小鼠动脉粥样硬化的定量分析

心血管疾病是全球范围内的主要死亡原因。小鼠模型是研究该疾病的有效工具，我们的实验方案可用于定量小鼠中的动脉粥样硬化。利用本方案，可在三个血管部位测量病变面积。

主动脉根部、主动脉弓和无名动脉。在小鼠中定量动脉粥样硬化可能是一项繁琐的工作。我们提供了详细的步骤，希望可以加快这一过程。

这些步骤中的一些很难用文字描述清楚。我们希望本视频能够帮助您获得可靠的动脉粥样硬化病变大小分析结果。按照标准操作流程取下小鼠心脏后，将心脏置于软木板上，腹面朝上，置于解剖显微镜下，并使用针从心尖处将心脏固定在软木板上。

用解剖镊夹住心脏基底部，将手术刀在矢状面上向尾侧倾斜20度、在横断面上向头侧倾斜20度，切除心脏顶端的三分之二部分。将主动脉根部和心脏基底部包埋于最佳切割温度包埋剂（OCT）中，用镊子轻轻挤压心脏，使OCT填充主动脉根部并排出任何气泡。将标本转移至盛有OCT的冷冻模具底部，使主动脉根部垂直于模具底面，然后在干冰上冷冻包埋剂。

然后将组织样本置于冻存袋中，在零下80摄氏度的冰箱中保存，直至进行冷冻切片。为准备用于表面（en face）分析的固定垫，将一段石蜡膜对折八次，形成一个平整的25 mm × 25 mm表面，并用黑色电工绝缘胶带包裹该膜，以构成主动脉观察的暗色背景。在固定垫背面贴上标签，并使用铅笔记录小鼠的编号。

将主动脉弓转移至固定板上，并向组织滴加一滴 PBS。在体视显微镜下，清除主动脉上残留的外膜周围脂肪组织，使用 Vannas 剪刀和 Dumont 镊子轻柔剥离所有周围的脂肪组织，避免操作或损伤主动脉。接着，将 Vannas 剪刀插入主动脉腔内，以暴露内膜表面。

从升主动脉弓的外侧曲面开始向远端切割，继续切开各分支，包括头臂动脉，同时保留降胸主动脉背侧部分。为显露内膜表面，切开主动脉小弯侧并将其展开。使用微型Castroviejo持针器，用微型昆虫针的钝端将打开的主动脉弓固定于解剖蜡盘上，注意不要牵拉标本，并在组织固定到位后，轻轻将针尖弯离标本方向。

然后将固定好的弓状结构面朝下置于含有 PBS 的培养皿中，在 4 摄氏度条件下保存。进行苏丹 IV 染色时，先将标本面朝下放入含有 70% 乙醇的培养皿中漂洗 5 分钟，随后将标本转移至苏丹 IV 工作液的培养皿中孵育 7 分钟。孵育结束后，用 80% 乙醇进行两次、每次三分钟的漂洗，以去除正常内膜表面的染色，最后用 PBS 进行终末漂洗，再将组织放回原来的培养皿中。

然后，在体视显微镜下连接数码相机，以10倍放大倍数获取显微图像，拍摄浸没在PBS中的固定主动脉弓的图像，并使用小型金属重物将固定床压在培养皿底部。为获得包埋主动脉根部的冷冻切片，将恒温冷冻切片机温度设置为零下20摄氏度，切片厚度设为10微米。将含有主动脉根部的OCT包埋块安装在样品架上，使心室组织朝外。

如有需要，可使用额外的OCT固定位置。此时主动脉根部应与刀片垂直。将最初含有心肌组织的对照切片收集到普通载玻片上，并在光学显微镜下每200 µm检查一次组织切片的进展情况。

当第一个主动脉瓣叶出现时，将样本向零点瓣叶倾斜，使切面与另外两个瓣叶对齐，并从零点开始，对每10微米的切片进行计数。根据预先设计的载玻片方案，从距零点90微米处开始收集用于分析的切片，直至达到距零点800微米的位置。通过计算主动脉根部总血管面积中的病变占比，可降低因切片角度差异可能导致的数据偏差。

此外，计算曲线下面积或每只小鼠的动脉粥样病灶大小，并将数据以点图形式呈现，有助于进一步直观展示组内个体间的差异。病灶区域的脂质积聚可通过油红O染色阳性区域占总病灶面积的比例进行定量分析。右冠状动脉和左冠状动脉通常从主动脉窦起始处约250 µm的位置分出，该位置常与最显著的病灶大小相重合。

在主动脉弓的代表性图像中去除深色背景可增强视觉效果。组内病变大小通常呈正态分布，因此可采用学生t检验进行组间统计分析。建议先使用一些测试样本进行练习，直至掌握足够的技能来处理实验样本。

如果各组之间的病灶大小存在差异，应确定其机制，因为通常下一步需要进行病灶组成分析。