Name: 荧光活细胞显微镜对微孔裂变酵母核动力学的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学习活细胞显微技术用于研究裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe在有丝分裂和减数分裂过程中的核动力学。该方法无需有毒固定剂即可实时观察蛋白质动态，为细胞生物学研究提供可靠数据。

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作者谨此感谢 Natalia La Fourcade 和 Mon LaFerte 为本论文的撰写工作带来的愉悦体验。感谢 Forsburg 实验室的各位成员，他们以深刻的见解、实验构思以及精神上的支持，为本研究的完成作出了贡献。本项目得到了 NIGMS R35 GM118109 对 SLF 的资助。

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<li>Ding, D. Q., Matsuda, A., Okamasa, K., Nagahama, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+cohesin-based+chromosome+structure+is+essential+for+homologous+chromosome+pairing+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiotic cohesin-based chromosome structure is essential for homologous chromosome pairing in Schizosaccharomyces pombe.</a> Chromosoma. 125 (2), 205-214 (2016).</li>
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<li>Klutstein, M., Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+bouquet+regulates+meiotic+centromere+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The telomere bouquet regulates meiotic centromere assembly.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 458-469 (2015).</li>
<li>Okamoto, S. Y., Sato, M., Toda, T., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ensures+meiotic+chromosome+segregation+through+a+resolution+of+meiotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SCF ensures meiotic chromosome segregation through a resolution of meiotic recombination intermediates.</a> PloS One. 7 (1), e30622(2012).</li>
<li>Cooper, J. P., Watanabe, Y., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+Taz1+protein+is+required+for+meiotic+telomere+clustering+and+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fission yeast Taz1 protein is required for meiotic telomere clustering and recombination.</a> Nature. 392 (6678), 828-831 (1998).</li>
<li>Reyes, C., Serrurier, C., Gauthier, T., Gachet, Y., Tournier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+prevents+chromosome+arm+separation+defects+by+promoting+telomere+dispersion+and+disjunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aurora B prevents chromosome arm separation defects by promoting telomere dispersion and disjunction.</a> Journal of Cell Biology. 208 (6), 713-727 (2015).</li>
<li>Mastro, T. L., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+meiotic+crossovers+and+reduced+genome+stability+in+absence+of+Schizosaccharomyces+pombe+Rad16+%28XPF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Increased meiotic crossovers and reduced genome stability in absence of Schizosaccharomyces pombe Rad16 (XPF).</a> Genetics. 198 (4), 1457-1472 (2014).</li>
<li>Escorcia, W., Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+replication+fork+protection+complex+disrupts+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the replication fork protection complex disrupts meiotic chromosome segregation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2978-2997 (2017).</li>
