Name: 在肽膜前体的维西图洛合成中,用于自主囊泡生长 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习利用薄膜水合法制备基于肽的小单层囊泡，该方法结合转录翻译系统实现膜肽原位合成。此技术可整合敏感样本，为生物化学与膜生物学研究提供简单可靠的实验方案。

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我们衷心感谢德国研究基金会（DFG TRR 235，生命起源项目P15）、欧洲研究理事会（资助协议号694410 AEDNA）以及慕尼黑工业大学国际科学与工程研究生院（IGSSE，项目号9.05）提供的经费支持。感谢E. Falgenhauer在样品制备方面的帮助。感谢A. Dupin和M. Schwarz-Schilling在TX-TL系统方面的协助以及有益的讨论。感谢N. B. Holland参与的有益讨论。

1. 弹性蛋白样多肽的表达
<ol>
	<li>第1天：肽表达用起始培养物及试剂的准备
	<ol>
		<li>准备并高压灭菌表达培养瓶（4个2.5 L）和3 L LB培养基。每1 L LB培养基，将25 g LB粉末加入1 L超纯水中。</li>
		<li>准备100 mL LB培养基，加入50 µL经0.22 µm滤器过滤除菌的氯霉素溶液（25 mg/mL，溶于乙醇）和50 µL经0.22 µm滤器过滤除菌的羧苄青霉素溶液（100 mg/mL，溶于50%乙醇和50%超纯水），配制起始培养液。</li>
		<li>从含有目的菌株的预存细菌菌种中取少量划线接种 E. coli 表达多肽序列 MGHGVGVP((GEGVP) 的 pET20b(+) 表达载体转化的大肠杆菌 BL21(DE3)pLysS 菌株4(GVGVP)4((GFGVP)4(GVGVP)3(GFGVP)4将GWP（缩写为EF）加入预热的100 mL起始培养物中，在摇床培养箱中于37 °C、250 rpm条件下孵育16 h（E. coli 菌株和载体可应要求提供。</li>
		<li>提前将表达培养瓶和LB培养基在37 °C预热过夜，以便为次日实验做好准备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天：蛋白表达
	<ol>
		<li>向每个表达培养瓶中加入 750 mL LB 培养基、375 µL 经无菌过滤（0.22 µm 滤器）的氯霉素储备液（25 mg/mL，溶于乙醇）、以及 375 µL 经无菌过滤（0.22 µm 滤器）的羧苄西林储备液（100 mg/mL，溶于 50% 乙醇和 50% 超纯水）。</li>
		<li>在振荡混匀以分散抗生素后，取2 mL培养基作为参考样品，用于测定600 nm处的光密度（OD600）600).</li>
		<li>将7.5 mL起始培养物加入表达培养瓶中，于37 °C、250 rpm条件下振荡培养1小时。</li>
		<li>经过此步骤后，OD600 每个烧瓶每隔20分钟检查一次。</li>
		<li>当光密度达到约0.8时，将温度降至16 °C，并通过向每个表达培养瓶中加入750 µL溶于超纯水的1 M无菌过滤β-异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导肽的表达。</li>
		<li>将表达培养瓶与诱导后的细菌在16 °C、250 rpm条件下孵育16小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天：表达多肽的提取
	<ol>
		<li>预先称量离心管的质量，以便在收获细胞后确定细胞沉淀的重量。</li>
		<li>通过预冷的离心机在4,000 × g条件下离心20分钟，收集表达培养瓶中的全部细菌 g 和 4 °C。</li>
		<li>倒出上清液，并将离心瓶在无菌纸巾上轻轻吸干。</li>
		<li>称量离心管并计算细胞沉淀的质量。</li>
