Name: JoVE 方法系列亮点：蛋白质-蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 52 s
Description: 了解蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法与技术应用。本视频系列展示多种实验策略，帮助科研人员深入探索分子互作机制，为结构生物学和药物开发提供重要参考。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢 NSERC RGPIN-2018-04994、阿尔伯塔省校园创新计划 （RCP-12-002C） 和阿尔伯塔省朊病毒研究所/阿尔伯塔省创新生物解决方案 （201600018） 授予 M.O. 的赠款。

<ol><li>Jin, L., Wang, W., Fang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein-protein+interaction+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Targeting protein-protein interaction by small molecules.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 54, 435-456 (2014).</li>
<li>Titeca, K., Lemmens, I., Tavernier, J., Eyckerman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+cellular+protein-protein+interactions%3A+Technological+strategies+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Discovering cellular protein-protein interactions: Technological strategies and opportunities.</a> Mass Spectrometry Reviews. 38 (1), 79-111 (2019).</li>
<li>Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Cyclin-dependent+Kinase+1+Specific+Phosphorylation+Sites+by+an+In+Vitro+Kinase+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-immunoprecipitation+Assay+Using+Endogenous+Nuclear+Proteins+from+Cells+Cultured+Under+Hypoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57836(2018).</li>
<li>Nolan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration-free+Vitro+of+Protein+Homo-oligomerization+Using+Commercial+Instrumentation+and+Free%2C+Open+Source+Brightness+Analysis+Software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Calibration-free Vitro of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58157(2018).</li>
<li>Luzarowski, M., Wojciechowska, I., Skirycz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2+in+1%3A+One-step+Affinity+Purification+for+the+Parallel+Analysis+of+Protein-Protein+and+Protein-Metabolite+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57720(2018).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Heterodimerization+of+Protein+Isoforms+Using+an+Situ+Ligation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an Situ Ligation Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57755(2018).</li>
<li>Winkelaar, G., Trieber, C., Kumar, J., Overduin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Interactions+of+Globular+and+Filamentous+Proteins+by+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy+%28NMR%29+and+Microscale+Thermophoresis+%28MST%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST).</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58537(2018).</li>
