在肽膜前体的维西图洛合成中,用于自主囊泡生长

这里介绍了创建能够生长的基于肽的小型单片杆菌囊泡的协议。为了便于膜肽的囊泡生产,这些囊泡配备了转录翻译系统和肽编码质粒。

在我们的协议中，我们使用小玻璃珠的薄膜再水化，形成由肽构成的反应室。在实验中，我们受益于协议的简单性和鲁棒性。这种技术的主要优点是能够吸收甚至敏感的样品，如使用的粗细胞提取物。

与有机溶剂的接触会显著影响样品。要开始此过程，请使用离心真空浓缩器将 ELP 溶液浓缩至 1.1 毫摩尔。将这种浓缩溶液的200微升与2至1个氯仿和甲醇混合物的1，250微升混合。

漩涡溶液彻底混合。接下来，在十毫升圆形底部烧瓶中加入1.5克球形玻璃珠。将 ELP 和氯仿甲醇溶液加入圆形底部烧瓶中，轻轻摇动以混合。

将烧瓶连接到旋转蒸发器。将转速调整至 150 RPM，将压力调节至 20，000 帕斯卡约 4 分钟，直到液体在室温下蒸发。由于可能导致沸腾延迟，使用旋转蒸发器时必须小心。

在此之后，松散地包裹铝箔围绕圆底烧瓶的开口，以防止玻璃珠的损失，并放入干燥器至少一个小时的烧瓶，以确保剩余的氯仿和甲醇蒸发。对于单个实验，将 100 毫克肽覆盖的玻璃珠与 60 微升的膨胀溶液混合。在25摄氏度下孵育该样品5分钟。

使用桌面离心机快速离心样品并沉淀玻璃珠。然后使用移液器收集上流水，其中含有囊泡。首先，将预纯质粒DNA的100微升与100微升的罗提-苯酚、氯仿或异氨醇混合在微离心管中，以便更好地进行相分离。

轻轻反转管长达六次，在16，000倍g下离心，室温为5分钟。然后，在上相中加入200微升氯仿，并反转管子多达6次。将样品在16，000倍g下离心，室温为5分钟。

在此之后，将上流液器移液到单独的管中，加入10微升的三摩尔醋酸钠进行乙醇沉淀。在80摄氏度下加入一毫升冷乙醇，在80摄氏度储存样品一小时。接下来，将样品在16，000倍g和4摄氏度下离心15分钟。

去清液，在20摄氏度下加入一毫升冷70%乙醇。在16，000倍的g和4摄氏度的离心机5分钟。然后，通过移液去除液体，小心不要干扰DNA颗粒。

将样品在室温下储存约15分钟，以蒸发剩余的乙醇。在此之后，在样品中加入超纯水，将样品浓度调整为约300纳米摩尔，以260纳米的吸收为单位进行测量。要准备转录-翻译反应，请遵循准备好的粗细胞提取和冰上反应缓冲液。

对于60微升反应混合物，将血浆DNA加入反应缓冲液的37.5微升，加入28.7微升的粗细胞提取物，在58.8微升的最终体积中加入超纯水。在反应开始前，加入1.2微升的T7RNA聚合酶溶液，上下移液器混合。在实验期间，在29摄氏度下孵育样品和膨胀溶液，通常为4至8小时。

囊泡的透射电子显微镜图像显示，各种膨胀溶液，如TX/TL，甚至只有PBS可用于形成囊泡。对于这两种解决方案，尺寸确定是一个直截了当的步骤。动态光散射表明，没有玻璃珠法的囊泡直径为134纳米，使用玻璃珠时多散度为25%，直径为168纳米，多散度为21%， 两种荧光蛋白的荧光强度在ELP囊内表达，然后用荧光板读取器进行测量。

需要注意的是，囊泡形成后，囊泡的含量和外侧溶液是相同的，因此，抗生素卡纳霉素被添加到外部溶液中，以抑制蛋白质表达。作为一种控制，卡那霉素也添加到肿胀溶液中，在这种情况下，囊泡内的蛋白质表达被抑制。这表明卡那霉素不会通过膜扩散，并且一直抑制内部表达。

然后进行F FRET测定，以证明ELP融入膜。在膜 ELP 的表达中，额外的肽融入膜中，这增加了 FRET 对之间的平均距离，从而导致供体信号的增加。提出的技术可用于产生简单的反应容器或制造具有肽基膜的人造细胞。

可根据需要选择内部内容。通过使用这些肽囊泡，我们现在可以期待其中更复杂的合成反应。