		<li>将来自750 mL原始细胞培养物的细胞沉淀用15 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）通过移液重悬，然后在4,000 x g 4 °C 下离心 20 分钟。倒出上清液，并将离心管在无菌纸巾上吸干。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中，每1克细胞沉淀使用2 mL缓冲液，缓冲液为含溶菌酶（1 mg/mL）的PBS（pH 7.4），用于后续裂解步骤。&#8201;毫克/毫升），1&#8201;mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），1&#8201;mM 苄脒，以及 0.5&#8201;DNase I 单位</li>
		<li>将细胞在冰上用超声波破碎仪以8 W功率超声处理9分钟，采用交替进行10秒超声和20秒暂停的模式，随后将样品置于冰上冷却9分钟。重复上述9分钟超声步骤一次。</li>
		<li>每1添加2 mL 10%（w/v）聚乙烯亚胺（PEI）&#8201;用于核酸沉淀的原始细胞培养液体积</li>
		<li>将样品分装至2 mL离心管中，于60 °C孵育10分钟，随后在4 °C孵育10分钟。</li>
		<li>将溶液在16,000 x g条件下离心 g 在 4 °C 下离心 10 分钟，收集含有 ELP 的上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过逆向温度循环进行蛋白质纯化：
	<ol>
		<li>将上清液的pH值调节至2，使多肽的亲水部分转变为疏水性，从而诱导其聚集。使用磷酸和氢氧化钠调节pH值。pH试纸足以用于测定pH水平。</li>
		<li>为提高纯化产率，将样品加热至 60 °C，并加入氯化钠至终浓度为 2 M。</li>
		<li>随后，以 16,000 x g 室温（RT）下孵育10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀重悬于PBS中（所用体积仅为前一步骤的一半）。</li>
		<li>用磷酸和氢氧化钠将 pH 调至 7。pH 试纸的精度足以确定 pH 值。</li>
		<li>将样品随后在16,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>收集上清液，并重复步骤 1.4.1–1.4.6，总共最多重复 3 次，但在最后一次重复步骤 1.4.4 时，仅加入水而非 PBS。</li>
		<li>使用吸收光谱仪测定肽的浓度。在280 nm处采用消光系数5500/M/cm。&#8201;nm</li>
		<li>将ELP的浓度调整至700 µM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用玻璃珠法制备囊泡
<ol>
	<li>使用离心真空浓缩仪将ELP溶液浓缩至1.1 mM。</li>
	<li>取200 µL浓缩后的ELP溶液，加入1,250 µL的2:1氯仿/甲醇混合液，随后涡旋混合。</li>
	<li>向一个10 mL的圆底烧瓶中加入1.5 g球形玻璃珠（直径212–300 µm）。</li>
	<li>将含有ELP和氯仿/甲醇混合液的溶液加入圆底烧瓶中，轻轻振荡混合。</li>
	<li>将烧瓶连接至旋转蒸发仪，调节转速至150 rpm，压力调节至-0.2 x 105 Pa（-200 mbar），在室温下蒸发约4分钟，直至液体完全蒸发。</li>
	<li>将圆底烧瓶置于干燥器中至少1小时，以确保残留的氯仿和甲醇完全挥发。为避免玻璃珠损失，应在圆底烧瓶口松松地包裹一层铝箔。</li>
	<li>对于单次实验，将100 mg肽修饰的玻璃珠与60 µL溶胀溶液（如PBS）混合，在25 °C下孵育5分钟。</li>
	<li>使用台式离心机快速离心，使玻璃珠沉淀。</li>
	<li>用移液器吸取上清液，其中含有形成的囊泡。</li>
</ol>
3. 囊泡内RNA适体dBroccoli的转录
<ol>
	<li>使用含有RNase去污染溶液的擦拭纸清洁实验台，以创建无RNase的工作环境。</li>