<li>Fennell, A., Fernández-Álvarez, A., Tomita, K., Cooper, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+centromeres+have+interchangeable+roles+in+promoting+meiotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeres and centromeres have interchangeable roles in promoting meiotic spindle formation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (4), 415-428 (2015).</li>
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<li>De Oliveira, F. M. B., Harris, M. R., Brazauskas, P., De Bruin, R. A., Smolka, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+DNA+replication+checkpoint+to+MBF+cell%E2%80%90cycle+transcription+reveals+a+distinct+class+of+G1%2FS+genes%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Linking DNA replication checkpoint to MBF cell‐cycle transcription reveals a distinct class of G1/S genes.</a> The EMBO Journal. 31 (7), 1798-1810 (2012).</li>
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<li>Dudin, O., Bendezú, F. O., Groux, R., Laroche, T., Seitz, A., Martin, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formin-nucleated+actin+aster+concentrates+cell+wall+hydrolases+for+cell+fusion+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formin-nucleated actin aster concentrates cell wall hydrolases for cell fusion in fission yeast.</a> Journal of Cell Biology. 208 (7), 897-911 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在有丝分裂和减数分裂期间进行活细胞成像，可提供观察细胞核动态的机会，同时在数据采集过程中不会显著干扰裂殖酵母的生理状态。然而，必须谨慎操作，以确保细胞在无环境胁迫的条件下生长至所需密度；对于减数分裂实验，还需确保细胞处于终末分化阶段成像，而非过早或过晚。细胞过度拥挤、营养缺乏以及不适宜的培养温度是导致实验结果不可重复的常见因素。此外，在构建菌株时，至关重要的是验证荧光标签是否干扰目标基因的功能或影响细胞的整体适应性。若未能仔细检查携带荧光标记菌株的表型，可能导致相同基因型之间出现不一致且不可比较的结果。
尽管显微镜用琼脂糖垫的制备较为简单，但在获取有价值的成像数据时也可能带来一定困难。制备琼脂糖垫的方法很简单：将三块载玻片平行放置，将熔化的琼脂糖滴加在中间的载玻片上，再用另一块载玻片横跨覆盖在其余载玻片的顶部即可。然而，构建一个可调节宽度的载玻片制备装置，有助于制造出稳定且适用于特定实验条件的琼脂糖垫，更具实用性。一种简单的、可灵活调节垫片宽度的装置包括一个平台（如移液器吸头架或实验台）、两块显微镜载玻片，以及作为调节垫片宽度机制的实验室胶带（图1A）。琼脂糖垫的确切厚度取决于成像时间要求、琼脂糖品牌、温度、盖玻片封固剂、蒸发速率等因素。因此，在数据采集前对成像系统进行校准至关重要，以提高技术上的可重复性，并提升活细胞成像的质量1,2,3。在长时间成像过程中，琼脂糖垫的表面特性、刚性和组成成分均至关重要。琼脂糖具有低背景荧光、易于塑形，并且在适当浓度下能够抵抗因蒸发引起的结构变形。此外，将裂殖酵母培养基与琼脂糖混合不会影响成像质量，可实现对多次有丝分裂和减数分裂周期的长期观察。同时，在延时显微成像中应避免任何气泡的产生。琼脂糖垫内部及样品中的气泡会随时间逐渐膨胀，导致细胞移位并破坏焦平面。只要通过旋转盖玻片使细胞充分分散，研究人员便可连续追踪多个世代的有丝分裂过程以及从核融合到孢子形成的减数分裂事件。制备和选择合适的成像用琼脂糖垫需要一定时间来掌握，但一旦掌握，将有助于获得高度信息丰富的显微观察结果。
与其他方法一样，活细胞显微镜技术也存在一定的技术局限性。使用荧光标记蛋白会为实验带来限制，从而影响可研究问题的范围。光漂白和光毒性是长时间成像过程中常见的问题，可通过避免对细胞过长时间或过于频繁地暴露于短波长光下来减轻。对于涉及GFP、CFP、YFP、mRFP和DsRed（裂殖酵母活细胞成像中常用的典型荧光蛋白）的实验，常规实验通常采用5-15%的激发光强度和100-500毫秒的曝光时间。然而，这些参数需根据研究人员的具体实验需求进行调整。此外，使用60倍物镜获取包含9至13个层面、层间距为0.5 µm的z轴层扫图像，足以分辨裂殖酵母细胞的厚度。同时，必须确认荧光标记不会干扰目标蛋白的正常调控或功能，也不会产生虚假的表型。因此，建议构建包含不同荧光标签和亲和标签的菌株，以通过多种方法验证观察结果。此外，研究人员有责任确保实验参数在不同实验间具有可重复性，并且所收集的数据适用于后续分析1,3。没有任何技术可以取代通过仔细观察和严格检测荧光信号线性响应来细致验证实验系统的久经考验的做法。
最后，以不修改原始图像的格式分析显微镜数据至关重要。Fiji 提供了出色的文档记录工具，可追踪原始数据的测量结果，并允许研究人员在单次操作中检测不同的细胞参数。这些功能，加上其丰富的在线教程和广泛的文献支持，使 Fiji 成为测量、分析和展示裂殖酵母在有丝分裂和减数分裂过程中核动态的活细胞成像数据的重要工具。

