Name: 使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: 学习使用免疫共沉淀和Western Blot等生化技术表征新型激酶蛋白，通过P32-ATP标记检测其激酶活性，并分析蛋白质相互作用网络。该方法有助于揭示疾病相关信号通路。

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本工作由法国抗癌联盟（La Ligue contre le Cancer）、神经纤维瘤病与雷克林豪森协会（Association Neurofibromatoses et Recklinghausen）以及中央-卢瓦尔河谷大区（la Région Centre Val de Loire）资助。衷心感谢Aurélie Cosson和Déborah Casas提供的流式细胞术数据，以及Keyron Hickman-Lewis对稿件的细致校对。

1. 转染用细胞的制备
警告：细胞培养的所有步骤必须在专用实验室中进行，且细胞操作需在二级生物安全柜内完成。
<ol>
	<li>在 Ø 10 cm 培养皿中接种 HEK-293（人胚胎肾）细胞，加入 10 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），并添加 10% 胎牛血清。在 5% CO2、37 °C 条件下培养 3 至 5 天，直至细胞融合度达到约 90%。</li>
	<li>使用 Collagen R 处理 Ø 10 cm 培养皿，以增强细胞在塑料培养皿表面的黏附性。
	<ol>
		<li>在 Ø 10 cm 培养皿中加入 5 mL Collagen R 溶液（用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释 200 倍），并将液体均匀覆盖整个培养皿表面。</li>
		<li>在生物安全柜内室温孵育至少 1 小时。</li>
		<li>移除胶原溶液并弃去。加入 5 mL PBS，使其覆盖整个培养皿表面，随后移除并弃去。重复该洗涤步骤一次。</li>
		<li>加入 8 mL 添加了 10% 胎牛血清的 DMEM。将处理好的培养皿保留在生物安全柜内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在生物安全柜内取出步骤 1.1 中的 HEK-293 培养皿。移除培养基，并将其弃入专用的含氯消毒废液容器中。加入 2 mL 添加了血清的 DMEM，使用 1 mL 微量移液器的液流轻轻冲洗细胞，使其脱离培养皿表面，注意避免产生气泡。</li>
	<li>将细胞收集至 15 mL 离心管中，并加入 4 mL 添加了血清的 DMEM。使用 10 mL 移液器上下吹打 3 次，混匀细胞悬液。</li>
	<li>取 2 mL 上述细胞悬液，加入步骤 1.2.4 中已用胶原处理并含有添加血清 DMEM 的培养皿中。</li>
	<li>在 5% CO2、37 °C 的培养箱中培养 24 小时。转染时，细胞融合度应达到 50–80%。</li>
</ol>
2. 瞬时转染
<ol>
	<li>从培养板中移除培养基，将其弃置于专用的含氯消毒废弃物容器中，并加入 10 mL 新鲜的完全 DMEM 培养基。将培养板放回 37 °C 培养箱中，同时开始准备转染混合物。</li>
	<li>在 15 mL 离心管中，加入 450 μL 的 10 mM Tris-HCl pH 7.5 / 1 mM EDTA 溶液（Tris 为三（羟甲基）氨基甲烷，EDTA 为乙二胺四乙酸）和 50 μL 的 2.5 M CaCl2 溶液。通过轻柔颠倒混匀。</li>
	<li>加入 10 μg 通过中量制备法从转化了特定质粒的细菌液体培养物中提取的质粒 DNA（Deoxyribonucleic acid）。再次通过轻柔颠倒混匀。</li>
	<li>在涡旋振荡器上轻柔振荡的同时，缓慢逐滴加入 500 μL 的 2× BES 缓冲盐溶液（成分：BES 10.7 g/L，NaCl 16.0 g/L，Na2HPO4 0.27 g/L；BES 为 N,N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸，N,N-双（2-羟乙基）牛磺酸）。</li>
	<li>在生物安全柜中室温孵育至少 15 分钟（最长可达 45 分钟）。切勿涡旋或进一步混合！操作时务必轻拿轻放，避免干扰 DNA 与磷酸钙复合物的形成。</li>
	<li>将步骤 2.1 中的培养板移至生物安全柜中。将 DNA 复合物小心地逐滴均匀加入培养板表面的细胞中。</li>
	<li>在 37 °C 培养箱中继续孵育 24 至 72 小时。通常蛋白表达量在 48 小时内达到峰值。</li>
</ol>
3. 裂解
注意：操作需在冰上进行，并使用预冷的缓冲液，以防止蛋白质降解。
<ol>
	<li>配制裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、100 mM NaCl、5 mM EDTA、0.1% Triton X-100、50 mM NaF、10 mM 焦磷酸钠、1 mM Na3VO4、20 mM 对硝基苯基磷酸盐、20 mM β-甘油磷酸钠、10 μg/mL 抑肽酶、0.05 μg/mL 冈田酸、1 μg/mL 亮抑蛋白酶肽和 1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）。每块转染的培养板约需 4 mL 裂解缓冲液。</li>