<li>Mrozowich, T., McLennan, S., Overduin, M., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Macromolecules+in+Solution+using+Small+Angle+X-Ray+Scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58538(2018).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (19), 6959-6964 (2008).</li>
<li>Lundberg, E., Borner, G. H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+proteomics%3A+a+powerful+discovery+tool+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial proteomics: a powerful discovery tool for cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 是产生生物效应的基础。许多药物与疾病密切相关，并且越来越被认为是药物行动的重要靶点1。有许多技术可用于研究这些蛋白质相互作用，其中一些在本集合或其他 JoVE 文章中进行了讨论。每种技术都有其自身的优点和局限性2;然而，由于这些相互作用发生在不同的亚细胞区室中，具有广泛的亲和力（皮摩尔到毫摩尔），并且本质上可能只是瞬态的，因此没有一种完美的技术适用于所有 PPI。
体外激酶测定是研究 PPI 的一种间接方法，可用于分析激酶如何发挥其将磷酸基团从 ATP 转移到底物的功能作用。Cui等人3 使用该技术，结合胰蛋白酶消化和质谱法，鉴定人着丝粒蛋白F（CENP-F）片段上的细胞周期蛋白依赖性激酶-1特异性磷酸化位点。为了验证新的磷酸化位点的功能，作者使用结合测定法，将含有拟磷酸化突变的 CENP-F 和核转运受体核粘蛋白 α 结合起来，从而提供交叉验证。
免疫共沉淀是一种广泛使用的 PPI 研究方法，其中使用抗体捕获特定靶标以及与之相关的任何其他蛋白质分子。Zheng 及其同事4 应用该技术来研究缺氧诱导因子 （HIF），这些因子作为异二聚体，由氧调节的 α 亚基和组成型表达的 β 亚基（也称为 ARNT3）组成。关于他们的方案的一个有趣的注意事项是，细胞在缺氧条件下被诱导和收获，然后来自核组分的内源性蛋白质被免疫共沉淀。正如作者所指出的，该方法的一个局限性是它无法确定 PPI 是直接的还是间接的。
Nolan等人5 提出了一种用于测量荧光显微镜图像“数量和亮度”（N&B）中分子数量及其亮度的方案，该方案可用于检测蛋白质同源寡聚化。该技术可用于体外和体内，并已应用于准确定量添加二聚化药物前后mVenus标记FKBP12F36V的寡聚状态。作者讨论了该技术相对于相关技术的优点，并强调了校正漂白和长期强度波动的重要性。配备数字检测器的共聚焦显微镜使定量更容易，但模拟检测器也可以进行 N&B。
多蛋白复合物的亲和纯化及其组分的鉴定已成为了解此类复合蛋白功能的广泛使用的技术。在Luzarowski等人6的方案中，通过同时表征转基因拟南芥植物细胞中的PPI和蛋白质-代谢物相互作用（PMI），该技术更进一步。标记的核苷二磷酸激酶通过串联亲和纯化 （TAP） 标签程序进行亲和纯化，捕获的蛋白质和小分子随后通过质谱法进行鉴定。该协议的独特之处在于能够识别疏水性和亲水性配体;它是一种三合一提取方案，可以研究 PPI 和 PMI，并将亲和纯化应用于细胞的种植。
邻近连接测定的优点是用于检测细胞和组织中内源性蛋白质之间的相互作用。Karchugina 和 Chernoff7 使用该技术显示人雪旺细胞 （HSC） 和人胚胎肾细胞 （HEK-293） 中激酶 MST1 和 MST2 的异二聚体的存在。他们的文章提供了一些关于如何成功执行该技术的宝贵建议。需要针对每种相互作用的蛋白质在不同物种中产生的适当的一抗，并且由于抗体的特异性和灵敏性是关键，因此应微调抗体浓度。作者发现玻璃室载玻片便于分析多种细胞系和抗体组合，但指出必须去除孔之间的所有硅胶插入物，以避免显微镜检查期间共聚焦距离的差异。此外，还使用各种阳性和阴性对照来验证结果。
核磁共振 （NMR） 波谱是一种灵敏的测定方法，可用于提供有关蛋白质相互作用和蛋白质-配体相互作用的原子级分辨率和定量信息。Winkelaar 及其同事8 使用该技术研究了桥粒中发现的两种蛋白质（波形蛋白和 envoplakin）的相互作用，桥粒是参与细胞间粘附的细胞结构，通常存在于承受强烈机械应力的组织中。作者使用 15个N标记的波形蛋白结构域，并使用异核单量子相关（HSQC）获取二维光谱。在存在来自 envoplakin 的结构域的情况下，观察到广泛的线拓宽和峰消失，这与蛋白质相互作用一致。作者进一步使用诱变和微尺度热泳（MST）来探索相互作用的基础，以提供定量信息。
小角度 X 射线散射 （SAXS） 是一种技术，可用于提供有关溶液中大分子的大小和构象的信息，并以低分辨率生成大型、多结构域或蛋白质复合物的分子包膜。在Mrozowich等人9的方案中，该技术用于生成nidogen-1和层粘连蛋白γ-1复合物的低分辨率结构。该技术可能会引起研究人员对研究具有多个球状结构域的大蛋白质中的 PPI 感兴趣，这些结构域对于 NMR 波谱来说太大，并且难以结晶用于 X 射线晶体学。
据估计，人类相互作用组10 中约有 650,000 次相互作用，足以让该领域的研究人员在未来一段时间内忙碌起来。由于显微镜、质谱和机器学习的进步，空间蛋白质组学的最新发展成为可能，它可能会在未来为该领域提供深刻的见解11。这一系列 PPI 方法将帮助研究人员应对这一重要挑战，同时避免潜在的陷阱。

jove 方法系列亮点：蛋白质-蛋白质相互作用

JoVE Methods Collection Highlights: Protein-Protein Interactions

JoVE 方法系列亮点：蛋白质-蛋白质相互作用

jove-methods-collection-highlights-protein-protein-interactions

Without Section

了解蛋白质-蛋白质相互作用的研究方法与技术应用。本视频系列展示多种实验策略，帮助科研人员深入探索分子互作机制，为结构生物学和药物开发提供重要参考。

JoVE 方法系列亮点：蛋白质-蛋白质相互作用

探索更多视频