活细胞显微镜技术使研究人员能够在不杀死裂殖酵母细胞的情况下观察细胞核的动态变化，避免了使用具有杀伤性的固定剂和染色剂。该技术可用于观察参与染色体复制、重组和分离等重要事件的荧光标记蛋白的稳定性、运动、定位及出现时间，同时还能观察细胞膜和细胞骨架的运动。通过维持细胞活性并采用无毒信号检测方法，该技术对细胞生理状态的干扰极小。若操作得当，此显微镜方法可减少因长时间技术操作或非特异性化学反应所引起的干扰效应。此外，在实验过程中，研究人员还可实时观察裂殖酵母的营养状态、应激状态、增殖效率以及凋亡状态，这些信息有助于判断成像参数是否合适或是否存在异常的细胞生理状况1,2,3。
有丝分裂和减数分裂的特征是细胞核和细胞的分裂。与有丝分裂不同，在减数分裂中，亲代细胞产生子代细胞时遗传物质减半4。由于活细胞成像除了提供空间关系外，还提供了时间维度，因此可对大量细胞进行实时观察。活细胞显微镜技术使研究人员能够利用组蛋白5、黏连蛋白亚基6、微管7、着丝粒8、动粒9、纺锤极体（SPB）组分10以及染色体乘客复合物（CPC）组分11的荧光标记，来研究核分裂的动态过程。除了染色体分离装置外，活细胞成像还捕捉到了一些对染色体分离必要但并不直接参与该过程的蛋白质的行为。这些蛋白质的功能已被证明会影响DNA复制、染色体重组、细胞核移动以及染色体与微管的连接12,13,14。这些观察结果有助于更好地理解那些无法通过生化或遗传方法研究其功能组分的细胞事件。随着显微镜技术的新进展，分辨率低、光漂白、光毒性以及焦距不稳定等限制将逐渐减少，从而促进对有丝分裂和减数分裂中核动态过程的更佳实时观察1,2,3。减数分裂尤其具有挑战性，因为它是一条终末分化通路，需要对时间进程给予密切注意。
本实验方案旨在介绍一种相对简单的方法，用于实时观察裂殖酵母在有丝分裂和减数分裂过程中的细胞核动态。为实现这一目标，必须使用未暴露于环境胁迫的细胞，制备能够耐受长时间成像的琼脂糖垫，并以适当的细胞密度进行封片，以便于单细胞动态的观察。此外，本方案采用携带荧光标记蛋白的细胞，这些蛋白可作为研究核动力学（Hht1-mRFP 或 Hht1-GFP）、染色体分离（Sad1-DsRed）、细胞骨架动态（Atb2-mRFP）、G1/S 期转录激活（Tos4-GFP）以及减数分裂中黏连蛋白稳定性（Rec8-GFP）的有用标记物。该方法还引入了其他核内和胞质标记物（表 I），可组合使用以探究特定细胞过程的相关问题。此外，本方案还介绍了基本的 Fiji 工具，以帮助研究人员处理活细胞图像并分析各类数据。该方法的优势在于通过实时观察蛋白质的动力学行为、时间进程和稳定性，来描述那些对有丝分裂和减数分裂正常进行至关重要的生物学过程。

