从富集的人类记忆B细胞群体中筛选和回收具有理想特异性的抗体的单细胞筛选方法
2019年8月22日
通过流式细胞术结合单细胞PCR与克隆技术，BSelex方法可用于从人外周血单个核细胞中鉴定并回收特异性抗原抗体。
本方案具有重要意义，因为它可用于分析人类供体的免疫组库，以鉴定稀有的抗原特异性B细胞。该技术使我们能够获得天然配对的重链和轻链，这些序列可被快速克隆，并直接用于针对目标抗原或多种抗原进行检测。本实验操作将由本实验室的技术员 Mike Morton 进行示范。
解冻并复苏后至少一小时，通过离心收集供体外周血单个核细胞（PBMC）。将细胞重悬于50毫升冰上预冷的MES缓冲液中进行计数。再次离心形成细胞沉淀，然后根据标准操作流程，使用CD22磁珠通过阳性选择法分离CD22阳性B细胞。
通过离心收集磁珠分离的CD22阳性细胞，并将细胞重悬于Vax缓冲液中，浓度为每毫升4 × 10⁷个细胞。根据生产商推荐的稀释比例，向细胞中加入IgG CD19 CD27抗体混合物，轻轻混匀，并将10⁷个细胞分装至1.5毫升微量离心管中作为阴性对照。向阴性对照管中加入双标记的生物素-链霉亲和素四聚体复合物，每种四聚体终浓度为36 nmol/L，并根据分选管中肽段的数量乘以PE和APC标记的浓度。
用新鲜的Vax缓冲液将每管的终体积补至2.5毫升，并向分选管中加入PE和APC标记的肽四聚体，每种终浓度为36纳摩尔。离心后，将细胞重悬于100微升TBS缓冲液中，细胞浓度为2×10⁶，于4°C避光、旋转孵育30至60分钟。孵育结束后，用新鲜TBS缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤后将样品滤入各自的5毫升带滤网帽的试管中。
使用终浓度为 0.3 微摩尔的 DAPI 对样品进行染色，作为细胞膜完整性的标记。将整个阴性对照样本上样至细胞分选仪，以设定流式细胞术门控，用于分离适合单细胞分选的细胞群体。绘制抗原 PE 与抗原 APC 的散点图，并将 R8 门设定为抗原 PE 阳性且 APC 阳性的象限，双阳性门中的事件数应较少。
随后，将单个CD19阳性、CD27阳性、抗原PE阳性、抗原APC阳性的细胞分选至已预先加入主混合液的96孔板的各个孔中。分选结束后，用铝箔封板膜覆盖板孔，并在400 × g条件下离心1分钟，随后于-80 °C保存。进行逆转录反应时，先将分选后的B细胞置于冰上解冻2分钟，然后以3300 × g离心2分钟，使孔内液体沉降至板底，再打开封膜。
用适当的酶Master Mix处理细胞后，每个PCR反应中加入2.5微升互补DNA作为模板，并加入引物使每个反应的终浓度达到1微摩尔。然后，向每个反应孔中加入2倍浓度的10倍聚合酶缓冲液，使每个反应的终体积达到25微升。随后，重链和轻链PCR反应均进行50个循环。
反应结束后，将样品在1%琼脂糖凝胶上电泳，以观察阳性扩增结果。通过凝胶回收法从同一细胞中分离配对的重链和轻链扩增产物。通过光密度测定DNA片段浓度至60，以准确计算连接反应体系。
按照制造商的说明，使用四片段连接反应将回收的重链和轻链片段与连接子片段及表达载体骨架进行连接。然后按照制造商的说明，将连接反应产物转化至感受态细菌中。接种至含抗生素的平板后，向剩余的转化菌液中加入四毫升含抗生素的培养基，在37摄氏度、每分钟250转的条件下过夜培养。
第二天早晨，根据试剂盒说明书，从过夜连接反应的菌液中制备质粒DNA小量提取物，并测定所得质粒DNA的浓度。为验证所分离抗体的抗原特异性，将10微克质粒DNA提取物与阳离子脂质转染试剂共同转染至含有293细胞的10毫升悬浮液中。将细胞培养物在37摄氏度、8%二氧化碳及125转/分钟的条件下孵育3至4天。
孵育结束后，将培养物在1000 × g条件下离心10分钟，收集澄清的上清液。通过蛋白A亲和法测定上清液中的IgG浓度，并根据标准ELISA操作流程，使用上清液中浓度为25 µg/mL的抗体，针对分选时所用的各个肽段进行ELISA检测。随后，通过额外的ELISA实验验证初筛阳性结果，对IgG上清液进行系列稀释，起始浓度为20 µg/mL，绘制针对各抗原的浓度-吸光度曲线，以确认其在初筛ELISA中的反应性。
为了从人类供体中分离抗原特异性抗体，可设计一系列流式细胞术门控策略以分离目标记忆B细胞。首先根据细胞大小和颗粒度，利用前向散射和侧向散射分离淋巴细胞。在排除双联体细胞和死细胞后，通过表型标志物进一步区分IgG阳性CD19阳性B细胞和CD27阳性记忆B细胞。
单细胞克隆的首次检测结果是确认相应重链和轻链可变区的扩增情况。此处展示了一个从24个单细胞中进行高效扩增的示例，PCR后配对回收率为42%。在完成IgG克隆后，将IgG表达载体转染至人胚胎肾293细胞中。
回收的抗体通过ELISA法对原始Tau多肽组进行筛选，根据反应性进行评分。随后，使用相同重组抗体样品对初筛中鉴定出的多肽进行浓度梯度实验，以进一步确认结果。对于每个阳性信号，可从转化后的文库中分离出单个质粒克隆，并通过相同的ELISA方法重新验证。
