无饲养层和无异种成分的确定性条件下人多能干细胞向造血内皮细胞的分化

我们提供由人类多能干细胞生成血细胞的方法。该技术的主要优势在于能够获得稳定且精确数量的生血性内皮细胞。我们预计，该平台将广泛应用于疾病监测以及治疗性化合物的筛选。

该技术对血液学和免疫学研究特别有益。该方法可应用于人血细胞的遗传干预或基因编辑，能够轻松地在造血内皮细胞中诱导载体。

最关键的步骤是使用LM511-E8包被培养板以用于PSC克隆的培养。我们不建议省略包被步骤或使用其他基质替代。直观的演示非常重要，因为我们希望展示如何用解离缓冲液冲洗细胞，以及如何用LM511-E8对培养板进行包被。

在 LM511-E8 包被的六孔板中，使用 mTeSR1 培养基将人多能干细胞（hPSCs）培养至 70% 到 80% 汇合度。造血诱导前四天，吸除培养基，用 PBS 洗涤两次。用消化液冲洗细胞，并在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。

将细胞重悬于PSC维持培养基中，并将悬液转移至1.5毫升微量离心管中。在200 × g下离心3分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于PSC接种培养基中。

根据手稿说明，将PSC悬液接种到微加工塑料容器中，并过夜培养。在造血诱导前3天，轻轻将PSC类球体转移至15毫升锥形管中，在室温下静置2分钟，使其依靠重力沉淀。吸除上清液，用类球体接种培养基重悬类球体。

将悬浮液接种至LM511-E8包被的10厘米培养皿中，接种密度为每平方厘米4个类球体，培养3天。3天后吸除培养基，加入第0天分化培养基，在低氧培养箱中继续培养2天。随后吸除第0天培养基，加入第2天分化培养基，再继续培养2天。

两天后，吸除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。用解离溶液冲洗细胞，在 37°C、5% 二氧化碳条件下孵育 30 分钟。孵育结束后，通过在 1 毫摩尔 EDTA 中轻轻重悬细胞以解离细胞。

将悬液转移至50毫升锥形管中，在200 × g条件下离心细胞3分钟。吸除上清液，并用300微升磁性分离缓冲液重悬细胞沉淀。向细胞中加入100微升CD34阳性微珠，轻轻吹打混匀。

室温孵育30分钟，然后使用40微米细胞筛过滤悬液，并利用磁性分离器分离CD34阳性细胞。将0.5毫升浓度为5微克/毫升的纤维连接蛋白包被液加入24孔培养板的每孔中，于室温孵育30分钟。与此同时，将分选得到的CD34阳性细胞在200 × g条件下离心3分钟，并将沉淀重悬于1毫升EHT培养基中。

使用细胞计数器测定活细胞密度，并通过添加EHT培养基将细胞密度调整至每毫升200,000个细胞。吸除并弃去纤维连接蛋白包被孔中的包被液，每孔加入0.5毫升CD34阳性细胞悬液。将细胞置于低氧培养箱中培养一周。

为收集悬浮细胞，将培养基转移至15毫升锥形管中，在200 × g条件下离心3分钟，然后吸除上清液。为收集贴壁细胞，用0.5毫升PBS洗涤两次，并用解离缓冲液冲洗细胞。

吸去多余液体，将培养板在37摄氏度下孵育五分钟。用一毫升Facs缓冲液重悬细胞，并混匀悬浮细胞与贴壁细胞。将混合细胞在200 × g 离心三分钟，然后吸去上清液，再将细胞重悬于50微升Facs缓冲液中。

将抗CD34和抗CD45抗体用50微升Facs缓冲液稀释；加入细胞中，于室温避光孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后以200 × g离心3分钟。吸去上清液，将细胞重悬于0.5毫升含0.5微克/毫升dappy的Facs缓冲液中。

通过流式细胞术检测CD34和CD45的表达。为收集造血细胞，将培养基转移至15毫升锥形管中。用PBS轻轻冲洗培养孔两次，收集残留细胞。

将细胞在200 × g条件下离心3分钟，然后吸去上清液，并用1毫升EHT培养基重悬。计数细胞后，将10,000个细胞加入含抗生素的3毫升甲基纤维素培养基中，使用16号针头的注射器混匀5次。将全部培养基悬浮液分装至6孔板的每个孔中。

为保持细胞湿润，请向培养板的空孔中加入水或 PBS。将细胞培养两周，注意不要扰动培养皿，因为细胞克隆对震动敏感。两周后，在显微镜下计数克隆。

在造血诱导混合因子的刺激下，细胞从内皮细胞形态转变为造血细胞形态。培养物中出现造血细胞集落。造血祖细胞表达CD34和CD45，因此通过流式细胞术分析CD34和CD45的表达，以确认造血细胞集落的存在。

集落形成单位实验表明，CD34阳性及CD45阳性的造血祖细胞可生成粒细胞或巨噬细胞集落。每10,000个细胞中集落数量估计为38个集落形成单位。最关键的步骤是计数PSC类球体。

我们发现，表面参数是该方案效率的最主要决定性因素。该程序可用于现成的能产生能量的细胞（如天然存在的细胞和巨噬细胞）的制备。该平台可使研究人员探索人类造血发育中的关键决定性因素。