	<li>从培养箱中取出转染细胞的培养板，置于冰上。 
	注意：从本步骤起，可在普通实验台上操作。</li>
	<li>吸除培养基，并将其弃入专用的含漂白剂废液容器中。</li>
	<li>用 3 mL 冷 PBS 洗涤两次：将 3 mL PBS 沿培养板壁逐滴加入，避免冲落转染细胞，使 PBS 覆盖整个培养板表面，吸除 PBS 并弃去；重复此步骤一次。最后，将培养板倾斜，小心吸除残留的 PBS，以防止下一步裂解缓冲液被稀释。</li>
	<li>向洗涤后的转染细胞中加入 500 μL 冷裂解缓冲液，使其均匀覆盖培养板表面。</li>
	<li>冰上孵育 10 分钟，期间至少两次重新将缓冲液均匀铺展于培养板表面。</li>
	<li>刮取细胞，并收集至微量离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的微量离心管中。此组分即为裂解物（全细胞提取物）。弃去沉淀（细胞膜碎片）。</li>
	<li>取部分该组分（约 50 μL）转移至新的微量离心管中。此组分称为“总组分”或“细胞裂解物”或“全细胞提取物”，可用于 Western Blot 检测转染蛋白是否表达。 
	注意：此时样品可直接用于 Western Blot 分析。需向样品中加入 Laemmli 缓冲液&#160;，然后在 95 °C 加热 5 分钟，再以 10,000 × g 离心 5 分钟，最后上样至适当的 SDS-PAGE 凝胶。样品也可在 -80 °C 保存。</li>
</ol>
4. 免疫沉淀
<ol>
	<li>轻轻倒置含有相应抗体的琼脂糖珠，抗体包括：HA（人流感血凝素）、Flag 或 GFP（绿色荧光蛋白），通过缓慢翻转混匀。</li>
	<li>剪去200 μL移液枪头的尖端，以便珠子进入枪头。反复吹打数次，使珠子充分润湿枪头，确保准确吸取所需体积的珠子。</li>
	<li>取40 μL珠子加入微量离心管中。</li>
	<li>加入500 μL TENET缓冲液（30 mM Tris-HCl pH 7.5，120 mM NaCl，5 mM EDTA，1% Triton X-100），通过倒置混匀。在4 °C下以1,000 × g离心2分钟。小心移除上清并弃去。再加入500 μL TENET缓冲液，在4 °C旋转仪上孵育至少1小时。 
	注意：此步在TENET缓冲液中的预孵育可减少非特异性相互作用，从而降低背景信号。</li>
	<li>用500 μL裂解缓冲液将珠子洗涤两次。
	<ol>
		<li>在4 °C下以1,000 × g离心2分钟。</li>
		<li>小心移除上清缓冲液，并弃去。 
		注意：在洗涤过程中注意避免吸走珠子。</li>
		<li>加入500 μL裂解缓冲液，通过倒置试管混匀。</li>
		<li>重复步骤4.5.1–4.5.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C下以1,000 × g离心2分钟。小心移除上清缓冲液，并弃去。</li>
	<li>将珠子与步骤3.9中获得的裂解液在4 °C旋转仪上孵育2至4小时。</li>
	<li>洗涤免疫沉淀后的珠子。 
	注意：此时可将免疫沉淀珠子用裂解缓冲液洗涤五次，然后用Laemmli缓冲液洗脱。洗脱液可用于Western Blot分析，或于-80 °C保存。或者，珠子可先用裂解缓冲液洗涤两次，再用激酶缓冲液洗涤三次，用于γ[32P] ATP标记实验。</li>
</ol>
5. 免疫共沉淀分析
<ol>
	<li>用裂解缓冲液洗涤第 4.7 步中获得的免疫沉淀珠。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，于预冷的离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>小心移去上清液，并弃去。</li>
		<li>加入 500 μL 裂解缓冲液，通过倒置离心管进行混匀。</li>
		<li>重复步骤 5.1.1–5.1.3 共四次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗脱
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，于预冷的离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>小心移去上清液，并弃去；使用 Hamilton 注射器吸除残留的少量上清液，避免吸出珠粒，并将上清液弃去。</li>
		<li>加入 40 μL 4× Laemmli 缓冲液（200 mM Tris/HCl pH 6.8，4% SDS，40% 甘油，0.5 M β-巯基乙醇，0.02% 溴酚蓝），通过轻弹离心管进行混匀。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>使用 Hamilton 注射器将上清液移出，并收集至新的微量离心管中。此组分为“洗脱液”，可于 -80 °C 保存，或直接用于 Western Blot 分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 激酶活性检测
<ol>