	<li>将包含T7启动子和dBroccoli序列（GAGACGGTCGGGTCCATCTGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCAGATGTCGAGTAGAGTGTGGGCTC）的ssDNA（5 µM）与非编码链（5 µM）在无核酸酶的水中混合，并加入RNAPol反应缓冲液[40&#8201;mM Tris-HCl (pH = 7.9), 6&#8201;mM MgCl2, 1&#8201;mM 二硫苏糖醇 (DTT) 和 2&#8201;mM 亚精胺]，以制备转录反应所需的DNA模板。</li>
	<li>将上述溶液在90 °C孵育5分钟，随后缓慢降温至20 °C，持续30分钟。</li>
	<li>将1.26 mg DFHBI溶解于5 mL DMSO中，配制1 mM的(5Z)-5-(3,5-二氟-4-羟基苯亚甲基)-2,3-二甲基-3,5-二氢-4H-咪唑-4-酮（DFHBI）溶液。</li>
	<li>通过混合RNAPol反应缓冲液[40&#8201;mM Tris-HCl (pH = 7.9), 6&#8201;mM MgCl2, 1&#8201;mM 二硫苏糖醇 (DTT) 和 2&#8201;mM 亚精胺]、125&#8201;mM KCl、15&#8201;mM MgCl2、4&#8201;mM rNTP、10 µM DFHBI、200&#8201;nM DNA模板、0.5&#8201;U/µL 小鼠RNase抑制剂以及水，配制转录反应体系。</li>
	<li>在反应开始前立即加入4&#8201;U/µL T7聚合酶。</li>
	<li>将此反应混合液作为步骤2.7中的溶胀溶液，并在整个实验过程中于37 °C孵育，通常为1小时。</li>
</ol>
4. 转录-翻译（TX-TL）反应
注意：对于转录-翻译反应，需要粗制细胞提取物、反应缓冲液和DNA。粗制细胞提取物的制备方法如Sun等18所述。进行TX-TL反应时，使用以下组分：33%（v/v）的粗制E. coli提取物、42%（v/v）反应缓冲液，以及25%（v/v）经苯酚-氯仿纯化的DNA和添加剂。最终浓度约为9 mg/mL蛋白质、50&#8201;mM HEPES（pH = 8）、1.5&#8201;mM ATP、1.5 mM GTP、0.9&#8201;mM CTP、0.9 mM UTP、0.2&#8201;mg/mL tRNA、26&#8201;mM辅酶A、0.33&#8201;mM NAD、0.75&#8201;mM cAMP、68&#8201;mM亚叶酸、1&#8201;mM亚精胺、30&#8201;mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、1&#8201;mM DTT、2% PEG-8000、13.3 mM麦芽糖、1 U T7 RNA聚合酶，以及超纯水中的50 nM质粒DNA。
<ol>
	<li>DNA模板的苯酚-氯仿纯化
	<ol>
		<li>准备六份过夜培养物，每份含5 mL LB培养基和5 µL经0.22 µm滤器无菌过滤的羧苄青霉素溶液（100 mg/mL，溶于50%乙醇和50%超纯水中）。</li>
		<li>从预先制备的含有pET20b(+)表达载体的DH5α E. coli 菌种中取少量划线接种至每份预热的5 mL过夜培养液中，于37 °C、250 rpm条件下培养16小时。根据拟表达的肽段（EF）或蛋白（YPet或mVenus），使用相应的编码质粒。</li>
		<li>按照产品说明书或Zhang等24提供的方案，使用质粒小提试剂盒提取质粒。</li>
		<li>取100 µL初步纯化的质粒DNA（浓度范围为200–600 ng/µL），加入100 µL Roti-苯酚/氯仿/异戊醇（pH = 7.5–8.0）于微量离心管中，以利于相分离。</li>
		<li>轻轻倒置混匀最多6次，于室温下以16,000 ×g离心5分钟。</li>
		<li>向管中上层水相加入200 µL氯仿，倒置混匀最多6次。</li>