目标是从单个细胞扩增序列，因此需要牢记的最重要事项是，任何污染都会在此实验的PCR步骤中被扩增。该实验流程可获得完整的人源重组抗体，从而能够纯化并进行功能表征，抗体产量可根据需要任意制备。
概述
BSelex 方法能够从人外周血单个核细胞中识别并回收特异性抗原抗体。该技术结合了流式细胞术、单细胞 PCR 及克隆，可实现对免疫组库的深入分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 抗体工程
背景
- 了解免疫组库对于鉴定稀有B细胞至关重要。
- 抗原特异性B细胞可为免疫应答提供重要见解。
- 克隆重链和轻链的能力对抗体开发至关重要。
- 流式细胞术是分离特定细胞群体的关键工具。
研究目的
- 建立一种从人类供体中分离抗原特异性B细胞的方法。
- 实现针对特定抗原的抗体的快速克隆与检测。
- 提高从单个细胞中回收抗体的效率。
使用的方法
- 使用磁珠分离 CD22 阳性 B 细胞。
- 通过流式细胞术分选抗原特异性 B 细胞。
- 单细胞 PCR 扩增重链和轻链。
- 转染 293 细胞以表达和检测抗体。
主要结果
- 已成功实现抗原特异性B细胞的分离。
- 高效回收配对的重链和轻链。
- 通过ELISA验证抗体特异性。
- 建立了可靠的抗体克隆方案。
结论
- BSelex 方法在鉴定特异性抗体方面具有显著效果。
- 该方法可提升抗体发现的效率与能力。
- 未来应用可能包括治疗性抗体的开发。
常见问题
行业重要性概要
该方法能够直接分析人类免疫组库，以鉴定稀有的抗原特异性B细胞，从而在序列水平的组库数据与治疗性抗体发现之间建立功能性桥梁。通过从单个记忆B细胞中回收天然配对的重链和轻链序列，该方法可支持早期靶点验证和先导分子的鉴定，并提高预测的可信度。该策略在生理相关的临床背景下将抗原特异性与功能验证相连接，对于降低抗体候选分子的风险尤为有价值。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够对人类抗体库进行功能性分析，从而基于抗原特异性B细胞的频率和特异性来验证治疗假说。
- 操作价值：在表型B细胞标志物与功能性抗体产出之间建立直接关联，减少对预测算法的单独依赖。
- 预测价值：获得可直接用于表达的成对可变区序列，加快从序列筛选到功能验证的转化进程。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过基于ELISA的定量检测，评估抗体对特定抗原组合的反应性与特异性。
- 操作价值：以适合高通量筛选和重组表达的形式，产生克隆的抗体片段。
- 检测就绪性：建立标准化的工作流程，用于从人源初级样本中分离和验证抗原特异性抗体。
转化与临床前研究
- 转化连续性：利用人源B细胞生成具有天然人源序列兼容性的抗体，降低后续阶段的工程化负担。
- 生物标志物关联：可将抗体特异性与供体免疫状态相匹配，支持免疫谱型分析中的生物标志物发现工作。
- 临床前降险：通过正交ELISA验证确认抗原特异性，提高在动物模型测试前对候选分子的信心。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，可支持从免疫组库分析到通过克隆抗体产物的功能验证进行先导分子筛选的全过程。
- 发现生物学：通过关联抗原暴露与B细胞克隆扩增及抗体分泌潜能，支持假设验证。
- 筛选：通过ELISA提供标准化、定量的抗原结合数据，实现不同克隆分离株之间的比较。
- 分析：提供配对的重链和轻链序列以及浓度依赖性结合数据，用于比较分析和候选分子筛选。
- 转化研究：利用人原代细胞生成具有天然配对的抗体，提高与人类免疫应答的相关性。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于在多个供体和研究中探究对抗原、疫苗或自身免疫靶标的免疫应答。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在单细胞水平上确认具有天然链配对的抗原特异性，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：标准化抗原特异性抗体的分离与克隆流程，提升不同操作人员和实验室之间的可重复性。
- 战略价值：优先选择具有已确认的人源特异性和功能性的抗体，降低先导优化阶段的失败风险。
- 项目组合影响：基于来自生理相关来源的功能筛选结果，实现对抗体候选分子的数据驱动型优先排序。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术、单细胞分选和分子克隆技术方面的专业知识。
- 依赖于细胞分选仪、PCR设备以及重组表达系统（例如293细胞）的可及性。
- 需要标准化的试剂组合和设门策略，以确保在不同实验中稳定地分离抗原特异性B细胞。
- 在实验设计中必须考虑供体间记忆B细胞频率及对抗原反应性的个体差异。
- 仅限于IgG记忆B细胞，除非进行方法改良，否则不包括初始B细胞或其他抗体同种型。
