使用新激酶蛋白的强生化方法在分子水平上进行表征
2019年6月30日
我们使用强大的生化方法对一种新的激酶蛋白进行了定性:用特殊抗体对不同细胞系和组织进行西带体分析,通过共免疫沉淀实验相互作用,由西方检测到的激酶活性使用磷特异性抗体和由 β+32P+ ATP 标记的斑点。
免疫沉淀是一种非常强大的技术，用于分离和纯化靶蛋白。在平滑条件下，蛋白质、调节器或基质可以共同免疫沉淀。然后，可能会发现一个新的交互网络。
免疫沉淀蛋白的活性也可以评估。特别是，激酶的活性可以通过P32-ATP标签在不同基材上进行测试。然而，针对与疾病有关激酶的抑制剂的活性可以进行评估。
它们可能构成开发新药的铅化合物。这种方法可以从哺乳动物扩展到酵母或细菌。这种技术并不难。
要点:确保具有负控制，以确保检测到的交互是特定的，并仔细选择解解条件以保持相互作用和活动。小细节和手势对于确保这项技术的成功非常重要，它们永远不会在文章的材料和方法中描述。演示程序将是法比安戈丁，一个技术员从我们的实验室。
在生物安全柜内的细胞培养室中准备细胞后，使用10毫升移液器将介质从盘子中去除，并丢弃在带漂白剂的专用废物瓶中。然后，加入10毫升新鲜补充的DMEM，并在37摄氏度时将盘子放回孵化器。为了准备转染混合物，在15毫升管中，在pH 7.5下加入450微升10毫摩尔三氧化盐溶液，辅以1毫摩尔EDTA和50微升2.5摩尔氯化钙溶液。
通过反转混合。进入管中，加入一个对应于10微克血浆DNA的体积，由DNA中滴答包扩增，并稀释与该试剂盒的洗脱缓冲液，其浓度已确定。反转管子混合。
然后，在涡流搅拌器上平滑搅拌，缓慢地加入500微升的 BES 缓冲盐水2X浓缩物，一滴一滴地滴入管中。小心移动，不要干扰DNA和磷酸钙之间的复杂形成。在室温下孵育至少15分钟，或长达45分钟。
现在，将板从培养箱转移到安全柜。将准备好的DNA复合物一滴一滴地添加到盘子表面的细胞上。在37摄氏度的孵化器中孵育24至72小时。
为了防止蛋白质降解，在冰上准备解液缓冲液，考虑每个转染板的四毫升解液缓冲液。从培养箱中取出带转染细胞的盘子。取出介质并将其丢弃在专用漂白剂废瓶中。
要清洗细胞，在板的一侧添加三毫升的冷PBS滴滴，以避免分离转染细胞。轻轻旋转板，将缓冲液铺到表面上。倾斜板以取出 PBS 并将其丢弃到废瓶中。
重复一次洗涤。将盘子放在冰上。最后，小心地拆下 PBS 的其余部分。
接下来，在转染洗涤细胞中加入500微升的冷解缓冲液。摊在盘子表面。在冰上孵育10分钟。
不时地将缓冲液铺在板面上。之后，使用细胞铲刮掉表面的细胞，并在微离心管中收集。在10，000倍的G和4摄氏度下进行10分钟的离心机。
将上流液酸盐收集到新的微离心管中，并收集该分数的 50 微升等分，再收集另一个新的微离心管。此等分物将用于检查转染蛋白是否表达良好。将颗粒丢弃在垃圾桶中。
首先，轻轻重新暂停与适当抗体相结合的阿加罗斯珠的库存溶液。切开 200 微升尖端的端，使开口 1 到 2 毫米。将尖端连接到微管，并绘制 40 微升溶液，让珠子进入尖端。
向上和向下移液珠数次，使珠子饱和，以确保珠子的正确体积，并转移珠子到微离心管。加入500微升TNET缓冲液，通过反转混合，在1000倍的G和4摄氏度下离心两分钟。小心地取出上流液，并添加 500 微升的 TNET 缓冲液。
在旋转轮上孵育至少一小时，温度为4摄氏度。然后，在1000倍的G和4摄氏度下将管子离心两分钟，然后用500微升的解液缓冲液通过倒置和离心两次清洗珠子。洗涤后，将先前收集的总馏分将酸盐放入管中，并在四摄氏度的旋转轮上孵育两到四个小时。
现在，在1000倍的G和4摄氏度下，将含有免疫沉淀珠的管子离心两分钟。通过倒置和离心，用500微升的解解缓冲液洗涤珠子五次。清洗珠子时，注意不要离珠子太近，同时去除上一液。
否则，珠子将被吸气，在实验结束时，将没有更多的珠子。对于洗脱，第一台离心机在1000度G和4摄氏度下进行两分钟的离心机。使用一毫升微管小心地取出上一液。
然后，用装有水泥针的汉密尔顿注射器，取出上一滴，以避免珠子吸入。接下来，添加 40 微升 4X Laemmli 缓冲液。轻轻敲击管子，使其均匀。
在室温下孵育五分钟。然后，在10，000倍的G和室温下进行5分钟的离心机。使用汉密尔顿注射器，将上流水液转移到新的微离心管中。
储存在零下80摄氏度。HEK-293 细胞被未标记的 LIMK 2-1 或 LIMK 2 的 HA 标记等构形式之一转染。LIMK 2-1 在不同的条件下表达良好。
抗 LIMK 2-1 抗体不识别 LIMK 2a 和 LIMK 2b 等构形式，并且是特异性的，因为与控制小干扰RNA相比，当细胞与 LIMK2 小干扰RNA进行转染时，其信号会降低。在各种人类细胞系中，LIMK 2-1似乎在 HEK-293 和 HeLa 中表达，但在 C6 中不表达。利用共生沉淀实验评估LIMK2-1与上游激酶岩石的相互作用。通过转染载体编码的每个不同的蛋白质都表达得很好。
LIMK2 的三个等同形式以及幼虫 6 被有效免疫沉淀。在水线中，检测到 ROCK，因此与 LIMK2 的三个等构形式共生，但与 larp6 不一起沉淀。然后检测到的交互是特定的。
通过伽玛P32 ATP标签测试了共生素LIMK 2-1的激酶活性。LIMK 2-1没有磷酸酯共生素，而它做磷酸化米林基本蛋白，或MBP。LIMK 2-1 在此测试中有效免疫沉淀。
在进行免疫沉淀时进行负控制至关重要，以确保相互作用是特定的。必须仔细设置解液缓冲液的组成，以保持相互作用和活动。在免疫沉淀时，可评估激酶活性以计算不同的基质。
突变可能很容易引入，并可能解开特定残留物的作用。也可以进行功能研究，以了解新的突出相互作用的生理作用。细胞必须在生物安全柜内的专用培养室中培养。
P32 ATP 必须谨慎处理。防护罩可防止辐射、盖革计数器、特定废物收集、个人乳房和手指徽章，以检测放射性暴露和过滤提示。
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概述
本研究通过各种生化技术对一种新的激酶蛋白进行了表征。所采用的方法包括蛋白质印迹分析、共免疫沉淀实验和激酶活性检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 细胞生物学
- 蛋白质相互作用
背景
- 激酶在细胞信号传导中扮演着关键角色。
- 了解激酶的相互作用可以揭示新的治疗靶点。
- 共免疫沉淀是研究蛋白质相互作用的重要方法。
- 磷酸化是激酶活性的常见机制。
研究目的
- 表征一种新的激酶蛋白。
- 探索其与其他蛋白质的相互作用。
- 评估其在各种底物上的激酶活性。
使用的方法
- 使用特定抗体的蛋白质印迹分析。
- 共免疫沉淀实验。
- 使用磷酸化特异性抗体检测激酶活性。
- γ[32P] ATP标记用于活性评估。
主要结果
- 鉴定激酶蛋白及其在不同细胞系中的表达。
- 展示特定的蛋白质相互作用。
- 通过多种测定法确认激酶活性。
- 洞察其在疾病机制中的潜在作用。
结论
- 新的激酶蛋白显示与其他细胞蛋白的显著相互作用。
- 其活性可以使用已建立的生化方法可靠地测量。