	<li>配制激酶缓冲液：50 mM HEPES-NaOH（pH 7.5，HEPES 是 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸的缩写），150 mM NaCl，5 mM MgCl2，5 mM MnCl2，50 mM NaF，1 mM Na3VO4，20 mM β-甘油磷酸钠，1 μg/mL 亮抑酶肽（leupeptin）和 1 mM PMSF。每种免疫沉淀条件约需 2 mL 激酶缓冲液。</li>
	<li>用 500 μL 裂解缓冲液将第 4.7 步获得的免疫沉淀珠洗涤两次。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，于预冷的离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>小心吸去上清液并弃去。加入 500 μL 裂解缓冲液，通过倒置混匀。</li>
		<li>重复步骤 6.2.1 和 6.2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 500 μL 激酶缓冲液将免疫沉淀珠洗涤三次。
	<ol>
		<li>在 4 °C 条件下，于预冷的离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟。</li>
		<li>小心吸去上清液并弃去。加入 500 μL 激酶缓冲液，通过倒置混匀。</li>
		<li>重复步骤 6.3.1 和 6.3.2 两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下，于预冷的离心机中以 1,000 × g 离心 2 分钟。</li>
	<li>小心吸去上清液并弃去。使用 Hamilton 注射器吸除残留的少量上清液，以避免吸走珠子，并将上清液弃去。</li>
	<li>向免疫沉淀珠中加入 40 μL 激酶缓冲液。通过轻弹管壁使珠子重悬。</li>
	<li>在防污染管（safe lock-tube）中配制用于 γ[32P] ATP 标记的反应混合液（终体积为 22.5 μL，用激酶缓冲液补足）。
	<ol>
		<li>加入适量激酶缓冲液，使终体积达到 22.5 μL。</li>
		<li>剪去 20 μL 移液枪头的末端。通过反复吹打使第 6.6 步的免疫沉淀珠充分重悬，并吸取 10 μL 至防污染管中。</li>
		<li>加入 ATP 储存液（10 μM）至终浓度为 50 mM。根据处理的样品数量，建议将 ATP 储存液用激酶缓冲液稀释，以便移取 1–2 μL 体积，确保准确性。</li>
		<li>加入 2.5 μg 底物（本研究中为 cofilin 或髓鞘碱性蛋白 MBP）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 5 μCi γ[32P] ATP（3,000 Ci/mmol）以启动反应。通过缓慢吹打混匀。 
	注意：自此步骤起，所有操作必须在专用于放射性物质操作的安全场所进行，采取谨慎防护措施，包括使用专用防护设备和适当控制手段（如放射屏蔽装置、盖革计数器、专用放射性废物收集容器、用于检测放射暴露的个人胸牌和指环剂量计，以及带滤芯的移液枪头）。</li>
	<li>在 30 °C 下孵育 20 分钟。</li>
	<li>加入 6 μL 5× Laemmli 缓冲液终止反应。</li>
	<li>在 95 °C 下加热 5 分钟。</li>
	<li>在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将样品上样至 SDS-PAGE 凝胶，进行电泳。 
	注意：注意确保游离的 γ[32P] ATP 前沿不超出凝胶范围，以防迁移槽污染。</li>
	<li>在室温下对凝胶进行染色。
	<ol>
		<li>将凝胶从玻璃板间取出。</li>
		<li>在室温下用去离子水漂洗三次。</li>
		<li>在室温下用考马斯亮蓝染色过夜。</li>
		<li>在室温下用去离子水多次漂洗脱色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用保鲜膜包裹凝胶。</li>
	<li>在磷屏成像仪（phosphorimager）屏幕上曝光一晚或更长时间。</li>
	<li>使用磷屏成像仪读取信号，检测标记的条带。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文中，我们利用可靠的生化工具在分子水平上表征了一种新的蛋白质LIMK2-1，该蛋白质根据其序列及其同源蛋白LIMK2a和LIMK2b20，被认为是一种激酶。
首先，我们利用特异性抗体通过蛋白质印迹分析在蛋白质水平上证实了LIMK2-1的存在。随后，我们评估了其与上游激酶ROCK1的相互作用，ROCK1已知可调控LIMK2-1的同源蛋白LIMK2a和LIMK2b。最后，我们通过体外γ[32P] ATP标记实验以及使用特异性磷酸化抗体的细胞内蛋白质印迹法，评估了LIMK2-1潜在的激酶活性。
裂解缓冲液组成 
在研究蛋白质并对其进行 Western Blot 分析时，需特别注意裂解缓冲液的组成。需要考虑多个参数：（i）去垢剂的类型和浓度21，以及（ii）蛋白酶抑制剂。
裂解缓冲液的组成必须根据目标蛋白进行调整，以促进其尽可能完全地...