<table><tbody><tr><td>60倍平场复消色差物镜</td><td>Olympus</td><td>AMEP4694</td><td></td></tr><tr><td>腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>A-8751</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>7558B</td><td>IB4917-10 kg</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer旋转仪</td><td>Stovall</td><td>美国专利 #4.702.610</td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td>B-4501</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma</td><td>B-6768-5kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0,</td><td>Sigma</td><td>C3306-500G</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma</td><td>C-0759</td><td></td></tr><tr><td>Convolve 3D 软件插件</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CoolSnap HQ CCD 相机</td><td>Roper</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0,</td><td>END</td><td>CX-2185-1</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision 去卷积荧光显微镜</td><td>GE Healthcare/Applied Precision</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Diffraction PSF 3D 软件插件</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>爱丁堡最小培养基（EMM）氮源</td><td>Sunrise</td><td>2023;1kg</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>END</td><td>FX9259-04</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Barnstead</td><td>Thermo Lyne</td><td></td></tr><tr><td>组氨酸</td><td>Sigma</td><td>H8125-100g</td><td></td></tr><tr><td>Huygens 去卷积软件</td><td>SVI</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 去卷积软件</td><td>Bitplane</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Shell lab</td><td>#3015</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>Iterative Deconvolve 3D 软件插件</td><td>OptiNav, Inc.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>Sigma</td><td>L7387-1kg</td><td></td></tr><tr><td>亮氨酸</td><td>Sigma</td><td>L8912-100g</td><td></td></tr><tr><td>赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>L5626-500g</td><td></td></tr><tr><td>麦芽提取物（ME）</td><td>MP</td><td>4103-032</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td><td>AMRESCO</td><td>0288-500G</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;,</td><td>Mallinckrodt</td><td>6192-02</td><td></td></tr><tr><td>钼酸</td><td>Sigma</td><td>M-0878</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>8024-03</td><td></td></tr><tr><td>烟酸,</td><td>Sigma</td><td>N-4126</td><td></td></tr><tr><td>泛酸</td><td>Sigma</td><td>P-5161</td><td></td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisher</td><td>s80119WX</td><td></td></tr><tr><td>裂殖酵母谷氨酸培养基（PMG）</td><td>Sunrise</td><td>2060-250</td><td></td></tr><tr><td>softWorx v3.3 图像处理软件</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>孢子形成培养基粉末</td><td>Sunrise</td><td>1821-500</td><td></td></tr><tr><td>温度控制离心机</td><td>Beckman</td><td>Allwgra 6KR xentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>AMRESCO</td><td>0847-500g</td><td></td></tr><tr><td>凡士林</td><td>Equaline</td><td>F79658</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>EMD</td><td>1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物加补充剂（YES）</td><td>Sunrise</td><td>2011-1kg</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>J.T.Baker</td><td>4382-04</td><td></td></tr></tbody></table>

利用荧光活细胞显微镜观察裂殖酵母有丝分裂和减数分裂的核动态

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

活细胞成像是一种显微技术，用于研究活细胞中细胞和蛋白质的动态过程。该成像方法无毒性，通常不会干扰细胞生理状态，且实验操作需求极少。较低的技术干扰使研究人员能够观察多个有丝分裂周期，并完整记录减数分裂的全过程。通过使用绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）等荧光标记，研究人员可分析多种在转录、DNA复制、黏连和分离等过程中发挥重要功能的因子。结合使用Fiji（一种免费且经过优化的ImageJ版本）进行数据分析，活细胞成像可提供多种手段来评估蛋白质的运动、定位、稳定性与时间动态，以及细胞核动态和染色体分离情况。然而，与其他显微技术一样，活细胞成像受限于光的固有特性，高倍放大时分辨率受到限制，且在高频率波长照射下易发生光漂白或光毒性。不过，研究人员只要谨慎选择合适的实验条件、菌株和荧光标记物，即可在一定程度上克服这些物理限制，从而实现对有丝分裂和减数分裂事件的恰当可视化观察。

