照、对比度、放大倍数）采集所有图像。在此情况下，处理参数保持固定，图像处理可完全自动化。代表性结果如图所示 图4 和 图5.</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管在癌症的外科和药物治疗方面已取得进展，但成功治疗仍然面临挑战。由于已知免疫细胞在调控肿瘤生长中发挥重要作用，因此应建立抑制这些细胞致瘤性的新方法。本文展示了一种通过过继性转移抗血管生成的肿瘤相关中性粒细胞来抑制肿瘤生长的新策略。使用FK866抑制剂选择性靶向TANs中促血管生成的NAMPT信号通路，可避免全身性FK866治疗所引起的各种副作用。
该实验方案最关键的步骤是必须使用 freshly isolated 的原代中性粒细胞。中性粒细胞为短寿命细胞，在分离过程中容易发生凋亡或被激活。小鼠中性粒细胞在分离的各个步骤中（包括细胞分选）均应保存在 4 °C 的培养基中。中性粒细胞的分离应尽快完成，实验过程中不应暂停。使用 Fc 阻断剂有助于减少高表达 Fc 受体的细胞（如 NK 细胞）产生的非特异性染色。我们还建议尽量减少荧光标记抗体的使用数量，以简化设门策略，并避免因抗体结合导致中性粒细胞被激活。
该实验方案的限制步骤是从肿瘤中分离出活的中性粒细胞，原因是肿瘤中这类细胞的数量相对较少（在黑色素瘤中不超过活单细胞的1%）。只...

I型干扰素（IFNs）在刺激宿主对肿瘤的应答中发挥重要作用，因为缺乏I型IFN信号会导致肿瘤生长显著增加1。参与该过程的机制之一是调控肿瘤相关中性粒细胞的致瘤活性，这一过程受粒细胞集落刺激因子3受体（CSF3R）下游信号通路的控制2。粒细胞集落刺激因子（CSF3），即粒细胞集落刺激因子，已被证明可激活涉及烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）的信号通路3,4。NAMPT是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成的限速酶，可增强糖酵解，并调控DNA修复、基因表达和应激反应，从而促进癌细胞的存活与增殖5。NAMPT在多种癌症类型中均呈过表达，包括结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌以及胶质瘤6。NAMPT不仅对肿瘤细胞至关重要，也对肿瘤微环境中存在的多种其他细胞类型（如髓系细胞）具有重要作用——它可驱动这些细胞的分化4，抑制凋亡，并刺激巨噬细胞中多种细胞因子或基质降解酶的表达7。
肿瘤相关性中性粒细胞是肿瘤生长的重要调节因子。TAN 的功能高度依赖于 I 型干扰素（IFN）的可及性，因为这些细胞因子能够启动中性粒细胞的抗肿瘤活性。相反，IFN 的缺失则促进这些细胞向促肿瘤方向活化，尤其是增强其促血管生成特性。与此一致的是，IFN 缺陷型小鼠会形成显著更大且血管化程度更高的肿瘤，且肿瘤组织中大量浸润着具有促肿瘤/促血管生成特性的中性粒细胞1,2,8,9,10。重要的是，这类促血管生成型 TAN 表现出 NAMPT 活性升高，提示 NAMPT 在中性粒细胞向促肿瘤极化过程中发挥关键作用。
使用 Ly6G 抗体耗竭中性粒细胞或通过 CXCR2 抗体抑制其迁移，可导致肿瘤血管生成、生长及转移减少1,8。然而，所产生的单克隆抗体具有免疫原性，其使用可能引发一系列危及生命的不良反应11。使用小分子药物（如 NAMPT 抑制剂 FK866）调节中性粒细胞的促肿瘤特性，可能有助于避免此类并发症。遗憾的是，NAMPT 的药理学全身性抑制在对肿瘤生长产生治疗作用的同时，也会导致严重的副作用，包括胃肠道毒性和血小板减少症。因此，NAMPT 抑制剂的全身应用并不可行12,13,14。
基于此，我们提出一种直接在分离的肿瘤相关中性粒细胞（TANs）中阻断NAMPT活性的实验方案。这类具有抗肿瘤作用的中性粒细胞随后可被过继转移至荷瘤宿主体内。该方案有助于避免化合物引起的全身性毒性副作用，同时可维持其对靶细胞的作用效果。