几十年来，人们已阐明了众多信号通路，并揭示了它们在细胞分裂、分化、运动、程序性细胞死亡、免疫和神经生物学等关键细胞过程中的作用。激酶在这些信号通路中发挥着重要作用，因为它们通常精细地调控通路的激活或失活，并参与响应外界刺激的瞬时多功能复合物1,2,3。激酶的突变和失调常导致人类疾病，因此在过去的四十年中，它们已成为最重要的药物靶点之一4。
在这一背景下，能够检测激酶与其上游调控因子或下游底物之间的相互作用，并鉴定新的相互作用伙伴，显得尤为重要。亲和纯化和免疫沉淀是分离蛋白质复合物的强有力技术5。诱饵蛋白或激酶可被标记上特定的肽序列，从而利用商品化的磁珠，这些磁珠共价偶联了针对该肽段的抗体。这种方法可显著提高实验的可重复性6,7,8。内源性蛋白也可通过直接靶向诱饵蛋白的抗体进行免疫沉淀。抗体可交联至蛋白A或蛋白G琼脂糖磁珠，或在加入裂解液前简单地与这些磁珠共同孵育。裂解缓冲液必须经过优化，以确保在不破坏蛋白相互作用的前提下实现蛋白的溶解，同时避免蛋白降解。该方法的一个主要缺点是相互作用是在细胞裂解后检测的，因此可能遗漏瞬时或较弱的相互作用，以及依赖于亚细胞环境的相互作用。其他可在细胞内直接开展的技术包括邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）9、体内交联辅助亲和纯化（in vivo cross-linking-assisted affinity purification, XAP）10、生物发光共振能量转移（Bioluminescence Resonance Energy Transfer, BRET）或福斯特共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer, FRET）11,12。此外，免疫沉淀不适用于测定结合反应的热力学常数，此类参数需借助表面等离子体共振、等温滴定 calorimetry 或微尺度热泳等物理技术来完成13,14。
激酶活性可通过多种技术进行评估。本文重点介绍磷酸化位点特异性抗体和体外γ[32P] ATP（三磷酸腺苷）标记法。磷酸化位点特异性抗体可特异性识别蛋白质中特定氨基酸残基的磷酸化修饰，可用于细胞裂解后的Western Blot或ELISA（酶联免疫吸附测定）、免疫组织化学，以及通过流式细胞术或免疫荧光对完整细胞进行检测。这类抗体的局限性可能包括特异性不足，可通过使用靶蛋白的突变体进行验证，此外并非所有蛋白均有 commercially available 的特异性抗体。体外γ[32P] ATP标记法是一种非常稳健、成熟且高度敏感的方法15。该方法可使用免疫沉淀或重组蛋白，并可测试不同的底物，还可定量评估药物的作用效果。其主要缺点是该方法涉及放射性物质，需谨慎操作。其他替代方法基于荧光或化学发光肽底物的检测，利用磷酸化后荧光/发光性质的改变进行测定。此类方法同样可实现高通量检测，适用于例如筛选可能作为靶标激酶抑制剂的化合物。事实上，激酶是制药公司研发药物时最主要的目标蛋白类别之一16。
在本研究中，我们聚焦于 LIMK2-1 蛋白（LIMK2-1 代表 Lin11、Isle1、Mec3 激酶亚型 2-1）。LIMK2 激酶蛋白最早于 1995 年被报道17。通过选择性剪接可产生三种 LIMK2 亚型：LIMK2a、LIMK2b 和 LIMK2-1。目前，LIMK2-1 仅在一项研究中于 mRNA 水平被描述过18。本文中，我们采用严谨的生物化学方法，在分子水平上对这一潜在的新激酶蛋白进行了表征。首先，我们证实 LIMK2-1 确实能够被合成。与另外两种亚型 LIMK2a 和 LIMK2b 相似，LIMK2-1 也能与上游激酶 ROCK（Rho 相关蛋白激酶）发生相互作用。我们发现 LIMK2-1 能够对髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）产生激酶活性，但不能作用于 cofilin——后者是 LIM 激酶的经典底物。