本文介绍了一种非毒性显微成像技术——活细胞成像，该方法可使研究人员在活体裂殖酵母细胞的有丝分裂和减数分裂过程中，观察蛋白质行为及核动态变化。

活细胞成像是一种显微镜技术，用于观察活细胞中的细胞和蛋白质动态。该成像方法无毒性，通常具有……

活细胞显微镜技术使研究人员能够实时观察裂殖酵母在有丝分裂和减数分裂过程中的细胞核动态。该方法的优势在于可在正常的生理条件下研究活细胞中的细胞核过程，从而避免使用有毒的固定剂和染色剂。该技术可用于探究蛋白质的时间调控、稳定性及运动性等相关问题，而这些问题可能难以通过遗传学或生物力学手段进行操控研究。在成像前，必须密切关注裂殖酵母细胞的健康状况和生长状态。应始终检查细胞形态和生长特征，以确保不同实验之间结果的一致性。本方案展示了制备显微镜载玻片的相对简便方法，若能正确掌握，可提高长时间活细胞成像的一致性和可重复性。首先，从低温复苏平板中挑取细胞，将细胞划线接种于YES平板上，根据裂殖酵母菌株的基因型，在25摄氏度或32摄氏度下培养，以复苏低温保存的裂殖酵母菌株。然后，使用无菌接种环从复苏后的裂殖酵母菌落中挑取单个菌落，接种至含有3毫升YES液体培养基的试管中。将试管置于摇床中，以150至220 rpm的转速，在25或32摄氏度下振荡培养过夜，直至达到对数生长后期，光密度值（OD）为0.7至1.0。取10微升培养物转移到显微镜载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察，检查细胞形态和营养状态是否正常。若要制备用于有丝分裂或减数分裂分析的显微镜载片，首先在含有100毫升液体的500毫升锥形瓶中加入2克琼脂糖，该液体为进行有丝分裂分析时的最小培养基加补充物，或为进行减数分裂分析时的液体孢子形成培养基。将琼脂糖溶液放入微波炉中，以60%的功率每次加热10秒，或将其置于55摄氏度的水浴中加热10分钟。轻轻旋转溶液以确保充分融化。在移液器吸头架上放置两张显微镜载玻片，将上方的载玻片两端分别架在两叠实验室胶带之上作为支撑，形成十字形结构。调整两张载玻片之间的距离至大于两毫米，以便在后续步骤中形成较厚的垫层，用于长时间成像。将熔化的琼脂糖在室温下冷却一分钟后，取下顶部载玻片，使用宽口吸头在底部载玻片上滴加 50 至 100 微升，形成一个液滴。在琼脂糖完全冷却前，将顶部载玻片盖上，形成直径约为 1.5 至 2 厘米的均匀垫层。最佳的活细胞成像对于后续的数据处理步骤至关重要。确保在熔化的琼脂糖中排除任何气泡，并为超过四小时的成像时间制备一层薄的琼脂糖垫。为观察有丝分裂事件，需将细胞从起始培养物中在液体 EMM 或 PMG 加补充剂的培养基中过夜培养。取一毫升培养物加入比色皿中，在分光光度计上以595纳米波长测定吸光度。当光密度达到0.4时，视为细胞处于对数生长中期。随后将一毫升细胞悬液在1,375 ×g 条件下离心一分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于含补充物的最小培养基中，终体积为100微升。为观察减数分裂事件，需将起始培养物中的细胞在含补充物的最小培养基中过夜培养。当细胞在595纳米处的光密度介于0.7至1之间时，视为处于对数生长晚期。接下来，从对数生长后期的培养物中分别取500微升的两种交配类型菌株，即H阴性和H阳性，混合制成1毫升的细胞悬液。在1,375 ×g条件下离心1分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1毫升液体麦芽提取物中。重复麦芽糖提取液洗涤三次，以确保有效去除营养物质。最后一次麦芽糖提取液洗涤后，将细胞重悬于1毫升麦芽糖提取液中，并将混合液转移至含有9毫升麦芽糖提取液的50毫升锥形瓶中。在22至25摄氏度下，以50至100 rpm的最低转速振荡培养12至16小时。大量圆形裂殖酵母菌团的出现，是由于强烈的自絮凝作用，表明交配效率较高。接下来，取1毫升交配培养物样品，在1,375 ×g 条件下离心1分钟。