		<li>于室温下以16,000 ×g离心5分钟。</li>
		<li>将上清液转移至另一新管，加入10 µL 3 M醋酸钠溶液用于乙醇沉淀。</li>
		<li>加入1 mL -80 °C预冷的乙醇，于-80 °C保存1小时。</li>
		<li>于4 °C以16,000 ×g离心15分钟。</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL -20 °C预冷的70%（v/v）乙醇。</li>
		<li>于4 °C以16,000 ×g离心5分钟。</li>
		<li>用移液器小心吸除液体，注意勿扰动DNA沉淀。</li>
		<li>将样品在室温下放置约15分钟，以挥发残留乙醇。</li>
		<li>加入超纯水溶解DNA，调整样品浓度至约300 nM，通过260 nm处吸光度测定浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TX-TL反应体系的准备
	<ol>
		<li>将预先制备的粗细胞提取物和反应缓冲液置于冰上解冻。</li>
		<li>对于60 µL反应体系，先将苯酚-氯仿纯化的质粒DNA加入37.5 µL反应缓冲液[50&#8201;mM HEPES（pH = 8）、1.5&#8201;mM ATP、1.5 mM GTP、0.9&#8201;mM CTP、0.9 mM UTP、0.2&#8201;mg/mL tRNA、26&#8201;mM辅酶A、0.33&#8201;mM NAD、0.75&#8201;mM cAMP、68&#8201;mM亚叶酸、1&#8201;mM亚精胺、30&#8201;mM磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、1&#8201;mM DTT、2% PEG-8000和13.3 mM麦芽糖]中，随后加入28.7 µL粗细胞提取物，最后用超纯水补足至终体积58.8 µL。</li>
		<li>在反应开始前，立即加入1.2 µL T7 RNA聚合酶溶液，并通过上下吹打混匀样品。</li>
		<li>将此反应混合液作为步骤2.7中的溶胀液，于29 °C孵育整个实验过程，通常为4–8小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 通过铜催化叠氮-炔烃胡伊斯根环加成反应将弹性蛋白样多肽与荧光染料偶联
<ol>
	<li>在 DMSO 中配制 20 mM NHS-叠氮化物连接剂（γ-叠氮丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯）溶液。</li>
	<li>将 250 µL ELP 溶液（600 µM）与 PBS（8&#8201;g/L NaCl、0.2&#8201;g/L KCl、1.42&#8201;g/L Na2HPO4、0.27&#8201;g/L K2HPO4，pH = 7.2）和 NHS-叠氮化物（1.2 mM）混合，并在室温下孵育 12 小时。</li>
	<li>将样品加入 10 kDa 透析盒中，置于 1 L 超纯水中于 4 °C 保存 12 小时，以去除盐分和残留的 NHS-叠氮化物。</li>
	<li>将活化的 ELP（500 µM）与炔烃偶联染料（500 µM）Cy5-炔烃或 Cy3-炔烃混合。</li>
	<li>将该样品与 1&#8201;mM TBTA（三（苄基三唑基甲基）胺）、10&#8201;mM TCEP（三（2-羧乙基）膦盐酸盐）和 10&#8201;mM CuSO4 混合，并在 4 °C 孵育 12 小时。</li>
	<li>将样品加入 10 kDa 透析盒中，置于 1 L 超纯水中于 4 °C 保存 12 小时，以去除盐分和残留的炔烃偶联染料。</li>
	<li>这些染料修饰的 ELP 以 Cy3 标记的 ELP 与 Cy5 标记的 ELP 按 1:1 混合使用，类似于第二部分中的肽。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