<table><tbody><tr><td>抗肌动蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1978</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗c-Myc抗体</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-21316</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗cofilin抗体</td><td>Cell signaling Technology</td><td>3312/5175</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9996</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗HA抗体</td><td>Roche Applied Science</td><td>11687423001</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗磷酸化cofilin抗体</td><td>Cell signaling Technology</td><td>3313</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抗PP1i抗体</td><td>Eurogentec</td><td>本研究特异性设计</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Euromedex</td><td>A-162B</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>PV3227</td><td>用于&amp;#947;[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]标记</td></tr><tr><td>&amp;#947;[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG502A</td><td>用于&amp;#947;[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]标记</td></tr><tr><td>BES缓冲盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14280</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>&amp;#946;-甘油磷酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>用于裂解缓冲液和激酶缓冲液</td></tr><tr><td>&amp;#946;-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>用于Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>用于封闭缓冲液</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>用于Laemmli缓冲液</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sigma</td><td>111-541</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶R</td><td>Pan Biotech</td><td>P06-20166</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>对照siRNA</td><td>Ambion</td><td>AM4611</td><td>用于验证PP1i抗体特异性</td></tr><tr><td>Coomassie PageBlue蛋白质染色液</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24620</td><td>用于凝胶染色</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3690</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>Biorad</td><td>Mini-Protean</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>EZview Red抗HA亲和凝胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6779</td><td>用于免疫共沉淀</td></tr><tr><td>GeneSys软件</td><td>Ozyme</td><td></td><td>用于蛋白质印迹图像采集</td></tr><tr><td>GeneTolls软件</td><td>Ozyme</td><td></td><td>用于蛋白质印迹定量分析</td></tr><tr><td>GFP-trap微珠</td><td>Chromtek</td><td></td><td>用于免疫共沉淀</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405</td><td>用于转膜缓冲液</td></tr><tr><td>GST-cofilin</td><td>Upstate Cell signaling</td><td>12-556</td><td>用于&amp;#947;[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]标记</td></tr><tr><td>Hamilton 100 mL注射器</td><td>Hamilton</td><td>710</td><td>用于小心移除微珠上清液而不吸走微珠</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>用于激酶缓冲液</td></tr><tr><td>ImageQuant TL软件</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>用于放射性信号采集与定量</td></tr><tr><td>LIMK2 siRNA</td><td>Ambion</td><td>s8191</td><td>用于验证PP1i抗体特异性</td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SP-04-2217</td><td>用于裂解缓冲液和激酶缓冲液</td></tr><tr><td>MBP</td><td>Upstate Cell signaling</td><td>13-173</td><td>用于&amp;#947;[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]标记</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>用于激酶缓冲液</td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td>用于激酶缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112</td><td>用于裂解缓冲液和激酶缓冲液</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1504</td><td>用于裂解缓冲液和激酶缓冲液</td></tr><tr><td>冈田酸</td><td>Euromedex</td><td>0-2220</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78830</td><td>用于裂解缓冲液和激酶缓冲液</td></tr><tr><td>对硝基苯磷酸盐</td><td>Euromedex</td><td>1026</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>PVDF膜 Immobillon-P</td><td>Merck-Millipore</td><td>IPVH00010 孔径 0.45 mm</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Labinco</td><td></td><td>用于微珠孵育</td></tr><tr><td>安全锁Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td>0030120.086</td><td>用于激酶活性检测</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5030</td><td>用于Laemmli缓冲液和电泳缓冲液</td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>LC Laboratories</td><td>S8507</td><td>用于裂解缓冲液和激酶缓冲液</td></tr><tr><td>焦磷酸钠</td><td>Fluka</td><td>71501</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Super Signal West Dura</td><td>Protein Biology</td><td>34075</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>Syngene Pxi</td><td>Ozyme</td><td></td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>组织提取物&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>Biochain&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td><td>P1234035 脑组织&lt;br/&gt; P12345152 肺组织&lt;br/&gt; P1234149 肝组织&lt;br/&gt; P1234188 胰腺组织&lt;br/&gt; P1234260 睾丸组织</td><td>用于蛋白质印迹分析&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>转膜装置</td><td>Biorad</td><td>Mini-Trans-Blot</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094 B</td><td>用于裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>用于封闭缓冲液</td></tr><tr><td>Typhoon FLA9500</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>用于读取放射自显影图像</td></tr><tr><td>Typhoon Trio</td><td>Amersham Bioscience</td><td></td><td>用于读取放射自显影图像</td></tr><tr><td>Whatman滤纸</td><td>GE Healthcare</td><td>3030-672</td><td>用于蛋白质印迹</td></tr></tbody></table>

