使用胶原酶E从小鼠结肠中分离固有层单个核细胞

采用本方案对肠道来源的免疫细胞进行表型分析，已证实可用于理解胃肠道及全身性炎症性疾病。该方法通过最大限度减少污染性碎片，分离出大量有活力的单个核细胞，从而可进一步通过流式细胞术或其他方法进行免疫表型分析。由于肠道是多种疾病中炎症反应的主要靶器官，本方案可能有助于在小鼠的癌症、过敏、移植和自身免疫病模型中研究肠道免疫细胞群体。

为了优化本方案的产量和效率，建议提前配制关键溶液和材料，具体如文中所述。在处死小鼠并作垂直正中切口后，使用精细解剖剪剪开腹膜。用镊子将小肠移至一侧，暴露降结肠。

轻轻上提降结肠，以充分暴露结肠的直肠部分。然后，在骨盆深部切断远端直肠，并从远端直肠至盲肠帽完整地将整个结肠作为一个整体进行游离。首先，将结肠置于湿润的纸巾上，使用剪刀或镊子的钝端轻轻按压肠壁，以挤出粪便固体。

接下来，将结肠置于培养皿中，使用带有18号钝端针头的10毫升注射器，以10毫升预冷的结肠缓冲液冲洗肠道。将结肠放入盛有5–10毫升预冷结肠缓冲液的培养皿中，手动振荡以洗去残留的结肠内容物。重复此洗涤步骤2–3次，每次使用含有新鲜缓冲液的新培养皿。

此后，将结肠转移至一个新的含有新鲜预冷结肠缓冲液的培养皿中。从结肠较肌肉发达的直肠端向近端结肠纵向剪开，以获得一块单一的矩形开放状结肠组织。弃去培养皿中的中段部分，并更换为干净的预冷结肠缓冲液。

将矩形结肠组织置于用结肠缓冲液润湿的纸巾上，先水平切开，再切成小片段。用精细镊子将结肠片段收集到含有20毫升预冷结肠缓冲液的50毫升聚丙烯锥形管中。然后，剧烈振荡管子30秒，以洗涤组织片段。

洗涤后，让组织碎片沉降到管底，再倾去或用真空抽吸除去上清液，注意避免丢失组织碎片。使用新鲜的结肠缓冲液，将整个洗涤过程重复3次。首先，向含有洗涤后结肠碎片的管中加入20毫升胶原酶消化缓冲液。密封管子，并将其置于37摄氏度的轨道摇床中，以2倍重力加速度（2×g）的转速振荡60分钟。

确保组织碎片在振荡过程中持续运动。首先，将5毫升66%的基于二氧化硅的密度分离介质分别加入3个独立的15毫升聚丙烯管中。接着，使用25毫升血清移液管，仅收集第一次胶原酶消化的上清液。

将上清液通过置于洁净的50毫升聚丙烯离心管中的40微米孔径滤膜细胞筛进行过滤。用预冷的结肠缓冲液将离心管完全充满，以终止胶原酶消化反应。随后离心细胞，吸除上清液，并将沉淀物置于冰上保存。

继续按照文本方案进行第二次胶原酶消化。第二次胶原酶消化完成后，使用18号钝头针将组织碎片在离心管与10毫升注射器之间反复强力冲洗。至少重复冲洗7-8次，直至肉眼不可见明显的组织碎片或残渣为止。

接下来，将组织解离悬液通过置于洁净的50毫升聚丙烯管中的40微米孔径滤网细胞筛进行过滤。加入预冷的结肠缓冲液至管口，以终止消化反应，随后在4摄氏度下以800 × g离心5分钟。通过真空抽吸弃去上清液，并将来自胶原酶消化1的重悬沉淀物转移至对应的管中。

此后，每结肠组织加入 24 毫升 44% 二氧化硅基密度分离介质，重悬各沉淀。使用 10 毫升血清移液管，将 8 毫升该介质缓慢分层加入含 66% 二氧化硅基密度分离介质的 3 支离心管中。使用电子天平或平衡装置，仔细平衡离心管桶中的各管。

在20摄氏度下以859 × g离心20分钟，不使用刹车。待转子完全停止后，再取出离心管，注意不要扰动密度梯度界面处的细胞。首先观察靠近5毫升刻度处的梯度界面，此处通常可见一条1–2毫升厚的白色条带。

用真空抽吸法吸除并弃去上层7毫升梯度液，以便更方便地用移液器接触界面。通过持续的手动吸力并配合稳定旋转手腕的动作，收集细胞界面层。收集至两层梯度之间的界面清晰且具有折光性为止，并将界面层转移至一个新的50毫升聚丙烯圆锥管中。

接下来，向该离心管中加入FACS缓冲液，直至总体积达到50毫升。在4摄氏度下以800 × g离心5分钟。然后，通过真空抽吸去除上清液，并将沉淀重悬于1毫升FACS缓冲液中。

本视频中描述的实验步骤可用于从结肠中分离单个核细胞，或经适当修改后用于从小肠中分离此类细胞。此外，通过流式细胞术及数据分析，比较使用胶原酶E或胶原酶D进行细胞分离时，有无DNA酶1处理条件下凋亡与坏死/死亡淋巴细胞的比例。在每种分离方法获得的单细胞悬液中，分别进行Annexin 5染色和可固定的活死细胞蓝色染料染色。结果显示，与未加DNA酶1的胶原酶D相比，未加DNA酶1的胶原酶E在细胞分离后获得的活细胞比例显著更高。

即使与单独使用胶原酶或胶原酶联合DNA酶相比，我们发现，E型胶原酶组坏死细胞的中位百分比为41.0%，而D型胶原酶组为90.0%；E型胶原酶联合DNA酶组为75.9%，D型胶原酶联合DNA酶组为80.3%。

随后在移植骨髓后第7天，对来自CD45.2 valve-C受体小鼠的单个核细胞（MNC）应用多参数流式细胞术分析，这些小鼠接受了同种异体或同基因型骨髓移植（BMT）模型的处理。计算并比较从BMT受体小鼠结肠中提取的供体来源CD4阳性与CD8阳性T细胞的平均绝对数量。因此，在此类小鼠模型中识别和/或定量稀有免疫细胞群体可能具有重要意义。

在同基因型和异基因型骨髓移植（BMT）模型中，均会评估稀有细胞亚群，包括供体来源的FOXP3阳性调节性T细胞。利用该方法，即使是在BMT后供体来源的结肠调节性T细胞浸润受体小鼠结肠等稀有亚群，也可进行分析。需要注意的是，胶原酶E在37摄氏度时具有活性。

因此，所有胶原酶溶液均应预先温育以保证充分的胶原酶活性，并需彻底淬灭以终止其活性。本方案可获得大量单个核细胞，可用于后续的流式细胞术、分子生物学技术、显微镜检查、细胞培养以及其他相关分析。在骨髓移植模型中，该方案为实验组与对照组小鼠结肠炎症程度提供了可靠的评估方法。

从而促进移植耐受中新型免疫调节机制的发现。产气荚膜梭菌（Clostridium histolyticum）来源的胶原酶是一种需采用实验室安全技术操作的试剂。吸入后可能危害健康，并可能引起皮肤和眼部刺激。