薄膜水化是制备小单层囊泡的常用方法。实验失败的主要原因是操作过程中对所用材料的处理不当。

最初，ELP 由大肠杆菌（E. coli）细胞表达产生。ELP 纯化后的得率在很大程度上取决于关键步骤中实验操作的严谨程度，这些关键步骤包括逆向温度循环（ITC）以及 ELP 沉淀后的重悬过程。在纯化过程中，我们通过添加磷酸诱导肽链发生疏水塌陷，使溶液 pH 变为酸性，从而导致亲水区段中谷氨酸侧链的质子化。经过此步骤后，在室温下两个区段均呈现疏水性。建议使用其盐形式已存在于溶液中的酸，以保持离子强度恒定，但也可使用盐酸等其他酸。为了提高 ELP 的产率，可额外添加盐以增强共凝聚过程，因为盐能够降低相变温度 Tt，使 ELP 更加疏水。通常使用氯化钠，但 kosmotropic 盐（如硫酸钠）效果更佳，且盐浓度可接近其溶解度极限。此外，使用水浴进行额外加热可进一步提高产率。
<p align="left" clas...

合成生命细胞系统的研究通常从两个不同方向展开。在自上而下的方法中，细菌的基因组被逐步削减至其必需组分，最终形成最小细胞。而在自下而上的方法中，人工细胞则从分子组分或细胞亚系统从头组装，这些组分需要被功能整合为一个协调一致的类细胞系统。
在从头合成方法中，通常使用由磷脂或脂肪酸构成的膜来实现必要生化组分的区室化1,2,3,4。这是因为&#34;现代&#34;细胞膜主要由磷脂组成，而脂肪酸则被认为是前生命时期膜结构的合理候选物质5,6。为了形成新的膜或促进膜的生长，两亲性结构单元必须从外部提供7，或者理想情况下通过膜包被区室内部相应的合成代谢过程在内部生成4,8。
尽管脂质合成是一个相对复杂的代谢过程，但利用无细胞基因表达反应可以较为容易地合成多肽9,10。因此，由两亲性多肽形成的多肽膜作为能够生长的人工细胞模拟体系的包封结构，为脂质膜提供了一种有趣的替代方案11。
两亲性弹性蛋白样二嵌段共聚肽（ELPs）是一类具有吸引力的多肽，可作为此类膜的构建单元12。ELPs的基本氨基酸序列模体为(GaGVP)n，其中“a”可以是除脯氨酸外的任何氨基酸，“n”为模体重复次数13,14,15,16,17。已设计出包含主要以苯丙氨酸为“a”的疏水嵌段和主要由谷氨酸组成的亲水嵌段的ELPs11。根据“a”以及溶液参数（如pH和盐浓度）的不同，ELPs在温度Tt处表现出所谓的逆向温度相变特性，即多肽可逆地从亲水状态转变为疏水状态。这些多肽的合成可利用“TX-TL”细菌细胞提取物在囊泡内便捷地实现11,18,19,20,21，该体系提供了偶联转录与翻译反应所需的全部组分。
利用玻璃珠作为固体载体，通过脱水-再水化法将编码ELP的DNA模板与TX-TL系统共同封装进ELP囊泡中。囊泡的形成是通过从珠体表面重新水化干燥的多肽实现的11。也可采用其他囊泡制备方法22，这些方法可能具有更低的多分散性并产生更大的囊泡（例如电形成法、乳液相转移法或基于微流控的方法）。为验证封装方法的有效性，可选择性地使用荧光原核酸适体dBroccoli23的转录作为检测手段11，该方法相较于利用TX-TL系统进行基因表达更为简单。
由于膜结构单元在囊泡内表达并随后整合到膜中，囊泡开始生长11。可通过FRET实验验证ELP整合入膜的过程。具体而言，用于形成初始囊泡群体的ELP以相等比例共价连接一对可产生FRET效应的荧光染料。当在囊泡内表达未标记的ELP并将其整合入膜后，膜中标记的ELP被稀释，从而导致FRET信号减弱11。铜催化的叠氮-炔烃环加成反应是一种通用且常用的方法，可用于实现上述共价连接。通过使用三（苄基三唑基甲基）胺等稳定配体，该反应可在生理pH的水溶液中进行，且不会导致反应物发生水解11，因此适用于涉及多肽的共轭反应。
以下方案详细描述了基于弹性蛋白样多肽（ELP）的肽囊泡的制备方法。介绍了多肽的表达以及利用玻璃珠法制备囊泡的过程。此外，还阐述了如何在ELP囊泡内部实现荧光原性dBroccoli适体的转录，以及进行转录-翻译反应以表达蛋白质。最后，提供了一种将ELP与荧光染料进行共轭连接的方法，可用于通过FRET实验验证囊泡的生长过程11。