移除750微升上清液，并将细胞重悬于剩余的上清液中。剧烈涡旋震荡5秒以打散团块。取20 µL有丝分裂或减数分裂细胞悬液，滴加在2%琼脂糖垫上。将载玻片倒置，置于无尘纸巾上2至3秒，以去除多余培养基。翻转载玻片，并将玻璃盖玻片轻轻放置在凝胶垫的上方，注意避免产生气泡。为形成单层细胞，用食指顺时针旋转盖玻片，有丝分裂细胞旋转一周，减数分裂细胞旋转两周。确保细胞物质在琼脂糖垫上充分分散，以利于单个细胞或子囊更好地分离。使用小木棒将熔融的碳氢化合物密封剂沿盖玻片边缘涂抹，以密封每个琼脂糖垫。琼脂糖垫密封后，将其放置在显微镜载物台上。打开温控室，并将其设定至所需温度。将一块带有湿润滤纸的培养皿放入腔室中，以控制显微镜系统的湿度。在适当的成像条件下平衡10至15分钟。此步骤可使残留的气泡消散，并允许琼脂糖在最后时刻发生位移调整。使用 40X 物镜寻找合适的成像视野。切换至 60X 物镜以开始数据采集。在控制显微镜功能的软件中，选择与所观察荧光染料最匹配的显微镜滤光片组。调整激发波长以匹配所用的荧光染料，采用能够产生稳定信号的最低激发光强度，并使用四到八小时的曝光时间以获得可接受且可量化、可重复的成像数据。每小时至少采集六个时间点的数据。在图像采集软件中，选择至少一个荧光通道用于数据采集，并使用由13个层面组成、层间距为0.5微米的Z轴序列。在 Fiji 软件中，通过在插件菜单下选择 Bio-Formats Importer 功能来上传去卷积图像。在“导入选项”弹出窗口中，选择“Hyperstack”和“默认颜色模式”，勾选“自动缩放”，然后点击“确定”按钮。通过滚动底部相应的滑块，确保显示窗口中的荧光通道数和时间帧数正确无误。保存为不压缩数据的 Tiff 文件。然后在“分析”菜单下使用“设置测量”选项来选择不同的参数，例如：面积、最小/最大灰度值、积分密度、平均灰度值、中位数、堆栈位置、周长和显示标签。选择颜色，然后点击通道工具。在通道弹出窗口中，勾选将要测量其强度或面积的颜色通道。选择图像，然后选择类型并点击32位。在“图像”菜单下选择“调整”和“阈值”功能。勾选“暗背景”选项，选择“默认”方法，并选择“红色”以叠加感兴趣信号。使用魔棒工具高亮每个感兴趣的结构，然后按键盘上的 T 键，将选定的感兴趣区域添加到弹出的 ROI 管理器窗口中。接下来，打开压缩的 ROI 文件夹以加载 ROI 管理器，然后在左侧面板中依次点击每个 ROI 标识符。从“分析”菜单中选择“测量”，并对每个 ROI 标识符重复此操作，以量化图像堆栈所有切片中感兴趣的对象。将结果保存为 CSV 文件，用于统计分析。本研究中，若细胞因营养限制或过度生长而处于饥饿状态，将表现出液泡增多及细胞体积减小。对数生长期细胞则呈现活跃的DNA复制和细胞分裂，同时伴有全核分布的Tos4-GFP表达以及Sad1-DsRed焦点的分离。若细胞无法发生交配，例如因氮源饥饿程度不足时，则会阻碍其进入减数分裂。 图示一对正在进行核融合的裂殖细胞。交配细胞悬液中明显的絮状聚集现象增强了细胞间的相互作用，表明交配成功且减数分裂诱导效率较高。合子子囊呈现多种形态，包括锯齿状和香蕉状细胞形态。在有丝分裂过程中，当细胞从中期过渡到末期时，首先发生的变化是中期细胞核体积的收缩，其次是在后期出现细胞核的分裂。减数分裂细胞除了与有丝分裂细胞共享某些染色体分离动力学特征外，还在同源重组期间表现出细胞核的振荡现象，并在后期II结束时进一步减少核苷酸含量。研究人员有责任确保实验参数可在不同实验间重复，并确保所收集的数据适用于后续分析。活细胞成像技术使研究者能够详细观察有丝分裂和减数分裂中细胞核分裂的机制。随着荧光标记技术和显微镜性能的不断提升，我们能够观察到的生物过程的数量和类型也将不断增加。

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生物学

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