- 进一步研究可能阐明其在疾病背景下的作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing novel kinase proteins through robust biochemical methods enables early target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. This approach supports predictive confidence in pathway modulation and informs go/no-go decisions for therapeutic development. The integration of interaction mapping and activity assessment provides translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific protein interaction detection.
- Operational Value: Supports functional target validation by confirming kinase-substrate relationships.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by establishing mechanistic rationale for target modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated biological systems suitable for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Provides sensitive and measurable kinase activity readouts via radioactive labeling.
- Reproducibility: Establishes standardized protocols for interaction and activity assessment across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects kinase function to cellular processes such as growth, division, and motility.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery through preclinical validation using consistent biochemical readouts.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria based on target engagement and functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, enabling iterative validation of kinase function and modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via co-immunoprecipitation to clarify signaling networks and pathway context.
- Screening: Enables assay development with quantitative, substrate-flexible activity measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates measurable outputs such as phosphorylation levels and interaction specificity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects kinase activity to phenotypic outcomes in disease-relevant systems through functional substrate profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for kinase characterization applicable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking target engagement to functional kinase activity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lysis, immunoprecipitation, and washing conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by de-risking targets early through orthogonal validation of interaction and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on confirmed target modulation and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein biochemistry, immunoprecipitation, and radioactive assay handling.
- Dependent on access to scintillation counters, radiation safety infrastructure, and specific antibody reagents.
- Necessitates cross-team standardization of lysis buffer composition and incubation conditions to preserve complexes.
- Involves adaptation considerations when extending from mammalian to non-mammalian model systems.
- Includes practical limitations such as radioactivity handling requirements and substrate availability for activity assays.