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP生物医学</td><td>3012-032</td><td></td></tr><tr><td>3-磷酸甘油酸（3-PGA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock Gel™ 管</td><td>VWR</td><td>733-2478</td><td></td></tr><tr><td>碱性偶联Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777331</td><td></td></tr><tr><td>碱性偶联Cy5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>777358</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>苯甲脒（Benzamidin）</td><td>Carl Roth</td><td>CN38.2</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>Bradford BSA蛋白检测试剂盒</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>羧苄青霉素（Carbenicillin）</td><td>Carl Roth</td><td>6344.2</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素（Chloramphenicol）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素（Chloramphenicol）</td><td>Carl Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（Chloroform）</td><td>Carl Roth</td><td>4432.1</td><td></td></tr><tr><td>辅酶A（CoA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>P024.1</td><td></td></tr><tr><td>DFHBI</td><td>Lucerna Technologies</td><td>410</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Carl Roth</td><td>A994.1</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（Ethanol）</td><td>Carl Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸（Folinic acid）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠，酸洗</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1277</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（&amp;beta;-异丙基硫代半乳糖苷）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>P017.1</td><td></td></tr><tr><td>K-谷氨酸盐（K-glutamate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>Carl Roth</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶（Lysozyme）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>甲醇（Methanol）</td><td>Carl Roth</td><td>82.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Mg-谷氨酸盐（Mg-glutamate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>微型Bio-Spin层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>NHS-叠氮化物连接剂（y-叠氮丁酸羟基琥珀酰亚胺酯）</td><td>Baseclick</td><td>BCL-033-5</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Carl Roth</td><td>263.2</td><td></td></tr><tr><td>pH试纸</td><td>Carl Roth</td><td>549.2</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl fluoride）</td><td>Carl Roth</td><td>6367.2</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline）</td><td>VWR</td><td>76180-684</td><td></td></tr><tr><td>磷酸（Phosphoric acid）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾溶液（Potassium phosphate dibasic solution）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾溶液（Potassium phosphate monobasic solution）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>RNAPol反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B9012</td><td></td></tr><tr><td>小鼠RNase抑制剂（RNase inhibitor murine）</td><td>NEB</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap擦拭纸</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9788</td><td></td></tr><tr><td>核糖核苷三磷酸混合物（rNTP）</td><td>NEB</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>Roti-苯酚/氯仿/异戊醇混合液</td><td>Carlroth</td><td>A156.1</td><td></td></tr><tr><td>RTS氨基酸样品试剂盒</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer透析盒，10k MWCO（套装）</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（Sodium chloride）</td><td>Carl Roth</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（Sodium hydroxide）</td><td>Carl Roth</td><td>8655.1</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺（Spermidine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤（0.22 &amp;micro;m滤膜）</td><td>Carl Roth</td><td>XH76.1</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶（T7 polymerase）</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>TBTA（三(苄基三唑基甲基)胺）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>TCEP（三(2-羧乙基)膦盐酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱（Tris base）</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA（来自E. coli）</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td></td></tr></tbody></table>

在囊泡内合成肽类膜前体以实现囊泡自主生长

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

生化反应的区室化是合成细胞的核心特征之一。为此，基于肽的反应区室可作为脂质体或脂肪酸囊泡的一种理想替代方案。肽可在囊泡外部或内部轻松表达，并简化膜前体的合成。本文提供了一种利用玻璃珠脱水-再水化法制备直径约200 nm的囊泡的方案，该囊泡基于两亲性弹性蛋白样多肽（ELP）。同时提供了通过逆向温度循环实现细菌中ELP表达与纯化的方案，以及将其与荧光染料进行共价功能化的方案。此外，本报告还描述了一种在ELP囊泡内转录RNA适配体dBroccoli的方案，作为生化反应的简化示例。最后，提供了一种可在囊泡内（in vesiculo）表达荧光蛋白和膜肽的方案，其中后者的合成可导致囊泡生长。

囊泡制备 
图1展示了使用不同溶胀溶液及玻璃珠法制备的囊泡的透射电子显微镜（TEM）图像（另见Vogele等人的研究11）。在图1A的样品中，仅使用PBS作为溶胀溶液，以验证囊泡的形成并测定其尺寸。当使用TX-TL作为溶胀溶液时（图1B），同样形成了囊泡。通过动态光散射（DLS）测量，验证了玻璃珠法对囊泡形成的影响。图2展示了在PBS中未使用玻璃珠制备的EF样品（蓝色）以及使用玻璃珠法并以PBS作为溶胀溶液制备的EF样品（红色）的实测强度自相关曲线。根据累积量拟合25计算出的尺寸显示，未使用玻璃珠法制备的囊泡直径为134 nm，多分散性为25%；而使用玻璃珠时，累积量拟合结果为直径168 nm，多分散性为21%。
<p class="jove_content"...