利用稳健的生化方法对一种新型激酶蛋白进行分子水平表征

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

大规模全基因组测序已鉴定出许多开放阅读框（ORFs），这些开放阅读框编码大量潜在蛋白质。这些蛋白质可能在细胞中发挥重要作用，并揭示新的细胞过程。在各类蛋白质中，激酶是关键的调控因子，因为它们参与细胞信号转导通路，能够开启或关闭对细胞命运至关重要的多种过程，例如细胞生长、分裂、分化、运动以及死亡。
在本研究中，我们关注一种新的潜在激酶蛋白LIMK2-1。我们通过使用特异性抗体的Western Blot实验验证了其存在。我们采用共免疫沉淀实验评估了该蛋白与上游调控蛋白之间的相互作用。共免疫沉淀是一种非常强大的技术，能够检测两种目标蛋白之间的相互作用，也可用于发现诱饵蛋白的新结合伙伴。诱饵蛋白可通过其序列中设计的标签或特异性靶向该蛋白的抗体进行纯化。随后，这些蛋白复合物可通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离，并利用质谱技术进行鉴定。我们还利用免疫沉淀获得的LIMK2-1，通过γ[32P] ATP标记法在体外检测其激酶活性。这一成熟的方法可使用多种不同底物，也可利用诱饵蛋白的突变体来评估特定残基的功能。由于该技术具有高度敏感性和定量性，还可用于评估药理学试剂的作用。然而，放射性物质的操作需要特别谨慎。此外，也可使用特异性识别修饰氨基酸上磷酸基团的抗体来检测激酶活性。但这类抗体并非对所有磷酸化修饰的残基都有商业化产品。

LIMK2-1 蛋白的合成 
数据库中提到了 LIMK2-1，但迄今为止仅有一篇论文证实了其 mRNA 的存在18。与另外两个同源蛋白 LIMK2a 和 LIMK2b 相比，LIMK2-1 多出一个位于 C 末端的结构域，该结构域被鉴定为蛋白磷酸酶 1 抑制结构域（PP1i）。我们设计了一种抗体，靶向该结构域中的一个肽段（氨基酸 671–684）（图 1A）。 
针对人类蛋白质数据库进行的 BLAST 分析显示，仅有一种蛋白 PHI-1（蛋白磷酸酶全酶抑制因子 1）与该 12 个氨基酸序列具有较高的序列相似性。然而，PHI-1 在 SDS-PAGE 凝胶上的迁移分子量约为 23 kDa，远低于 LIMK2-1 预期的迁移位置（约 75 kDa），因此两者不应发生交叉干扰。我们首先在转染了 LIMK2-1、LIMK2a 或 LIMK2b 的 HEK-293 细胞中对该抗体进行了验证，结果显示抗 PP1i 抗体能够识别转染的...

我们采用严谨的生化方法表征了一种新的激酶蛋白：利用特异性抗体在不同细胞系和组织中进行蛋白质印迹分析，通过共免疫沉淀实验检测其相互作用，通过蛋白质印迹结合磷酸化特异性抗体以及γ[32P] ATP标记法检测激酶活性。