<table><tbody><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Sarstedt AG &amp; Co., N&amp;uuml;mbrecht, 德国</td><td>62,554,502</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, 德国</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>用于自动移液器的 5 ml / 10 ml / 25 ml 无菌吸头</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, 德国</td><td>6006180 / 607180 / 760180</td><td></td></tr><tr><td>6 孔平底细胞培养板</td><td>Sarstedt AG &amp; Co., N&amp;uuml;mbrecht, 德国</td><td>833,920</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底细胞培养板</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, 德国</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>96 孔U型底细胞培养板</td><td>Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, 德国</td><td>65018</td><td></td></tr><tr><td>AMG EVOS fl 数字倒置显微镜</td><td>AMG, Bothel, 美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11b 抗体</td><td>BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 美国</td><td>553312</td><td>克隆号 M1/70，APC 标记，0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly6G 抗体</td><td>BioLegend, 加利福尼亚, 美国</td><td>127608</td><td>克隆号 1A8，PE 标记，0.2 mg/mL</td></tr><tr><td>BD FACS AriaII</td><td>BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 美国</td><td></td><td>细胞分选仪</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Vogel Germany, Kevelaer, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Casy 细胞计数器</td><td>Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Trics 50&amp;micro;m / 100 &amp;micro;m 无菌滤器</td><td>Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, 德国</td><td>04-004-2327 / 04-004-2328</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Rotina 420 R 离心机</td><td>Andreas Hettich, Tuttlingen, 德国</td><td>4706</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, 德国</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，双乳酸盐)</td><td>BioLegend, 加利福尼亚, 美国</td><td>422801</td><td>储存液：5 mg/ml</td></tr><tr><td>Dispase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, 德国</td><td>D4818-2MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td>41966-029</td><td>完全 DMEM：DMEM + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>DMSO (二甲基亚砜)</td><td>WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, 德国</td><td>WAK-DMSO-10</td><td>CryoSure-DMSO</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, 德国</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基</td><td>PromoCell, Heidelberg, 德国</td><td>c-22010</td><td></td></tr><tr><td>FBS (胎牛血清)</td><td>Biochrom, 柏林, 德国</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Fc 阻断剂 (抗小鼠 CD16/32)</td><td>BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 美国</td><td>553142</td><td>克隆号 2.4G2，储存液：0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>FK 866 盐酸盐</td><td>Axon Medchem, Groningen, 荷兰</td><td>Axon 1546</td><td>储存液：100 mM</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG H&amp;L</td><td>Abcam, 剑桥, 英国</td><td>ab97075</td><td>Cy3 标记，储存液：0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, 美国</td><td>51026334</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td>12440-053</td><td>完全 IMDM：IMDM + 10% FBS + 1% 青霉素-链霉素</td></tr><tr><td>Isis GT420 剃须刀</td><td>B. Braun Asculap, Suhl, 德国</td><td>90200714</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基质基底膜</td><td>Corning Life Sciences, 阿姆斯特丹, 荷兰</td><td>7205011</td><td></td></tr><tr><td>Microtome Cryostat Microm HM 505 N 冰冻切片机</td><td>Microm International GmbH, Walldorf, 德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>单克隆抗肌动蛋白，&amp;alpha;-平滑肌</td><td>Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, 德国</td><td>F3777</td><td>FITC 标记，无储存浓度信息</td></tr><tr><td>0.4 mm × 16 mm 针头</td><td>BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 美国</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>Neomount</td><td>Merck, Darmstadt, 德国</td><td>HX67590916</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, 美国</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetus 自动移液器</td><td>Hirschmann Laborger&amp;auml;te, Eberstadt, 德国</td><td>9907200</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠层粘连蛋白 γ1 链抗体</td><td>Immundiagnostik, Bensheim, 德国</td><td>AP1001.1</td><td>无储存浓度信息</td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 马萨诸塞州, 美国</td><td>A1105-01</td><td></td></tr><tr><td>无菌一次性手术刀（15 号）</td><td>MedWare, Naples, 美国</td><td>120920</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 美国</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, 美国</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>T75 无菌细胞培养瓶</td><td>Sarstedt AG &amp; Co., N&amp;uuml;mbrecht, 德国</td><td>833,911,302</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂</td><td>Sakura Finetek, Torrance, 美国</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>配备 ApoTome 光学切片系统的 Zeiss AxioObserver.Z1 倒置显微镜</td><td>Carl Zeiss, Oberkochen, 德国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

将经处理的肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠以研究其体内促血管生成潜能

Transfer of Manipulated Tumor-associated Neutrophils into Tumor-Bearing Mice to Study their Angiogenic Potential In Vivo