本文介绍了能够生长的基于多肽的小单层囊泡的制备方案。为促进 在体外 这些囊泡配备了转录-翻译系统和编码该肽的质粒，用于膜肽的合成。

生化反应的区室化是合成细胞的核心特征之一。为此，基于多肽的反应区室可作为……

在本实验方案中，我们利用小玻璃珠对薄膜进行再水化，以形成由肽构成的反应区室。在实验中，我们受益于该方案的简便性和稳健性。该技术的主要优势在于能够容纳甚至敏感性样品，例如所用的粗制细胞提取物。接触有机溶剂会显著影响样品。开始此操作时，使用离心真空浓缩仪将ELP溶液浓缩至1.1毫摩尔。取200微升该浓缩溶液，与1,250微升体积比为2:1的氯仿-甲醇混合液混合。涡旋溶液以充分混匀。接下来，向一个10毫升的圆底烧瓶中加入1.5克球形玻璃珠。将ELP和氯仿-甲醇溶液加入该圆底烧瓶中，轻轻振荡混匀。将烧瓶连接至旋转蒸发仪。调节转速至150 RPM，压力至20,000帕斯卡，持续约四分钟，直至液体在室温下完全蒸发。使用旋转蒸发仪时需格外小心，因为可能存在沸腾滞后现象。此后，用铝箔 loosely 包裹圆底烧瓶的瓶口，以防止玻璃珠丢失，并将烧瓶放入干燥器中至少一小时，确保残留的氯仿和甲醇完全挥发。对于单次实验，将 100 毫克肽包被的玻璃珠与 60 微升溶胀溶液混合。将该样品在 25 摄氏度下孵育五分钟。使用台式离心机快速离心样品，使玻璃珠沉淀。然后用移液器收集含有囊泡的上清液。首先，在微量离心管中将100 µL预纯化的质粒DNA与100 µL Roti-Phenol、氯仿或异戊醇中的一种混合，以促进更好的相分离。轻轻倒置离心管最多六次，在16,000 × g、室温条件下离心5分钟。然后向水相中加入200 µL氯仿，再次轻轻倒置离心管最多六次。在16,000 × g、室温条件下离心5分钟。此后，将上清液移至另一离心管中，并加入 10 微升 3 摩尔的醋酸钠以进行乙醇沉淀。加入 1 毫升 80 摄氏度的冷乙醇，并将样品在 80 摄氏度下保存 1 小时。接着，在 16,000 ×g 及 4 摄氏度条件下离心样品 15 分钟。将上清液小心倒出，加入1 mL预冷至20摄氏度的70%乙醇。在16,000 ×g、4摄氏度条件下离心5分钟。随后用移液器吸除液体，注意不要扰动DNA沉淀。将样品在室温下放置约15分钟，以挥发残留的乙醇。随后，向样品中加入超纯水，将样品浓度调整至约300纳摩尔，该浓度通过260纳米处的吸光度测定确定。为准备转录-翻译反应，请将预先制备的粗细胞提取物和反应缓冲液置于冰上。对于60微升的反应体系，将血浆DNA加入37.5微升反应缓冲液中，再加入28.7微升粗细胞提取物，并用超纯水补至终体积58.8微升。在反应开始前，加入1.2微升T7 RNA聚合酶溶液，并用移液器吹打混匀。将样品与膨胀溶液在29摄氏度下孵育，孵育时间通常为4至8小时。囊泡的透射电子显微镜图像显示，多种溶胀溶液（如 TX/TL 或仅使用 PBS）均可用于形成囊泡。对于这两种溶液，尺寸测定均为一个直接的步骤。动态光散射结果显示，未采用玻璃珠法制备的囊泡直径为 134 纳米，多分散系数为 25%；当使用玻璃珠时，囊泡直径为 168 纳米，多分散系数为 21%。随后使用荧光酶标仪测定在 ELP 颗粒内部表达的两种荧光蛋白的荧光强度。需要注意的是，囊泡形成后，囊泡内部内容物与外部溶液相同，因此需向外部溶液中添加抗生素卡那霉素（Kanamycin），以抑制蛋白质表达。作为对照，卡那霉素也被加入到膨胀溶液中，此时囊泡内部的蛋白质表达受到抑制。这表明卡那霉素无法穿过膜结构，并能持续、始终抑制内部蛋白质的表达。然后进行FRET检测，以证明ELP被整合到膜中。在膜ELP表达后，额外的肽段会插入膜内，从而增加FRET对之间的平均距离，导致供体信号增强。该技术可用于制备简单的反应容器，或构建具有肽基膜的人工细胞。可根据需要选择内部内容。通过使用这些肽囊泡，我们现在可以期待在其内部进行更复杂的合成反应。

in-vesiculo-synthesis-peptide-membrane-precursors-for-autonomous

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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