大规模全基因组测序已鉴定出大量开放阅读框（ORFs），这些开放阅读框编码许多潜在蛋白质。这些蛋白质可能具有重要功能……

免疫沉淀是一种用于分离和纯化目标蛋白的强有力技术。在适宜条件下，蛋白质、调控因子或底物可能被共免疫沉淀，从而发现新的相互作用网络。也可评估免疫沉淀蛋白的活性。特别是可通过P32-ATP标记来检测激酶在不同底物上的活性。此外，可评估靶向参与疾病过程的激酶的抑制剂的活性。它们可能作为先导化合物用于开发新药。该方法可从哺乳动物扩展至酵母或细菌。这种技术并不十分困难。关键要点：务必设置阴性对照，以确保检测到的相互作用具有特异性；并仔细选择裂解条件，以维持分子间的相互作用及活性。细微的操作细节和手法对于该技术的成功至关重要，但这些内容在文章的材料与方法部分往往未被详细描述。本实验操作将由本实验室的技术员 Fabienne Godin 进行示范。在生物安全柜内的细胞培养室中准备好细胞后，使用10毫升移液管从培养板中移除培养基，并将其弃置到含有漂白剂的专用废液瓶中。然后，向每孔加入10毫升新鲜的含补充物的DMEM培养基，将培养板放回37摄氏度的培养箱中。为制备转染混合液，在一个15毫升离心管中加入450微升pH 7.5的10毫摩尔Tris盐酸溶液（含1毫摩尔EDTA），以及50微升2.5摩尔氯化钙溶液。通过倒置混匀。向离心管中加入相当于10微克血浆DNA的体积，该DNA经DNA中量提取试剂盒扩增，并用该试剂盒的洗脱缓冲液稀释，且其浓度已测定。倒置离心管以混匀。然后，在旋涡混合器上轻轻振荡，将500微升2倍浓缩的BES缓冲盐溶液逐滴缓慢加入离心管中。操作时需格外小心，避免干扰DNA与磷酸钙之间的复合物形成。室温下孵育至少15分钟，最长可至45分钟。现在，将培养板从培养箱转移至生物安全柜中。将预先配制好的DNA复合物逐滴均匀地加入到培养板表面的细胞中。随后在37摄氏度的培养箱中孵育24至72小时。为防止蛋白质降解，需在冰上配制裂解缓冲液，每块转染的培养板需准备 4 毫升裂解缓冲液。从培养箱中取出转染细胞的培养板，吸去培养基，并将其弃置到专用的含氯漂白剂废液瓶中。洗涤细胞时，将三毫升冷的 PBS 沿培养板壁逐滴加入，避免转染的细胞脱落。然后轻轻摇晃培养板，使缓冲液均匀覆盖整个表面。倾斜培养板以去除 PBS，并将其弃入废液瓶中。再重复洗涤一次。将培养板置于冰上。最后，小心吸除剩余的 PBS。接着，向转染并洗涤过的细胞中加入 500 µL 冷裂解缓冲液，使其均匀覆盖培养板表面，在冰上孵育 10 分钟。不时地，再次将缓冲液均匀铺满培养板表面。随后，使用细胞刮刀将细胞从表面刮下，并收集至微量离心管中。在 10,000 ×g 及 4 °C 条件下离心 10 分钟。将上清裂解液收集到新的微量离心管中，并取该组分的50微升等分试样至另一个新的微量离心管中。此等分试样将用于检测转染蛋白是否表达良好。将沉淀丢弃至垃圾桶中。首先，轻轻重悬与适当抗体偶联的琼脂糖微珠储备液。剪切200微升枪头的末端，使其形成一个1至2毫米的开口。将枪头连接至移液器，并吸取40微升溶液，使微珠进入枪头。用移液器将珠子上下吹打数次，以充分润洗吸头，确保珠子体积准确，然后将珠子转移至微量离心管中。加入 500 µL TNET 缓冲液，通过倒置混匀，于 1,000 ×g、4 °C 离心 2 分钟。小心去除上清液，再加入 500 µL TNET 缓冲液。在4°C条件下，于旋转仪上孵育至少一小时。然后，在4°C、1,000 × g 条件下离心2分钟，并用500 µL裂解缓冲液将磁珠上下颠倒洗涤两次。洗涤后，将先前收集的总组分裂解液转移至该管中，在4°C条件下于旋转仪上孵育2至4小时。现在，将含有免疫沉淀珠的离心管在4°C条件下以1,000 × g离心两分钟。用500微升裂解缓冲液上下颠倒并离心，重复洗涤珠子五次。洗涤珠子时，在移除上清液的过程中应注意不要过于接近珠子。否则，珠子将被吸走，实验结束时将不再有珠子残留。洗脱时，首先在 1,000 ×g 和 4 °C 条件下离心两分钟。使用 1 毫升微量移液器小心移除上清液。然后，使用带有固定针头的汉密尔顿注射器，吸除上清液的最后几滴，以避免吸入磁珠。接着，加入40 µL 4X Laemmli缓冲液。通过轻轻敲击离心管使其充分混匀。室温孵育5分钟。然后在室温下以10,000 × g离心5分钟。使用Hamilton注射器将上清液转移至新的微量离心管中。在 -80 摄氏度下保存。使用无标签的 LIMK 2-1 或带有 HA 标签的 LIMK 2 亚型之一转染 HEK-293 细胞。在不同条件下，LIMK 2-1 均表达良好。抗LIMK 2-1抗体不识别LIMK 2a和LIMK 2b亚型，且具有特异性，因为与转染对照小干扰RNA的细胞相比，转染LIMK2小干扰RNA的细胞中该抗体的信号减弱。在多种人源细胞系中，LIMK 2-1在HEK-293和HeLa细胞中表达，但在C6细胞中不表达。通过共免疫沉淀实验评估了LIMK2-1与上游激酶ROCK之间的相互作用。转染载体所编码的各种不同蛋白质均得到良好表达。LIMK2 的三种同工型以及 larp6 均被有效免疫沉淀。在洗脱液中检测到 ROCK，并且与 LIMK2 的三种同工型共免疫沉淀，但未与 larp6 共免疫沉淀。因此，所检测到的相互作用具有特异性。通过γ-P32 ATP标记检测共免疫沉淀的LIMK 2-1的激酶活性。LIMK 2-1不能磷酸化cofilin，但能够磷酸化髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）。在此实验中，LIMK 2-1可被高效地免疫沉淀。进行免疫共沉淀时，必须设置阴性对照，以确保相互作用的特异性。裂解缓冲液的成分需精心配制，以维持蛋白质间的相互作用及活性。免疫共沉淀后，可通过激酶活性检测来鉴定不同的底物。可轻松引入突变，以揭示特定残基的作用。也可开展功能研究，以理解新发现的相互作用的生理功能。细胞必须在生物安全柜内的专用培养室内进行培养。P32 ATP 需要特别小心处理。应使用屏蔽装置以防止辐射，配备盖革计数器，专用放射性废物收集容器，佩戴个人胸部和手指剂量计以检测放射性暴露，并使用带滤芯的吸头。