中性粒细胞在调控肿瘤发生中的作用正受到越来越多的关注。这些细胞具有异质性，根据肿瘤微环境的不同，可能表现出促肿瘤或抗肿瘤的能力。在肿瘤背景下，调节中性粒细胞功能的重要细胞因子之一是I型干扰素。在干扰素存在的情况下，中性粒细胞获得抗肿瘤特性，包括细胞毒性或免疫系统的激活作用；相反，干扰素信号缺失则导致显著的促肿瘤活性，其特征是强烈促进肿瘤血管生成。最近，我们已证实中性粒细胞的促血管生成特性依赖于其细胞内烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）信号通路的激活。在肿瘤相关中性粒细胞（TANs）中抑制该通路可使其转变为强效的抗血管生成表型。在此，我们展示了新建立的小鼠模型，可用于在活体条件下评估经干预后的肿瘤相关中性粒细胞的致瘤潜能。简言之，可从荷瘤的干扰素缺陷型小鼠中分离出具有促血管生成特性的肿瘤相关中性粒细胞，并通过阻断NAMPT信号通路将其重极化为抗血管生成表型。这些细胞的血管生成活性可通过主动脉环实验进行后续评估。抗血管生成型TANs可被转移至荷瘤的野生型受体小鼠体内，并持续监测肿瘤生长情况达14天。第14天处死小鼠，取出肿瘤并进行切片，评估其血管化程度。总体而言，本方案提供了一种新颖的工具，可在无需使用人工中性粒细胞系模型的情况下，直接在活体中评估如肿瘤相关中性粒细胞等原代细胞的血管生成能力。vc

采用此处所述方法，从肿瘤中分离出 Ifnar1-/- 中性粒细胞，并用 NAMPT 抑制剂 FK866 处理 2 小时。未处理的 Ifnar1-/- 中性粒细胞作为对照。通过主动脉环实验评估处理效果，该实验可反映血管生成过程中的关键步骤（基质降解、迁移、增殖、重组）。结果表明，与未处理细胞相比，经 FK866 处理的中性粒细胞刺激主动脉分支形成的能力显著降低（图 3A、3B）。将经 FK866 处理的抗血管生成型中性粒细胞皮下注射至荷瘤小鼠体内（第 0 天皮下注射，第 2 天静脉注射）。与注射未处理 Ifnar1-/- 中性粒细胞的小鼠相比，观察到肿瘤生长显著受抑（图 4A、4B）。对切除肿瘤的组织学检查证实，与注射未处理 Ifnar1-/-</sup...

在此，我们展示了将抗血管生成性肿瘤相关中性粒细胞转移至荷瘤小鼠后所表现出的治疗潜力。该方案可用于在体外调控中性粒细胞活性，并进一步在体内评估其功能。&#160;在肿瘤发生过程中. 它是研究潜在的中性粒细胞免疫疗法的合适模型。

中性粒细胞在调控肿瘤发生中的作用正受到越来越多的关注。这些细胞具有异质性，其功能取决于……

本方案提供了一种新颖的工具，用于在体内评估肿瘤相关性中性粒细胞的促血管生成潜能，而无需使用人工的中性粒细胞系模型。通过直接抑制肿瘤相关性中性粒细胞中的烟酰胺磷酸核糖转移酶（简称 NAMPT），随后将其过继性转移至荷瘤动物体内，可在不产生全身性毒性副作用的情况下实现对中性粒细胞的调控。我们将展示经调控后的抗血管生成型肿瘤相关性中性粒细胞在转移至荷瘤宿主后所表现出的治疗潜力，以研究在不同癌症模型中基于中性粒细胞的免疫疗法的潜在应用。建立同种异体肿瘤小鼠模型时，使用电动剃毛器剃除10只8至12周龄雌性干扰素α和β受体亚基1基因敲除小鼠的背部皮肤毛发，并用70%乙醇消毒皮肤。随后，将每毫升含10的6次方个B16F10黑色素瘤细胞的PBS悬液，用装有0.4×19毫米针头的1毫升注射器吸取，每只剃毛小鼠在后侧背部皮下注射100微升细胞悬液。进行中性粒细胞过继转移实验时，将B16F10黑色素瘤细胞用PBS稀释至浓度为6×10⁶个细胞/毫升，将经NAMPT抑制剂FK866处理的中性粒细胞用PBS稀释至浓度为6×10⁵个细胞/毫升。然后，将未经处理或经抑制剂处理的中性粒细胞与黑色素瘤细胞按中性粒细胞与肿瘤细胞1:10的比例混合，每组最多5只小鼠，每只小鼠皮下注射100微升细胞混合液。注射后，将最多五只注射过的雌性小鼠放入同一个笼子中，并使用游标卡尺每天测量肿瘤的长度、宽度和深度，持续14天。注射后第14天，用70%乙醇对每只注射小鼠的皮肤进行消毒，然后使用剪刀和镊子将肿瘤取出，放入预冷的含有完全培养基的50毫升锥形管中。为进行组织学分析切片，将肿瘤组织浸入最佳切割温度包埋剂（OCT compound）中，并在液氮中速冻，随后于-80摄氏度保存。切片当天，将样本在使用冷冻切片机前解冻至负20摄氏度，以获得五微米厚的切片。经非特异性结合封闭后，在20摄氏度下用目标一抗孵育肿瘤组织切片一小时，随后用PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，在避光条件下，于20摄氏度下用合适的荧光标记二抗及含DAPI的核染色染料对细胞染色一小时。孵育结束后，在20摄氏度避光条件下将载玻片干燥20分钟，然后用无水封片剂封固样本，每张载玻片加盖盖玻片，并在37摄氏度下使封片剂干燥1小时，随后通过荧光显微镜对组织成像。对于肿瘤相关中性粒细胞的分离，将每五个肿瘤分别放入无菌六孔板的各个孔中，在收获时使用无菌剪刀将肿瘤剪切成2至3毫米大小的组织块。接着，在5%二氧化碳、湿润环境中，于37摄氏度下用1毫升dispase collagenase d dnase 1溶液消化肿瘤碎片45分钟，每隔15分钟用10毫升注射器混匀样本一次。孵育结束后，通过100微米滤网将细胞过滤至每孔一个15毫升离心管中，以去除未消化的纤维组织，并加入PBS至终体积15毫升。通过离心收集解离的细胞，每管加入1毫升裂解缓冲液以裂解红细胞。混匀后，将各

transfer-manipulated-tumor-associated-neutrophils-into-tumor-bearing

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科研

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癌症研究

将操纵的肿瘤相关中性粒细胞转移到肿瘤携带小鼠中,以研究其血管生成潜力在Vivo

本视频展示了一种生成抗血管生成性肿瘤相关性中性粒细胞（TANs）的实验方法。通过获取含有促血管生成性TANs的小鼠黑色素瘤组织，采用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离单细胞，并使用烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）抑制剂处理，以降低其促进血管生成的能力。...

生成抗血管生成的肿瘤相关中性粒细胞

癌症是一种复杂的疾病，其发展受到肿瘤周围组织以及局部促炎和抗炎介质的影响。因此，与皮下注射模型相比，原位注射模型可能更适用于研究癌症进展，以更好地模拟人类疾病的病理过程。...

将乳腺癌细胞正位注射至小鼠乳腺脂肪垫以研究肿瘤生长

中性粒细胞不仅在宿主防御侵入性微生物方面发挥重要作用，还参与对肿瘤细胞的免疫监视。本文描述了具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离技术，以及监测抗肿瘤中性粒细胞功能的方法。 体外 和 体内.

具有抗肿瘤特性的中性粒细胞的分离与表征

本文描述了一种原位乳腺癌原发肿瘤模型，以及通过手术切除原发肿瘤以延长小鼠生存期从而产生自发性转移的方法。肿瘤的生长和进展通过荧光素酶成像进行监测和定量。...

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研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。...

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本方案描述了表达细胞特异性荧光标记的转基因小鼠的活体成像。活体成像提供了一种非侵入性方法，可通过植入式窗口对活体动物进行高分辨率观察，从而实现对生物学过程的显微可视化。该方法特别适用于研究纵向动态过程。...

利用转基因荧光小鼠和改良型背部皮肤折叠窗腔进行肿瘤相关血管的活体显微成像

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利用活体成像与固定组织分析评估与癌细胞播散相关的转移门户介导的血管通透性肿瘤微环境

本文介绍了一种用于在小鼠肿瘤模型中表征肿瘤固有及外周来源的肿瘤浸润淋巴细胞的肿瘤移植方案。通过流式细胞术特异性追踪受体来源免疫细胞的浸润，可揭示这些细胞在抗肿瘤免疫应答过程中表型与功能变化的动力学特征。...

小鼠肿瘤浸润性CD8+ T细胞动态评估的肿瘤移植方法

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一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

了解通过NAMPT抑制剂FK866处理肿瘤相关中性粒细胞并过继转移至荷瘤小鼠的方法，用于评估其抗血管生成潜力及开发基于中性粒细胞的癌症免疫治疗新策略。

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