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科研

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Biochemistry

生物化学

使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征

富含亮氨酸重复序列的激酶2是一种大型多结构域激酶，其突变是帕金森病最常见的遗传病因。对该蛋白激酶活性的分析已被证明是理解其生物学功能及功能障碍的关键工具。本文中 体外...

检测LRRK2的激酶活性 体外

利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

蛋白质磷酸化是细胞解读和响应胞外环境信息的核心机制。本文介绍一种高通量筛选方案，利用从哺乳动物细胞中纯化的激酶，快速鉴定能够磷酸化特定底物（或底物群）的激酶。...

利用高通量筛选鉴定激酶-底物配对

蛋白激酶是一类高度进化的信号传导酶和支架蛋白，在细胞间和细胞内信号转导中起关键作用。本文介绍一种利用放射性标记的三磷酸腺苷（[γ-32P]...

使用放射性标记的ATP检测蛋白激酶活性

本方案描述了一种光遗传学策略，用于在细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性。该方法可在哺乳动物细胞培养以及多细胞活体生物（如Xenopus胚胎）中以高时空分辨率可逆地激活MAPK信号通路。...

光介导的细胞分化及Xenopus胚胎发育过程中丝裂原活化蛋白激酶通路的可逆调控

细胞周期蛋白依赖性激酶1（Cdk1）在细胞周期的G2期被激活，并调控多种细胞通路。本文介绍了一种 体外...

通过特异性鉴定细胞周期蛋白依赖性激酶1的磷酸化位点 体外 激酶活性检测

本实验方案的目的是对来自复杂生物样品（如细胞裂解液或组织匀浆）中的蛋白激酶CK2底物进行标记、富集和鉴定。该方法利用了CK2生物学特性的独特之处来实现这一目标。...

利用一种通用的生化方法鉴定新型CK2激酶底物

本文介绍了一种在头部固定的活动小鼠中可视化蛋白激酶A活性的方法。通过颅窗将改良的A激酶活性报告基因tAKARα在皮层神经元中表达并实现成像。利用双光子荧光寿命成像显微技术，在强制运动过程中体内可视化PKA活性。...

使用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性

本文介绍了一组用于表征与疾病相关的 RAF 家族激酶突变体的实用且可行的方法，包括体外激酶活性检测、RAF...

利用一套实用且可行的方法表征RAF家族激酶的疾病相关突变体

本文介绍了一种用于激酶抑制剂筛选的自组装人源蛋白质微阵列的详细制备方案。...

自组装人源蛋白微阵列中的激酶抑制剂筛选

学习使用免疫共沉淀和Western Blot等生化技术表征新型激酶蛋白，通过P32-ATP标记检测其激酶活性，并分析蛋白质相互作用网络。该方法有助于揭示疾病相关信号通路。

利用稳健的生化方法对一种新型激酶蛋白进行分子水平表征

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